Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

Resumo

Um vórtice microfluídico plataforma eletroporação assistida foi desenvolvido para entrega seqüencial de múltiplas moléculas em populações de células idênticas, com controle de dosagem precisa e independente. Tamanho com base etapa de purificação de células alvo eletroporação anterior do sistema auxiliado para aumentar a eficiência de entrega molecular e viabilidade celular processado.

Resumo

A electroporação tem recebido crescente atenção nos últimos anos, porque é uma técnica muito potente para a introdução de sondas moleculares exógenas fisicamente não permeantes em células. Este trabalho apresenta uma plataforma microfluídica eletroporação capaz de realizar múltiplas entrega molécula para células de mamíferos com controle de parâmetro preciso e molecular dependente. A capacidade do sistema para isolar células com distribuição de tamanho uniforme permite menos variação na eficiência eletroporação per dada intensidade do campo elétrico; por conseguinte, melhorada a viabilidade da amostra. Além disso, o recurso de visualização do processo permite a observação do processo molecular fluorescente captação em tempo real, que permite ajustes de parâmetros entrega moleculares rápidas in situ para aumento de eficiência. Para mostrar as vastas capacidades da plataforma relatado, macromoléculas com diferentes tamanhos e cargas elétricas (por exemplo, dextrano com MW de 3.000 e 70.000 Da) foramentregues para as células do câncer de mama metastático com alta eficiência de entrega (> 70%) para todas as moléculas testadas. A plataforma desenvolvida provou o seu potencial para uso na expansão de campos de pesquisa onde on-chip técnicas de eletroporação pode ser benéfico.

Introdução

Nos últimos anos, a utilização de impulsos eléctricos para facilitar a entrega de moléculas extracelulares citosólica tornou-se um meio atractivo de manipulação de células de mamífero. ^Uma Este processo, também conhecido como electroporação, reversivelmente, permeabiliza a membrana celular, permitindo que as moléculas de membrana inerentemente impermeáveis ​​para aceder ao meio intracelular das células. Como virtualmente qualquer molécula pode ser introduzida no citossol através de poros criados temporárias na membrana de qualquer tipo de células, utilizando a electroporação, a técnica tem sido relatada como sendo mais reprodutível, de aplicação universal, e mais eficiente do que outros métodos, incluindo mediada por vírus, química e abordagens ópticos ^2-3. Esta técnica tem sido utilizada para introduzir moléculas fluorescentes, ⁴ drogas ⁵ e ácidos nucleicos de ^6-7, mantendo as células viáveis ​​e intacta. Dadas essas vantagens, eletroporação foi adotado como um trabalho comumtória técnica para a transfecção de ADN, a terapia de genes in vivo e ⁸ estudos de vacinação celular. É, no entanto, continua a ser difícil para os sistemas convencionais de electroporação para conseguir simultaneamente a eficiência prática e viabilidade para as amostras com grande heterogeneidade no tamanho, porque a intensidade do campo eléctrico necessário para electroporação bem sucedida se correlaciona intimamente com o diâmetro da célula. Além disso, esses sistemas não permitem um controle preciso das quantidades moleculares múltiplas sendo entregues devido à dependência do processo de entrega molecular estocástico granel. ⁹ A fim de abordar estas questões, muitos grupos desenvolveram plataformas eletroporação microfluídicos, oferecendo a vantagem de tensões formadores de poros menores, melhor eficiência de transfecção, uma grande redução na mortalidade celular e capacidade de oferecer várias moléculas. foram possíveis devido às pequenas pegadas de sistemas de eletroporação em microescala cujo eletrodo passo ^10-13 Estas vantagenscomprimentos são sub-milímetros, diminuindo drasticamente as tensões necessárias para entrega bem sucedida. Além disso, esses sistemas de eletroporação em microescala pode alcançar distribuição de campo elétrico uniforme e rapidamente dissipa o calor gerado, produzindo mortalidade celular reduzida, reforçando simultaneamente a eficiência de entrega. A utilização de materiais transparentes para estas micropastilhas permite ainda na observação in situ do processo de modificações dos parâmetros de electroporação rápidas. ^2,12 Contudo, o controlo de dosagem precisa e controlo do parâmetro molecular-celular e dependente, necessária para a pesquisa e aplicações terapêuticas, ^{6 emergente, 14-16} continuam por resolver.

