RNA Catalisador como repórter para Triagem Drogas contra edição de RNA em Tripanossomas

Resumo

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Resumo

Um progresso substancial foi feito para determinar o mecanismo de edição de RNA mitocondrial em tripanossomas. Da mesma forma, um progresso considerável foi feito na identificação dos componentes do complexo editosome que catalisam edição RNA. No entanto, ainda não está claro como as proteínas funcionam juntos. Os compostos químicos obtidos a partir de uma tela de alto rendimento contra o editosome pode bloquear ou afectar um ou mais passos no ciclo de edição. Portanto, a identificação de novos compostos químicos que geram sondas moleculares valiosos para dissecar a função editosome e montagem. Em estudos anteriores, os ensaios in vitro de edição foram realizadas utilizando ARN marcado com rádio. Estes ensaios são demorados, ineficiente e inadequado para fins de alto rendimento. Aqui, um baseado em fluorescência homogênea "misturar e medir" ensaio repórter martelo ribozyme in vitro para monitorar a edição de RNA, é apresentado. Apenas como conseqüência da edição de RNAa ribozima uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) do substrato oligoribonucleotide sofre clivagem. Isto por sua vez resulta na separação do fluoróforo do extintor, produzindo assim um sinal. Em contraste, quando a função editosome é inibida, o sinal de fluorescência será extinta. Este é um método altamente sensível e simples, que devem ser aplicadas para controlar a edição de ARN in vitro ou elevado rendimento de rastreio de produtos químicos que podem inibir a função editosome.

Introdução

O processo de edição de RNA, uma modificação mRNA pós-transcricional, foi descoberto pela primeira vez em tripanosomatídeos ^1. Desde então, o trabalho substancial foi realizada em estudar o mecanismo por trás edição de RNA em Trypanosoma brucei ^2,3. Em uma série de reacções enzimáticas, a editosome, um complexo de núcleo de cerca de 20 proteínas, cria mRNAs mitocondriais maduros para vários componentes do sistema de geração de energia a fosforilação oxidativa. A ordem dos eventos catalíticos é clivagem endonucleolítica, uridylate (U) adição ou exclusão, e ligadura, como ditado por RNAs guia (gRNAs) ^4.

Além das proteínas complexas editosome núcleo, um certo número de factores acessórios também foram identificadas ^5-7. Estas proteínas são vistas principalmente agrupadas em complexos independentes. No entanto, a ordem de montagem de proteínas no complexo editosome núcleo e os padrões de interacção do complexo de núcleo com o acessóriocomplexos estão ainda a ser determinado. Visando o processo de edição de RNA em tripanosomatídeos pode fornecer dissectores químicas que ajudam no estudo do conjunto e de função do complexo editosome. Além disso, estudos funcionais em várias proteínas editosome mostraram essencialidade em diferentes fases da vida, indicando o seu potencial como droga atinge ^8-12. Portanto, os inibidores da editosome encontrados também podem actuar como compostos de chumbo contra tripanosomatideos. Este é oportuna, como drogas atualmente disponíveis contra doenças causadas por tripanossomatídeo são tóxicos, ineficiente e caro ^13,14.

Um ensaio eficiente e conveniente in vitro é necessário explorar o universo químico para inibidores específicos que bloqueiam edição RNA. Três ensaios foram desenvolvidos e utilizados para monitorar editosome atividades: (a) volta completa em ensaio edição de RNA in vitro ^15, (b) pré-clivada em ensaio edição de RNA in vitro ^16,17, umª ensaio ¹⁸ (c) martelo ribozyme (HHR)-based. Os dois primeiros ensaios de contar com visualização direta do produto editado (ATPase 6 mRNA) com a ajuda de radioatividade. O ensaio baseia-HHR utiliza uma versão modificada da ATPase 6 ARNm que é modelada para se comportar como um ribozima mediante edição. A ribozima funcional então cliva especificamente um substracto de ARN marcado radioactivamente, que serve como um repórter. Recentemente, Moshiri et al. Desenvolveu um "misturar e medir 'HHR-base no ensaio in vitro repórter para monitorizar a edição de ARN em que o substrato de RNA marcado radioactivamente é substituído por uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) do substrato ^19. As principais vantagens deste ensaio são os seguintes: (a) é uma mistura rápida e conveniente e medida do tipo de ensaio, como a produção de ribozima activa e substrato de clivagem ocorrer simultaneamente no mesmo tubo em baixo volume (isto é, 20 mL), (b ) que evita a utilização de materiais marcados radioactivamente, (c), que é uma sensibilidadefforded por instrumentação de fluorescência em um formato de placa de micro-titulação, e (d) um sinal de alta-ruído. Utilizando este ensaio, o efeito de inibidores conhecidos de ligase de RNA de edição contra editosome purificada foi confirmada ^19. Este experimento validou o ensaio para a rápida identificação de inibidores de edição de RNA, principalmente contra editosomes inteiros de T. brucei.

A Figura 1 é um esquema detalhado passo-a-passo do ensaio na edição de ARN in vitro baseados em fluorescência. Este protocolo pode ser utilizado para monitorizar a edição de ARN in vitro ou ser facilmente adaptado para o rastreio de bibliotecas de compostos de diversas escalas.

