Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

Resumo

Matriz CGH para a detecção de variantes do número de cópia genômicas substituiu análise do cariótipo G-unida. Este artigo descreve a tecnologia e sua aplicação em um laboratório de serviço de diagnóstico.

Resumo

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Introdução

Ficou conhecido por muitos anos que deleções ou cópias extras de segmentos cromossômicos causam deficiência intelectual, dismorfismo e malformações congentical e, em alguns casos, causar síndromes genéticas ^1. No entanto, a única tecnologia disponível até meados dos anos 2000 para a detecção de todo o genoma dessas mudanças foi G-unida análise cromossômica, que tem uma resolução de cerca de 5-10Mb, dependendo da região e da natureza do problema, e que não pode detectar cromossomas anormais onde o material foi substituída por uma região de um cromossoma diferente, com o mesmo padrão de bandas. Técnicas de citogenética auxiliares, tais como hibridização fluorescente in situ e multiplex amplificação sonda específica para a ligação ter sido disponível para o interrogatório de loci específico, em casos de suspeita de desequilíbrio sindrômica específico, mas não foi até a introdução da matriz de hibridização genômica comparativa (array CGH) na rotina clínica de diagnóstico service ^2-5 que a detecção de todo o genoma do número de cópias variantes (CNVs) tornou-se possível a um grande aumento da resolução (normalmente em torno de 120kb). Trabalho de serviço clínico ao lado de estudos de pesquisa têm mostrado que CNVs para algumas regiões são mais prevalentes na população normal de ^6-7, ao passo que outros CNVs, anteriormente indetectável, estão associados com neurodisabilities como o autismo e epilepsia ^8-11.

O protocolo descrito neste documento é utilizado em nosso UK National Health Service (NHS) laboratório de diagnóstico clínico; usamos novas estratégias de hibridização, ensaios de lotes e robótica para minimizar o custo neste serviço financiado pelo Estado.

Antes de o protocolo detalhado abaixo, o ADN de alta qualidade devem ser extraídos a partir do material de partida apropriado, vulgarmente sangue, células de cultura ou amostras de tecido. Espectrofotometria pode ser utilizado para medir a concentração (deve ser> 50 ng / ul) e vá 260: 280 razão de absorvância (b deveme 1,8-2,0). A electroforese em gel pode ser usado para verificar que o ADN é de elevado peso molecular sem degradação significativa.

Este protocolo é projetado para laboratórios de maior rendimento que estão rotulando 96 amostras por execução usando a robótica automatizados de movimentação de líquidos. No entanto, ele pode ser adaptado para laboratórios de rendimento inferiores sem automação.

Protocolo

Reação 1. Rotulagem

1. Antes de usar, dUTPs pré-aliquota de cianina 3 e 5 nucleótidos marcados, não marcados e iniciadores aleatórios para as concentrações recomendadas pelo fabricante em placas e armazenamento de 96 poços a -20 ° C prontas para utilização. Para efeitos do presente protocolo, alíquota de 10,5 mL da dUTP marcado adequado e 10,5 ul nucleotídeos não marcados e iniciadores aleatórios a cada poço.
2. Descongelar o prato pronto-para-uso de 96 poços de nucleótidos e os iniciadores a 4 ° C durante cerca de 1 hora, protegidas da luz.
3. Uma vez descongelado, esta placa equilibrar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos, ao abrigo da luz.
4. Equilibrar as amostras de ADN a 60 ° C durante pelo menos 15 min.
5. Usando um robot de tratamento de líquidos, dispensar a água livre de nuclease a cada poço de uma placa de 96 poços.
   NOTA: O volume de água dependerá da concentração de cada amostra de DNA de entrada e deve ser suficiente para resultar numa concentração final de 50 ng / ul.
6. Usando um líquido hanrobô dling, pipeta de 1 ug de ADN em um poço da placa de 96 poços (ver 1.5) para levar o volume total de 20 ul.
   NOTA: Pequenas quantidades de ADN pode ser usado, embora a qualidade de dados resultante pode ser comprometida (por preciosas amostras, as quantidades de ADN de entrada para baixo para 400 ng pode ser utilizado).
7. Usando um robot de tratamento de líquidos, transferir 20 ul de nucleótidos equilibradas e iniciadores em cada poço da placa de ADN diluída.
8. Selar a placa de 96 poços com tampas de tira (uma vedação estanque é importante).
9. Desnaturar o ADN a 99 ° C durante 10 min, em uma máquina PCR com uma tampa aquecida e em seguida, encaixe fresco em gelo durante 5 min a iniciadores recozimento.
10. Usando um tratamento robô líquido, adicione 10 ml de enzima polimerase Klenow Exo DNA para cada DNAs e mix pipeta completamente.
    NOTA: O volume total deve ser de 50 mL.
11. Selar a placa de 96 poços e incuba-se a 37 ° C durante 16 horas.
    NOTA: A incubação mais curto de 4 horas é suficiente, contudo, uma O / N emcubation pode ser mais conveniente.
12. Usando um robot de tratamento de líquidos, adicionam-se 5 ul de tampão de paragem a cada poço.
    NOTA: Um resumo dos reagentes utilizados para a reacção de marcação é mostrada na Tabela 1.

