Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Resumo

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Resumo

A maioria dos processos morfogenéticos no intestino fetal têm sido inferida a partir de lâminas finas de tecidos fixados, oferecendo instantâneos de mudanças ao longo do estágio de desenvolvimento. Informação tridimensional de cortes seriados finos podem ser difíceis de interpretar por causa da dificuldade de reconstrução de cortes seriados perfeitamente e manter a orientação adequada do tecido sobre cortes seriados. Recentes descobertas por Grosse et al., 2011 destacam a importância de três informações dimensional na compreensão morfogênese das vilosidades desenvolvimento do intestino ^1. A reconstrução tridimensional de células intestinais isoladamente marcadas demonstraram que a maioria das células epiteliais intestinais em contato com ambas as superfícies apicais e basais. Por outro lado, a reconstrução tridimensional do citoesqueleto de actina para a superfície apical do epitélio demonstrado que o lúmen intestinal é contínua e que lúmens secundários são um artefacto sectioning. Estes dois pontos, juntamente com a demonstração de migração nuclear interkinetic no epitélio intestinal, definido o epitélio intestinal em desenvolvimento como um epitélio pseudo estratificado e não como se pensava anteriormente ^1. A capacidade de observar o epitélio tridimensionalmente foi seminal para demonstrar este ponto e redefinindo morfogênese epitelial no intestino fetal. Com a evolução da tecnologia de imagem multi-fotão e software de reconstrução tridimensional, a capacidade de visualizar intacta, o desenvolvimento de órgãos está melhorando rapidamente. Dois fótons de excitação permite a penetração mais profunda menos prejudiciais para os tecidos com alta resolução. Dois fótons e reconstrução 3D de todo o intestino do feto de rato em Walton et al., 2012 ajudou a definir o padrão de vilo conseqüência ^2. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura de órgão inteiro que permite ex vivo desenvolvimento de vilosidades e extensões desse sistema de cultura para permitiros intestinos para ser tridimensionalmente fotografada durante o seu desenvolvimento.

Introdução

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protocolo

NOTA: Todos os camundongos foram tratados com humanidade usando protocolos aprovados pela Universidade de Michigan Medical School Unidade de Medicina Laboratorial Animal e de acordo com as orientações do Comitê da Universidade de uso e cuidados dos animais.

