O transplante de válvula pulmonar Usando um modelo do rato de Heterotópica Transplante de Coração

Resumo

De modo a compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes neotissue formação e desenvolvimento de estenose em válvulas cardíacas de engenharia de tecidos, foi desenvolvido um modelo murino de transplante heterotópico de válvula cardíaca. A válvula cardíaca pulmonar foi transplantado para destinatário usando o coração técnica de transplante heterotópico.

Resumo

Engenharia de tecidos de válvulas cardíacas, válvulas especialmente descelularizados, estão começando a ganhar impulso no uso clínico de cirurgia reconstrutiva com resultados mistos. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento neotissue, espessamento da válvula, e o desenvolvimento de estenose não são pesquisadas extensivamente. Para responder às perguntas acima, foi desenvolvido um modelo de transplante heterotópico murino coração válvula. A válvula cardíaca foi colhida a partir de um camundongo doador válvula e transplantadas para um doador de rato coração. O coração com uma nova válvula foi transplantado heterotopicamente a um rato destinatário. O coração transplantado mostrou o seu próprio batimento cardíaco, independente de batimentos cardíacos do destinatário. O fluxo de sangue foi quantificado usando um sistema de ultra-som de alta freqüência com Doppler pulsátil. O fluxo através da válvula pulmonar implantado mostrou a frente de fluxo com refluxo mínimo e pico de fluxo foi próximo a 100 mm / seg. Este modelo murino de transplante de válvula cardíaca é highly versátil, de modo que pode ser modificada e adaptada para fornecer diferentes ambientes hemodinâmicas e / ou pode ser usado com vários ratinhos transgénicos para estudar o desenvolvimento neotissue em uma válvula cardíaca de engenharia de tecidos.

Introdução

Defeitos cardiovasculares congênitos são uma das principais causas de mortalidade infantil no mundo ^1,2 ocidental. Entre eles, a estenose da válvula pulmonar e os defeitos da válvula aórtica bicúspide são uma forma que ocorre com freqüência ^3. Cirurgia de substituição da válvula cardíaca é uma escolha rotina de cirurgias reconstrutivas; no entanto, complicações, incluindo estenose e calcificação da válvula cardíaca, ea dependência ao longo da vida em anticoagulantes são uma fonte significativa de problemas de saúde crônica e morte ^4-7. Além disso, a falta de potencial crescimento requer cirurgias de revisão, que aumenta ainda mais a mortalidade dos pacientes jovens ^4,8,9.

Numa tentativa para desenvolver uma válvula cardíaca de substituição funcional com um potencial de crescimento, Shinoka et al. Células autólogas semeadas em uma válvula cardíaca sintética biodegradável ^8. A válvula sintético transformado em uma válvula cardíaca nativa como a estrutura com potenciômetro crescimentoai. Preliminares grandes estudos com animais demonstraram a viabilidade da utilização desta metodologia para criar uma válvula cardíaca funcional ^10. No entanto, estudos de implantação de longo prazo demonstraram pouca durabilidade devido ao espessamento progressivo da válvula neotissue resultando em estreitamento da válvula cardíaca. Trabalhe a partir de Sodian et al. Utilizada a metodologia Shinoka, mas finalmente substituiu a matriz PGA com um elastômero biodegradável, que deu as propriedades biomecânicas da válvula de engenharia de tecidos construir um perfil mais fisiológico ^9,11,12. No estudo in vivo, apesar do sucesso da implantação, um revestimento de células endoteliais confluentes não foi formado, o que poderia limitar o sucesso a longo prazo deste andaime ^12.

A fim de projetar racionalmente uma válvula cardíaca sintético de segunda geração melhorada, um modelo murino de transplante de válvula cardíaca foi criado para investigar os mecanismos celulares e moleculares underlyinformação g neotissue, espessamento da válvula, e o desenvolvimento de estenose. Modelos murinos oferecem uma vasta gama de reagentes moleculares, incluindo transgénicos, que não estão facilmente disponíveis em outras espécies ^7. Neste modelo de transplante de coração válvula, um vivo substituição da válvula cardíaca pulmonar ex singênico foi realizada pela primeira vez; e, em seguida, o coração, com a válvula de coração implantado foi implantado heterotopicamente no hospedeiro singeneico usando uma técnica de microcirurgia. Este modelo permite a substituição da válvula do coração sem a necessidade de circulação extracorpórea.