Este trabalho apresenta um sistema de eletroporação microfluídica assistida por vórtice, capaz de oferecer múltiplas moléculas sequencialmente em uma população idêntica pré-selecionado de células-alvo. As células com a distribuição de tamanho uniforme são isolados antes de electroporação utilizando si previamente relatadomecanismo de ze-seletiva trapping. ^17-18 Por ter uma distribuição uniforme tamanho, menor variação na eficiência eletroporação e maior viabilidade por determinado intensidade do campo elétrico foram atingidos. ¹⁹ Além disso, continuamente agitando células presos usando vórtices microescala permitido para entrega uniforme de moléculas através da citosol inteiro, de acordo com os resultados relatados anteriormente usando uma outra plataforma electroporação assistida por vórtice. ²⁰ Para demonstrar que este sistema pode ser aplicado a uma ampla gama de moléculas comumente utilizados em aplicações biológicas, macromoléculas com uma ampla gama de pesos moleculares foram entregues aos células de câncer de mama metastático. Além disso, com a ajuda de monitoramento de processos em tempo real, este trabalho fornece mais evidências para pôr fim ao debate de longa data sobre o mecanismo de entrega molecular durante electrporation, sendo predominantemente eletroforese mediada versus ¹⁴ mediada por difusão. Ao contrário de outros sistemas de electroporação, esta plataforma fornece exclusivamente as vantagens combinadas de precisão de entrega multi-molécula, de alta eficiência de entrega molecular, a mortalidade celular mínimo, um período largo de tamanho e taxas de moléculas entregues, bem como a visualização em tempo real da electroporação processo. Dadas estas capacidades, o sistema de eletroporação desenvolvido tem potencial prático como uma ferramenta versátil para estudos de reprogramação celular, aplicativos de entrega de drogas ^{6,14,21-22 10,19} e aplicações que requerem para a compreensão em profundidade dos mecanismos moleculares de entrega eletroporação.

Protocolo

1. celular Preparação

1. Placa 1 × 10 ⁵ células / ml de linha celular de cancro da mama metastático MDA-MB-231 em um volume de 10 ml por frasco de cultura T75 tecido em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e 1 % de penicilina-estreptomicina.
2. Incubar MDA-MB-231 numa incubadora humidificada a 37 ° C, com 0% de CO ₂ ambiente.
3. Células colheita para experiências 2 dias após a sementeira por tratamento de células com 0,25% de tripsina-EDTA durante 2 min e inactivar a actividade enzimática da tripsina por adição de 8 mL de meio de crescimento.
4. Células de pelotas por centrifugação durante 5 min a 200 x g e ressuspender em tampão fosfato salino de Dulbecco (DPBS, 1x, sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} para uma concentração final de 5 x 10 ⁵ células / ml.

2 Dispositivo de projeto e fabricação

NOTA: A máscara, fabricações molde mestre eoprocesso de inclusão de microcanais devem ser conduzidas dentro de uma sala limpa, enquanto o polidimetilsiloxano (PDMS) processo de fundição de microcanais pode ser realizada em uma bancada de laboratório regular.