1. Whole sistemas de órgãos Cultura

1. Preparação de meios de comunicação e placas de cultura
   1. Em uma cultura capuz tecido, remover 5 ml de meio BGJb da garrafa estoque e adicionar 5 ml de Pen / Strep. Prepare um estoque de trabalho de mídia em um tubo de 50 ml, adicionando 1 ml de 5 mg / ml de ácido ascórbico a 49 ml de meio BGJb (com Pen / Strep).
   2. Preparar uma placa de cultura de 6 poços por adição de 1 ml por baixo de cada um dos transwells.
      NOTA: Se todos os 6 transwells não são utilizados, mova transwells extras em uma nova estéril placa de 6 poços para uso posterior. Adicione 3 mL de meios de trabalho BGJb para cada uma de três placas de Petri de 10 centímetros estéreis.
2. Preparação para dissecção
   1. Mergulhe ferramentas de dissecação em 70% ethanol e não se esqueça de manter as ferramentas limpas, enquanto trabalhava.
   2. Configure a área de dissecação com um grande balde de gelo e coloque a placa de cultura de 6 poços e 10 centímetros de Petri com meio BGJb no gelo. Trabalhar no gelo, tanto quanto possível, enquanto dissecar e preparar o intestino para a cultura.
   3. Anestesiar ratos fêmea adulta em uma câmara com isofluorano (100 l) antes de eutanásia por deslocamento cervical para a exploração dos intestinos fetais.
   4. Após a colheita os fetos de sua mãe, encenar cada feto cuidadosamente de acordo com o gráfico ¹³ Theiler encenação. Não confie nos dias pós-coito para determinar a idade de cada feto como variações de até 24 horas, em fase de desenvolvimento são rotineiramente observado em uma única ninhada.
3. Dissecção da intestinos fetais
   1. Eutanásia fetos por decapitação antes da remoção do intestino.
   2. Dissecar cada intestino em 1x de Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e place-lo em uma placa de petri 10 centímetros com o trabalho de mídia BGJb.
   3. Cuidadosamente remover o baço do estômago e do pâncreas do estômago e duodeno superior.
   4. Suavemente separar o omento tendo o cuidado de deixar o omento ligado, tanto quanto possível, e que separa as ligações apenas o suficiente para permitir que o intestino para ser esticado.
      NOTA: Para o intestino mais velhos do que os que são ou E14.5 cultivadas mais do que 24 horas, cuidadosamente separar o intestino em três segmentos iguais para permitir conteúdo luminal para fluir através do intestino e ser expelido das extremidades cortadas. No entanto, para as culturas iniciadas antes E13.5, esperar até que após 24 horas de cultura antes de se separar os três segmentos do intestino para permitir que a serosa para crescer adequadamente ao longo do comprimento do intestino.
   5. Usar uma pipeta de boca para transferir as peças intestinais para os transwells da placa de cultura (1.1.2).
   6. Gentilmente reposicionar os intestinos como necessário para que eles fiquem em frente a Transwell.
      NOTA: Uma vez que os intestinos começam a se mover conteúdo luminal através do tubo, todas as torções no intestino fará uma cópia de segurança e danos ao intestino.
4. Cultura e tratamento
   1. Remova a mídia sob o transwell, adicionar 700 mL de mídia (media de tratamento que trabalham com proteínas recombinantes adicionados ou inibidores farmacológicos), sob o transwell.
   2. Adicionar 300 mL de meio de tratamento gota a gota, em cima dos intestinos e deixe de molho por meio da transwell. Reposicionar os intestinos, se necessário.
   3. Mudar meio de tratamento, pelo menos, uma vez por dia ou mais frequentemente, dependendo da meia-vida do reagente de tratamento.
5. Preparação de esferas de agarose de proteína embebido por uma fonte localizada de tratamento reagente
   1. Ressuspender as esferas de agarose em seu recipiente de armazenagem e transferência de 100 ul de esferas de agarose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Encher o volume restante do tubo estéril com 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) e misturar as contas para lavá-los. Colocar o tubo de microcentrífuga num bastidor durante alguns minutos para permitir que os grânulos se depositem no fundo e, em seguida, para fora da pipeta a partir de PBS no topo dos grânulos. Tornar a encher o tubo de microcentrífuga estéril com 1x PBS e repetir o processo de lavagem mais duas vezes.
   3. Prepare a proteína de interesse em duas vezes a concentração desejada para o tratamento.
   4. Misturar 5 mL de pérolas de agarose lavados com 5 l de estoque a proteína 2x e agitar suavemente as pérolas em proteína. Colocar o tubo em gelo durante 1 hora, misturando suavemente cada 10-15 min.
   5. Lavar as contas brevemente em estéril 1x PBS, antes de colocar as contas no intestino.
6. Colocação de pérolas de agarose
   1. Coloque suavemente as esferas de agarose no topo do intestino utilizando uma pipeta de boca com agulhas capilares puxados. Coloque as contas com extrema cautela, como manuseio descuidado pode danificar o intestino e prevenir o desenvolvimento de vilosidades no local da lesão.
   2. Inserir o dobro de grânulos como são necessários para a análise uma vez que os intestinos irá sofrer movimentos peristálticos e cerca de metade das pérolas colocadas sairão dos intestinos mais o tempo de cultura.
7. Fixação de intestinos cultivadas
   1. Retire cuidadosamente a mídia de tratamento abaixo do transwell e permitir que os intestinos para o ar seco por 3 min.
   2. Adicionar 1 ml de fixador sob a transwell durante 2 min, em seguida cobrir a parte superior do intestino com 2 ml de fixador para o restante do tempo de fixação. Fixar com paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C ou durante 2 horas à temperatura ambiente.