Neste trabalho, uma explicação detalhada de uma colheita de válvula cardíaca, preparações de coração doador, o transplante de válvula cardíaca e transplante cardíaco heterotópico é descrito. Os resultados mostraram uma pulsação contínua a partir do coração do doador, que era independente do batimento cardíaco destinatário. O fluxo de sangue através da válvula pulmonar implantado foi medida usando um sistema de ultra-som de alta freqüência com uma onda pulsada Fazerppler.

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Protocolo

Nota: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Hospital Animal Care e Use do Nationwide Children.

1. Pulmonar Válvula Cardíaca Colheita de um doador de válvula do coração mouse

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia: 1x tesoura fina, micro fórceps 3x, pinças vasculares micro 2x, braçadeira 1x fórceps de aplicação, suporte da agulha micro 1x, tesoura primavera 1x, 1x afastador.
2. Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de rato é usado como um doador de válvula cardíaca pulmonar. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, em seguida, a eutanásia com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 200 mg / kg e xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosagem.
3. Clipe da área do peito e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Em seguida, fazer a toracotomia. Expor o coração, fazer um pequeno corte no átrio direito, e aspergir o ventrículo esquerdo com gelo salina fria.
4. Sem rodeios dissecção da artéria pulmonar (AP) a partir da ascensão de umorta. Cortar a válvula pulmonar (PV), juntamente com dois milímetros punho da artéria pulmonar. Elimine o resto do coração.
5. Armazenar o PV em heparina frio e solução salina (100 unidades / ml). Nota: O PV pode ser mantido na solução durante duas horas antes do transplante para o coração de dador.

2. Preparação coração doador

1. Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de rato é usado como um doador de coração. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, em seguida, a eutanásia com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 200 mg / kg e xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosagem. Este é um procedimento terminal.
2. Clipe da área do peito e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Em seguida, fazer a toracotomia. Sem rodeios separar o coração, veia cava inferior (VCI), veia cava superior (VCS), aorta ascendente, PA, e veia pulmonar. Perfundir da VCI com gelo frio salina estéril.
3. Ligadura da VCI, SVC, e veia pulmonar com seda 6-0 sutura em seguida, corte superior aoligaduras.
4. Corte a aorta e PA com 2 milímetros punho.
5. Recorte o PV e descartá-la.

3. Válvula de Transplante de Coração em um coração do doador

1. Imediatamente após o passo 2.5, coloque a válvula cardíaca a partir do passo 1.5 para o coração do doador e orientar a válvula cardíaca.
2. Fixe o PV com um ponto no lado direito da válvula usando 10-0 suturas monofilamento em agulhas cônicos e começar a sutura contínua com 5-6 stiches do outro lado do PV.
3. Depois de terminar o lado da frente, girar o coração na horizontal e começa a suturar o lado de trás do PV para o coração de dador.
4. Armazenar o coração em solução de heparina / solução salina estéril fria. Nota: O coração do dador podem ser mantidas na solução durante duas horas antes da implantação até o rato destinatário.