Protocolo

O protocolo que se segue descreve o processo para a realização do ensaio de edição de ARN baseada em fluorescência. O ensaio pode ser realizado num tubo de PCR, 96 bem-, ou placas de 384 poços, consoante o âmbito da experiência. Subsequentemente, o sinal de fluorescência pode ser lida em tempo real, um sistema de detecção de PCR adequados. O ensaio aqui descrito no contexto de placas de 384 poços.

1. T. A cultura brucei Células

1. Prepare um meio de crescimento para T. brucei procíclicos formam células. Para 1 litro de meio:
   1. Dissolver 25,4 g SDM-79 em pó em 800 ml de água MiliQ.
   2. Adicionar 2 g de _NaHCO3 e o pH para 7,3 com NaOH 10 M.
   3. Adicionar água nanopura para um volume final de 900 ml, filtro de esterilizar.
   4. Adicionar Soro Fetal Bovino (FBS), penicilina-estreptomicina a solução e hemina (2,5 mg / ml) para uma concentração final de 10% (v / v), 100 U / ml e 7,5 mg / L, respectivamente.
2. Crescer 300 ml de T. brucei 1.7A tipo selvagem (forma procíclicos) as células a 28 ° C, agitando a 70 rpm para uma densidade de 1,5 x 10 ⁷ células / ml. NOTA: Este deve produzir 3 ml de editosome activo com ~ 0,5 mg de proteína total, suficiente para 600 reacções de edição.
3. Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Lavar o sedimento com 50 ml de tampão de PBSG gelado (10 mM de Na ₂ HPO _4, 10 mM de NaH ₂ PO _4, NaCl 145 mM, e glucose 6 mM), e girar as células novamente por centrifugação a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.

2. Isolamento de mitocôndrias Crude

NOTA: Todos os passos devem ser realizados em gelo ou a 4 ° C para preservar editosome actividade.

1. Ressuspender as células colhidas em 30 ml de tampão de DTE (1 mM Tris-HCl pH 8,0 e EDTA 1 mM). Use um 40 ml homogeneizador Dounce estéril (pré-refrigerados) para interromper a membrana celular acariciando cima e para baixo pelo menos 10 vezes no gelo.
2. Imediatamente adicionar 4,3 ml de 60% ​​de sacarose (w / v, ou seja 1,75 M) ao homogenato para uma concentração final de 0,25 M. Centrifuga-se a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C, para trazer para baixo, preferencialmente mitocôndrias.
3. Ressuspender o sedimento mitocondrial em 4,6 ml de tampão STM (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM de sacarose e 2 mM de MgCl _2). Adicionar 13.8 ul de 0,1 M de _CaCl2 e 4 ul de ADNase I isenta de RNase para concentrações finais de 0,3 mM e 9 U / ml, respectivamente. Incubar a mistura durante 1 hora em gelo.
4. Adicionar 4,6 ml de tampão STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, sacarose 250 mM e EDTA 2 mM), para inactivar a DNase I. Centrifugar a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Ressuspender o sedimento em 400 ul de tampão de lise (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl _2, KCl 100 mM, 1 ug / ml de pepstatina, 1 mM de DTT, e 1 x completo de inibidor da protease livre de EDTA) e transferência para uma tubo de microcentrífuga.
6. Adicionar 10% de Triton X-100 para uma concentração final de 1% de umnd incubar o lisado durante 15 minutos a 4 ° C num rotor de tubo.
7. Limpar o lisado mitocondrial por centrifugação duas vezes a 17,000 xg durante 15 min a 4 ° C; mantendo o sobrenadante clarificado de cada vez.

3. Editosome Purificação

1. Despeje a 10 ml de 10% -30% (v / v), gradiente linear de glicerol (Tabela 1) em um tubo de ultracentrifugação usando tampão de gradiente de HHE 2x (40 mM de HEPES pH 7,9, 20 mM de Mg (OAc) _2, KCl 100 mM, e EDTA 2 mM) e uma máquina de gradiente, seguindo o manual de instruções.
2. Remover cuidadosamente 500 mL de solução a partir do topo do gradiente de glicerol e carregar suavemente 500 ul de lisado mitocondrial apagada. Girar em 178.000 xg durante 6 horas a 4 ° C usando uma ultracentrífuga.
3. Recolha fracções de 500 ul sequencialmente a partir do topo para o fundo do gradiente, a 4 ° C. Em seguida, encaixe congelar as frações, utilizando nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até o uso.