2. Remoção de não incorporados Nucleotides

1. Remover nucleótidos não incorporados utilizando sílica-membrana baseado colunas de giro e um robô rotação processamento coluna dedicada (as colunas de spin também podem ser processados ​​manualmente). Siga as instruções do fabricante.
   1. Transferir o conteúdo de cada cavidade para um tubo de 2 mL; pré-label estes com bem IDs.
      NOTA: Este passo pode ser realizado manualmente ou de preferência através de um robô tratamento líquido.
   2. Se estiver usando um robô processamento coluna de rotação, em seguida, coloque o robô com 2 ml tubos, colunas de giro de purificação de DNA e buffers associados.
   3. Adicionar 250 ul de sal elevado, de ADN tampão de ligação (tampão de PB) para a reacção de marcação para ligar o ADN marcado com a sílicamembrana.
   4. Remover as impurezas por lavagem da membrana, duas vezes com 500 ul de tampão de lavagem (tampão PE).
   5. Adicionar 15 ul de tampão de eluição de sal baixo (tampão EB) para a membrana para recuperar o ADN purificado, marcado num volume de ~ 12 mL.

3. Combinar pares HYB

1. Combine os pares adequados de cyanine 3 e 5 DNA marcado, COT-1 DNA, um mix de bloqueio fornecido pelo fabricante e um tampão de hibridação fornecido pelo fabricante usando um robô de manipulação de líquidos.
   NOTA: Estes pares hyb pode ser um exemplo e uma referência, ou amostra vs amostra se CNVs compartilhada não são um problema (por exemplo, nós rotineiramente emparelhar amostras fenótipo-incompatíveis, como um paciente displasia renal vs um paciente craniossinostose, como eles são muito Não deve levar o mesmo CNV clinicamente significativo). Se utilizar um ADN de referência, é recomendado um fornecimento de ADN comercial, e que deve ser processado juntamente com a amostra.
   1. Usando um tratamento líquido robot, adicionar COT-1 DNA (3333 ng / mL), a mistura de bloqueio e de tampão de hibridação para cada poço de uma placa de 96 poços de modo a que cada poço contém 1,1 uL de ADN Cot-1, 4,95 ul mistura bloqueio e 24.75 fornecido pelo fabricante ul de tampão de hibridação.
   2. Adicionar 9,35 mL da apropriada 3 cianina ADN marcado a cada poço. Pre-wet cada ponta para melhorar a pipetagem precisão.
   3. Adicionar 9,35 mL da ADN cianina apropriado 5-marcado a cada poço. Pre-wet cada ponta para melhorar a pipetagem precisão.
   4. Selar a placa de 96 poços e vortex durante 1 min. Girar a placa de 96 poços para recolher o conteúdo na parte inferior de cada poço.