4. Heterotópico Transplante de Coração para um destinatário Rato

1. Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de ratinho foi utilizado como um recipient. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, depois anestesiados com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 100 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg). O cetoprofeno (5 mg / kg) é utilizado como pré-anestésica analgésico.
2. Depois de verificar o nível de sedação pela cauda beliscar, prenda o cabelo abdominal e torácica. Lubrifique os olhos com pomada oftálmica estéril, e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Desinfetar o abdômen com Betadine e álcool pads. Em seguida, cubra o mouse com um campo estéril e expor apenas a área da incisão.
3. Faça uma laparotomia mediana incisão abaixo do xifóide até a região suprapúbica, e inserir um afastador auto de retenção. Enrole os intestinos em salina umedecido gaze. Sem rodeios definir a aorta infra-renal e veia cava.
4. Coloque duas suturas de seda 6-0 proximal e distal ao redor da aorta e veia cava inferior para conter a circulação sanguínea.
5. Coloque o coração do doador, no lado direito da aorta abdominal e cobri-lo com gau estérilze. Hidrate-lo com soro fisiológico.
6. Realizar uma Aortotomia na aorta abdominal com uma agulha G 30, e estender a abertura com uma tesoura para o tamanho da aorta do doador.
7. Realizar um fim-de lado anastomose usando estéreis suturas 10-0 monofilamento as agulhas cônicos. Fixar a aorta do dador com um ponto na extremidade proximal da abertura na aorta abdominal e iniciar a sutura contínua com 4-5 stiches a partir da extremidade distal da aorta abdominal.
8. Virar o coração para o lado esquerdo, cobri-lo com uma solução salina infundida gaze, e iniciar a sutura contínua com 4-5 stiches a partir da extremidade distal da aorta abdominal.
9. Fazer uma venotomia na VCI usando uma agulha G 30 e estender a abertura para o tamanho da artéria pulmonar do dador.
10. Realizar um fim a anastomose lado usando estéreis suturas 10-0 monofilamento as agulhas cônicos. Fixar o doador PA com um ponto na extremidade proximal da abertura na VCI e iniciar a sutura contínua com 4-5 de stichesa extremidade distal da veia cava inferior. Desta vez, por causa da aorta é na forma, certifique-se de sutura da parede esquerda da PA do dador está no interior da veia cava inferior.
11. Lave o lúmen da VCI com heparina e solução salina (100 unidades / ml). Fechar a parede direita do doador e do receptor PA IVC suturando-os continuamente para a extremidade distal.
12. Remover a ligadura distal e controlar a hemorragia através da aplicação de um agente hemostático estéril absorvível tópica. Quando a hemorragia parar completamente, retirar a sutura proximal e controlar a hemorragia da mesma maneira.
13. Retorne os intestinos e fechar a musculatura abdominal e pele em duas camadas usando uma sutura de monofilamento 6-0 poliamida preto.
14. Injetar 0,5 ml por via subcutânea de solução salina e coloque o rato em uma gaiola de recuperação em um bloco de aquecimento até que o mouse é totalmente móvel. Após a recuperação, o retorno do mouse para uma nova gaiola com roupa de cama de papel. Dar medicação para dor (Ibuprofeno, 30 mg / kg, a água potável) para 48 horas. Fazernão devolver um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.

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Resultados

A figura 1 ilustra o esquema do modelo de transplante de válvula cardíaca utilizando transplante cardíaco heterotópico. A válvula cardíaca foi colhida a partir de um doador e implantado em um coração de um segundo rato doador. Em seguida, o coração com a nova válvula cardíaca foi implantado no abdómen de um rato receptor. Figura 2 mostra uma ilustração do coração implantado no espaço abdominal (A), logo após o transplante de coração (B),

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Discussão

A taxa de mortalidade do presente processo é de cerca de 20%, que foi principalmente causada por hemorragia no local da transplante de PV e anastomose sobre a aorta do doador para a aorta abdominal do destinatário. Na maioria dos casos, a taxa de mortalidade diminui significativamente 48 horas pós cirurgia. Os ratos de sobrevivência mostraram fortes batimentos cardíacos e do fluxo de sangue através do PV implantado. Todo o processo leva quatro horas para um cirurgião experiente micro. Levará cerca de 250 ratos p...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14190-144
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Sientific	23-400-118
Fine Scissor	FST	14028-10
Micro-Adson Forcep	FST	11018-12
Clamp Applying Forcep	FST	00072-14
S&T Vascular Clamp	FST	00396-01
Spring Scissors	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - Fine Forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 Forceps	FST	11251-35
Tish Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non Woven Sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1 1/2 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in., Needle	BD	305125
30 G 1 in., Needle	BD	305106
Warm Water Recircultor	Gaymar	TP-700
Warming Pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500
VEVO2100 High Frequency Ultrasound	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives.
Ultrasound transmission gel	Parker Laboratories, INC.	01-02
Table Top Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip, INC.	901806
Isoflurane	Baxter	1001936060