4. RNA Preparação

1. Recozer o molde de ADN contendo respectiva sequência complementar à sequência do promotor de T7 (Tabela 2) com um oligonucleótido do promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') numa razão molar de 1:1 por aquecimento a 90 ° C durante 3 min e arrefecer à TA durante pelo menos 10 min.
2. Transcrever RNA usando um kit de transcrição in vitro, seguindo o manual de instruções.
3. Parar a reacção de transcrição por adição de um volume igual de 7 M corante ureia (ureia 7 M, 0,05% de xileno Cynol, e 0,05% de azul de bromofenol). Correr num filtro esterilizado 9% desnaturante em gel de poliacrilamida (9% de acrilamida, 7 M de ureia, 1 x TBE).
4. Use o sombreamento ultravioleta (UV) com uma lâmpada UV de ondas curtas para localizar e respectivo RNA especial de consumo. Coloque o pedaço de gel excisado num tubo de microcentrífuga e adicionar 400 ul de tampão de eluição em gel (20 mM Tris-HCl pH 7,5, NaOAc 250 mM, EDTA 1 mM e 0,25% de SDS). Eluir a noite à temperatura ambiente num rotor tubo.
5. Precipitate o ARN eluído por adição de 1 ml de etanol frio a 100% e incubação, quer a -80 ° C durante 30 min ou a -20 ° C durante a noite.
6. Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C, para precipitar o ARN para baixo.
7. Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%. Centrifugar a 16000 xg durante 20 min a 4 ° C.
8. Ressuspender o sedimento de ARN apropriada em RNase isenta de água para atingir as concentrações desejadas, como se mostra na Tabela 2.

5. Baseado em fluorescência Edição RNA Assay

1. Para uma única reacção, combinar 1 pmol (1 ul) de preA6Rbz e 2,5 pmol (1 ul) de gA6Rbz (proporção molar 1:2,5), num tubo de microcentrífuga, incubar a 70 º C durante 3 min e deixar repousar à TA durante a pelo menos, 10 min.
2. Enquanto isso preparar uma mistura principal utilizando a Tabela 3, sem o preA6Rbz e gA6Rbz, para a reacção de edição contendo tampão 1x EHH (25 mM de HEPES pH 7,9, 10 mM de Mg (OAc) _2, 50 mM de KCl e 10 mM de EDTA), 1 mMATP, 5 mM de _CaCl2, 16 ng / mL de ARN de levedura Torula, 0,1% de Triton X-100, e o editosome purificada.
3. Adicionar recozido preA6Rbz e gA6Rbz para completar a mistura principal.
4. Dispensar 18 ul da mistura principal (Tabela 3) em poços contendo 2 ul de água isenta de RNase (poços sem compostos) ou 2 ul de 200 uM e compostos químicos incluem amostras de controlo na placa de acordo com a Figura 5.
5. Selar a placa com o selador de placa e girar a placa para baixo, para remover as bolhas de ar. Incubar a 28 ° C durante 4 h.
6. Adicionar 25 pmol (2 ul) de competidor gA6Rbz a cada poço. Coloque um novo aferidor, girar a placa para baixo e coloque-o em uma máquina de PCR em tempo real. Programe o seguinte experimento:
   Passo 1: 85 ° C durante 5 min; Passo 2: 24 ° C durante 10 min; Passo 3: Pare.
7. Adicionam-se 15 pmol (1 ul) de substrato de FRET para cada poço a um volume final de 23 ul. Selar a placa com um novo aferidor.Girar rapidamente a placa e coloque-a de volta na máquina de PCR em tempo real.
8. Programe um novo experimento com os seguintes passos:
   Passo 1: 37 ° C durante 1 min; Passo 2: Leia; Passo 3: Vá para a Etapa 1, 40 vezes; Passo 4: Pare.
9. Instalação da placa, selecionando todos os poços que exigem leitura e escolher o filtro FAM. Volume de entrada de 23 mL e começar a correr.
10. Calcular o declive dos valores obtidos a partir de cada poço / amostra para obter uma medição de cinética traçando as pistas sobre um gráfico de barras para análise. NOTA: A leitura cinética melhora a razão sinal-para-ruído entre a amostra e o fundo; como a amostra de fundo teria uma inclinação perto de zero. Uma leitura ponto final tem maior ruído de fundo.

Resultados

Para demonstrar os passos necessários para a criação de uma tela em grande escala, as Figuras 2-5 são experiências representativas de controlo relacionados com a qualidade do ensaio. Estas são experiências de controlo essenciais para um ensaio consistente ao longo de vários dias ou de rastreio para a comparação de diferentes telas.

Avaliação da fluorescência Relação sinal-ruído

Para assegurar a estabilidade e a qu...

Discussão

Um método de triagem romance de alto rendimento para identificar inibidores contra o complexo RNA edição de Tripanossomas foi apresentado, fornecendo uma nova ferramenta para a descoberta de medicamentos para combater as doenças causadas por tripanosomatídeos. Ensaio ribozyme baseado trastes tem sido amplamente utilizado para diferentes fins ^20-22; no entanto, nós utilizamos a capacidade de ensaio ribozyme baseado em FRET para o monitoramento in vitro de edição de RNA atividade ^19....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDM-79 Medium	Gibco by Life Technologies
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020	heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%	Sigma	H5533-10G
Penicillin-Streptomycin Sollution	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free	Roche	4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production system	Promega	P1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders	Fisher Scientific	K885300-0040
Gradient Master, ver 5.25	Biocomp	107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 ml	Beckman Coulter	344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392052
SW 41 Ti ROTOR	Beckman Coulter	331336
MicroSeal 'B' Seal, Seals	Biorad	MSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)	Bio Basic	A0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kg	Life Technologies	AM9902