4. Hibridização

1. Pré-aqueça um forno de hibridação a 65 ° C e Pré-aquecer um slide de apoio e uma câmara de hibridação para cada slide matriz.
   1. Desnaturar o ADN marcado em uma incubação pré-hibridação, antes de ser aplicável às matrizes. Realizar hibridação num forno rotativo durante 24 horas.
   2. Incubar a placa de 96 poços a 70 ° C durante 30 min e, em seguida, deixar a 37 ° C durante pelo menos 5 min.
   3. Trabalhando numa plataforma aquecida a 42 ° C, carregar cada lâmina apoio para uma câmara de hibridação, antes da utilização. Certifique-se que a parte transparente do slide junta alinha com a peça 'janelas' da câmara de hibridação.
   4. Pipet 42 mL da mistura de hibridação previamente preparado (ver secção 3) na posição apropriada na matriz backing slide. Pre-wet cada ponta para melhorar a pipetagem precisão. Pipet lentamente sobre o centro de cada posição, certificando-se que o líquido não toca o limite anel de borracha.
   5. Uma vez que todas as posições no slide backing são preenchidos, abaixe cuidadosamente o slide matriz nele e montar a câmara de hibridação. Certifique-se de que o lado da matriz com a escrita sobre ele está voltado para o slide de apoio. Certifique-se de apertar o parafuso de câmara de hibridação totalmente.
   6. Inspecione a câmara de hibridação montado. ENSure que não há vazamento de mistura de hibridação fora dos limites do anel de borracha e cada bolha de ar é de aproximadamente 4 mm de altura quando a câmara de hibridação é descansou em sua vertical. Gire a câmara de hibridação e verifique se não há bolhas de ar que estão presas na posição e não em movimento. Se houver algum destes sintomas, a câmara de dar uma pancada no banco. Verifique se todas as bolhas de ar estão se movendo.
   7. Coloque a câmara de hibridação para o forno rotativo, a 65 ° C durante 24 horas. Verifique se o rotor forno é equilibrada; utilizar outras câmaras vazias, se necessário.

5. Lavar e Digitalização de Slides

1. Lave matrizes para remover o excesso de DNA marcado e depois digitalizar para medir a fluorescência de cada sonda.
   1. Tome câmaras de hibridação fora do forno e desmontar. A matriz ea junta slides serão coladas; submergir estes em tampão de lavagem 1 e usar um par de plástico, pinça plana gumes para erguer-los.
   2. DiScard o slide junta e coloque a lâmina matriz em um rack submerso em tampão 1.
   3. Lava-se a lâmina de matriz em ~ 700 ml de tampão de lavagem fresca para 1 5 minutos, agitando vigorosamente (usar um pulgas e um agitador magnético).
   4. Transferir as lâminas de matriz para tampão de lavagem ~ 700 ml 2 e lavar durante 90 segundos, mexendo vigorosamente. Levante cuidadosamente as lâminas de matriz fora de tampão de lavagem 2, eles devem emergir seco.
   5. Carregue a lâmina matriz em um suporte de slides do scanner, usando um protetor de slide. Coloque o slide no scanner matriz e digitalizar seguindo as instruções do fabricante do array.

Resultados

Cada sonda numa matriz hibridado é visualizado como uma mistura de vermelho e verde fluorocromos (ver Figura 1). A relação do vermelho ao sinal verde fluorescente para cada sonda é quantificado pelo scanner e software associado traça estes como rácios log2 acordo com sua posição genômica, e identifica regiões abrangidas limites predefinidos fora. Os traços da matriz resultantes permitem a interpretação de regiões identificadas como genomicamente desequilibrado. Por exemplo, o rastreio a pa...

Discussão

Matriz CGH não vai detectar rearranjos equilibrados ou anormalidades ploidy como triploidy. Além disso, o baixo nível de desequilíbrios do mosaico não pode ser detectado. No entanto, array CGH tem uma resolução maior para a detecção CNV de análise cromossômica G-unida qual substituiu em muitos laboratórios de citogenética. É, por conseguinte, o padrão de ouro para detecção de corrente de CNV de todo o genoma. Ele pode ser substituído por tecnologias de sequenciamento de próxima geração no futuro, ma...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH wash buffers	Agilent	5188-5226
Array CGH hybridisation buffer	Agilent	5188-5380
Minelute purification kit	Qiagen	28006
Array CGH labelling kit	Enzo	ENZ-42672-0000