1. Conceber um dispositivo de microfluidos, tal como ilustrado na Figura 1 com o AutoCAD. O dispositivo deverá ser composto por uma entrada com múltiplos orifícios de injecção, e dois filtros grossos inerciais concentrando canais rectangulares rectas paralelas (L = 7 mm, W = 40 pm, e H = 70 mm). Canal linear individual consiste de 5 secções de electroporação, os quais são colocados 800 um aparte (W _C = 400 um), com dois furos através de eléctrodos de alumínio. Duas câmaras de eletroporação transversalmente adjacentes compartilhar o buraco para o eletrodo negativo. Dois canais rectos fundir a uma tomada no jusante da região de electroporação.
2. Converter o arquivo CAD com micro-padrões para um arquivo GDSII usando LinkCAD. Escreva os micro-padrões em um 5 "x 5" photomask em brancousando um gravador de revestimento de laser. Desenvolver a máscara, seguindo o protocolo do fabricante. NOTA: O processo de desenvolvimento máscara inclui o desenvolvimento photoresist, cromo corrosão e resistem à remoção. Alternativamente, as micro-padrões impressos sobre uma transparência elevada resolução (> 20.000 dpi) pode ser adquirido a partir de um terceiro fabricante e utilizado como um foto-mascara. Microescala características finais de uma fotomáscara deve ser transparente para coincidir com a polaridade negativa de uma foto-resistente.
3. Fabricar o molde de fundição de concepção do dispositivo, utilizando técnicas de litografia suave padrão ²³ com um revestimento foto-resistente negativo fiado sobre uma bolacha de silício de 4 polegadas a 2.000 rpm para ter a espessura final de 70 mM.
4. Prebake a bolacha com fotorresistente negativo durante 20 min a 95 ° C.
5. Em contato com a máscara com a bolacha e expor a uma fonte de UV (17,4 mJ / cm ²⁾ durante 80 segundos usando um alinhador de máscara.
6. Desenvolver a bolacha exposta durante 4 minutos num revelador SU-8.
7. Medir oespessura photoresist desenvolvido utilizando um perfilômetro de superfície.
8. Rigorosamente misturar uma proporção de 10: 1 de elastômero para agente (kit elastômero de silicone) cura e despeje a mistura no molde de fundição para gerar réplicas de PDMS. Desgasificar o elastómero de fundição, durante 30 min e curar o molde de fundição com elastómero desgasificada num forno a 70 ° C durante 2 horas.
9. Delaminate curado réplica PDMS com padrões de microcanais dos orifícios do molde e perfurados para entradas, saída e eletrodos inserções utilizando um torno pinos. NOTA: O diâmetro normal de ponta da viseira pino deve ser 0,76 milímetros, adequada para segurando firmemente tubagem de PEEK (OD de 1/32 ") e os eléctrodos de alumínio (OD de 0,029") no lugar.
10. Criar fechados canais microfluídicos por ligação PDMS réplicas para uma lâmina de vidro tratado em um limpador de plasma de oxigênio para 7 segundos a uma potência e pressão parcial de oxigênio de freqüência de rádio de 75 W e 500 mTorr, respectivamente.

3. experimentos em fluxo

1. Inserireléctrodos de alumínio (0,029 "OD) e um tubo de saída de PEEK (1/32" OD) em locais designados via furos nos microcanais (ver Figura 3B).
2. Conecte o equipamento eléctrico ¹⁸ responsáveis ​​pela geração de alta tensão pulsos de onda quadrada curto para os eletrodos de alumínio (ver Figura 3C), que estão em contato com soluções de fluxo no molde PDMS. NOTA: O equipamento deve ser constituído por um gerador de pulso e um amplificador de alta tensão em-casa construída ^18.
3. Preparar 50 ml de quatro tubos de centrífuga contendo individualmente DPBS, soluções com as células e biomoléculas, e atribuem cada tubo para o seu respectivo suporte de frasco ligado ao sistema de controlo de fluxo pneumático (ver Figura 3A) ^18.
4. Conecte tubulação PEEK entrada dos detentores dos frascos nos respectivos orifícios de entrada no dispositivo micro.
5. Definir a magnitude dos impulsos de onda quadrada, V, 100 V, a fim de ter o fie eléctricoforça ld, E = V / L _e, do outro lado da câmara de electroporação ser equivalente a 0,7 kV / cm. NOTA: Aqui, L _e é a distância entre dois pontos em que os eléctrodos positivo e negativo se encontram em contacto com a solução de fluxo (ver Figura 1).
6. Ajuste o regulador de pressão para 40 psi. NOTA:. Uma única fonte de azoto manualmente ajustável é usado para pressurizar uniformemente todos os frascos de amostra e de um colector de alta velocidade é utilizada para activar portas oportuna solução individuais usando o software LabVIEW construído sob encomenda ¹⁸
7. Para o controle de válvula, abra o software LabVIEW custom-built rotulado Válvula Runner e clique em Executar no menu suspenso o direito operar.
8. Ligue válvulas, clicando no ícone de cada válvula correspondente. Nota: O ícone da válvula deve ficar verde quando é ativado. Clicando no ícone ativo irá desativar e fechar a válvula. O ícone da válvula fechada deve virar cinza.
9. Abrir a válvula para o reservatório de DPBS (ie., solução de lavagem) para preparar a velocidade do fluxo necessário para a geração de vórtice de células-trapping estável por 1,5 min.
10. Alternar a porta solução activa a partir da solução de lavagem para a solução de células para células de armadilha na câmara de electroporação de 30 segundos (ou seja, o passo de captura de células).
11. Fluxo de ambas as soluções de lavagem e de célula através do dispositivo ao mesmo tempo durante 10 segundos, antes da etapa de captura de célula para garantir um fluxo ininterrupto durante a etapa de comutação de solução. NOTA: Este breve passo co-fluxo deve ser repetido a cada passo de mudança de solução.
12. Ligue o porto de lavar e limpar o aparelho durante 20 segundos, a fim de remover as células contaminantes não aprisionadas.
13. Injectar a solução que contém a primeira molécula de interesse (0,2 mg / ml de moléculas de dextrano 3000 Da neutro e aniónico ou 1,5 mg / ml de dextrano 70.000 Da molécula neutra) para o dispositivo.
14. Aplicar cinco pulsos curtos (AT = 30 ms com intervalos de 2 seg) imediatamente após a injeção dosolução molecular e monitorar a magnitude e duração dos pulsos elétricos aplicados em tempo real usando um osciloscópio.
15. Repetir o passo 3.10 tantas vezes quanto o número de moléculas adicionais a serem entregues. Para cada entrega molecular, as células incubar durante 100 s na solução molecular, em seguida, o dispositivo de descarga com a solução de lavagem de 100 s para remover o excesso de moléculas.
16. Libertar as células em uma placa de 96 poços para análise a jusante através da diminuição da pressão de operação inferior a 5 psi. NOTA: Cerca de 100 ml de solução com 100 células são coletadas de cada lançamento.
17. Execute o experimental passos 3.9 através de 3.16 três vezes para coletar células suficientes para citometria de fluxo.
18. Centrifuga-se a placa de 96 poços contendo células transformadas por 5 min a 228 x g.
19. Retirar o sobrenadante que contém o excesso de moléculas fluorescentes.
20. Ressuspender as células em DPBS para análise de citometria de fluxo.
21. As células de carga no citômetro de fluxo para u molecularptake análise de eficiência.

Resultados

O electroporator microfluídica paralelo desenvolvido entregues macromoléculas com tamanhos variados e cargas elétricas em células de câncer de mama metastático vivo. Entrega bem sucedida molecular foi qualitativamente determinado monitorizando alterações na intensidade de fluorescência de células electroporadas em órbita in situ e confirmado por medidas quantitativas por meio de análise de citometria de fluxo. Figura 4A mostra que 90% das células tratadas com a absorção de 70.000...

Discussão

Com a nova plataforma eletroporação paralelizado, o aumento de 10 vezes na produtividade e eficiência da prestação de multi-molécula foi alcançado, além de todas as vantagens que o sistema de câmara única previamente desenvolvido proporciona. ¹⁸ méritos Anteriormente disponíveis incluem: (i) pré-purificação de as células alvo e com distribuição uniforme de tamanho de reforço viabilidade, (ii) o controlo de dosagem molecular preciso e individual, e (iii) a partir de corrente eléctrica opera...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 cancer cell line	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner	Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
Compressed Nitrogen gas	Airgas	NI 300
High Pressure Regulator	McMaster-Carr	6162K22
Downstream regulator	McMaster-Carr	4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifold	Festo
Inline Check Valve	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings	Festo	P1533
1/32" PEEK tubings	Idex Health and Science	P1569
PEEK tubing unions	Idex Health and Science	P881
Pulse Generator	HP	8110A
Aluminum Wire	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oscilloscope	Agilent	DSO3062A
50 ml centrifuge tubes	VWR	21008-178
15 ml centrifuge tube	VWR	21008-216
T75 culture flask	VWR	82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic	Gibco, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329