2 Imagem de intestinos fixas

1. Imaging Wholemount
   1. Coloque os intestinos inteiros (com fluorescência endógena) em um slide com 100 ml de 1x DPBS. Use uma pinça para organizar cuidadosamente os intestinos.
   2. Use um lenço de laboratório para remover cuidadosamente os DPBS e imediatamente adicione 100 ml de glicerol a 70% para fazer a mo tecidore transparente e possível aumentar a profundidade da imagem.
      NOTA: Se a penetração do intestino é desejado, em vez de montagem no intestino em 70% de glicerol, embeber o intestino em algumas gotas de solução de focagem claro para 10-30 min. Pipeta off a solução foco claro e montar o intestino com o Monte Clear.
   3. Mergulhe cada um dos quatro cantos de uma lamela em massa de modelar e pegar uma pequena quantidade de argila para usar como espaçadores entre lâmina e lamela para manter a lamela de achatamento do intestino.
   4. Selar a lamela sobre a lâmina com valap derretida aplicado com um cotonete.
   5. Imagem do intestino de cada um microscópio confocal vertical ou invertida. Consulte a discussão para mais detalhes.
2. Vibratome corte de intestino fixos (para corte transversal das estruturas intestinais)
   1. Intestinos inserir em 7% agarose em pequenos moldes de plástico (10 x 10 x 15 mm) e permitir que os blocos de agarose paraesfriar e solidificar.
   2. Remova os blocos de agarose a partir dos moldes de plástico e cola blocos de agarose para a etapa de coleta vibratome com cola instantânea.
   3. Preencha a etapa de coleta com o frio do gelo 1x DPBS.
   4. Cortar secções com uma espessura entre 100-150 m. Para seções mais grossas usar soluções de compensação (descritos no ponto 2.1.2) para visualizar mais profundamente na seção transversal.
   5. Despeje vibratome secções a partir da fase de recolha para um poço de uma placa de 6 cavidades, para armazenamento a 4 ° C.
3. Coloração de imunofluorescência, tecidos seccionados vibratome fixos
   1. Colocar 5-12 secções vibratome por cavidade em uma placa de 24 poços com 1 x DPBS.
   2. Remover 1x DPBS e adicione 500 ml de solução de permeabilização por poço. Agite delicadamente as amostras por 25 min em temperatura ambiente.
   3. Depois de permeabilização, lavar as amostras 3 vezes com PBS 1x.
   4. Bloquear as amostras de, pelo menos, 30 minutos em 500 ul de solução de bloqueio.
   5. Após o bloqueio, exchange a solução de bloqueio com 500 ul de anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio e a manter as amostras a 4 ° CO / N.
      NOTA: As diluições de anticorpos primários que funcionam bem em cortes congelados e parafina geralmente funcionam bem em vibratome seções também, no entanto os anticorpos que exige recuperação do antígeno nuclear geralmente não funcionam bem com este protocolo (por exemplo, BrdU).
   6. No dia seguinte, as amostras de lavar três vezes durante 15 min de cada vez com solução de bloqueio.
   7. Após a lavagem, aplicam-se 500 ul do anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio. Envolva a placa de 24 poços com folha de alumínio para proteger os fluoróforos de luz e balançar as amostras durante 45 minutos a 2 horas à temperatura ambiente.
   8. Lave as amostras 3 vezes com PBS 1x por 15 minutos cada e montar as seções vibratome em slides como descrito na Seção 2.4.
4. Montagem vibratome seções
   1. Preparar lâminas para vibratome montagem cortando fatias finas de double-stick fita e colocá-los ao longo dos lados longos dos slides.
   2. Com cuidado, coloque 5-10 seções vibratome entre a fita dupla-stick nos slides em uma gota de 100 l de PBS 1x.
   3. Desdobrar todas as seções e espalhá-los em uma única camada em todo o slide.
   4. Remova qualquer excesso de agarose ou pedaços irregulares que impediria uma lamela de sentar-se plana.
   5. Com cuidado, use um tecido de laboratório para absorver o excesso de PBS 1x de todo as seções vibratome.
   6. Adicionar uma gota de meio de montagem aquoso no topo das secções de vibratome e depois lamela.
   7. Sele as lamelas para as lâminas com derreteu valap aplicado com um cotonete.
   8. Imagem seções vibratome em ambos um microscópio confocal vertical ou invertida. Consulte a discussão para mais detalhes sobre a seleção de um sistema de imagem.

3 Imagens ao vivo de intestinos inteiros

Intestinos colhidas a partir de fetoss depois de E12.5, com o omento ligado deixado intacto, desenvolver com sucesso vilosidades em cultura usando o sistema acima. Portanto, este sistema ex vivo permite a captura de imagens de secção z vivo do intestino em desenvolvimento, que podem ser reconstituídas para uma vista tridimensional da morfogénese ao longo do tempo.

1. Configurando imagens ao vivo
   1. Use cola instantânea para aderir uma membrana de policarbonato indivíduo a uma tela de malha fina. Isto proporciona uma estrutura de suporte de apoio para segurar o intestino em lugar abaixo da lente de imersão do microscópio confocal vertical. Por favor, consulte a seção de discussão para mais detalhes sobre a seleção de microscópios de imagem ao vivo.
   2. Coloque a tela de malha no centro do poço de uma placa de cultura.
   3. Inserir o intestino dissecados sobre a membrana de policarbonato e adicionar uma gota de cola instantânea em cada extremidade. Use apenas cola suficiente para apor o intestino, mas não revesti-la!
   4. Adicionar cultura de mídia livre de fenol vermelho abaixo do policarbonatomembrana no centro de uma das cavidades da placa de cultura.
   5. Adicionar água para a borda exterior da placa de cultura para fornecer humidade.
   6. Uma vez que o intestino fetal sofre ondas peristálticas semelhantes de contracção da cultura, adicionar 100 ml de uma solução a 1: 5 de xilazina em 1x PBS a 3 ml de meio para controlar o movimento do intestino, enquanto imagiologia. Esta dosagem vai controlar os movimentos intestinais por cerca de 8-10 horas, sem comprometer o desenvolvimento das vilosidades.
   7. Para um corte transversal do intestino delgado, o intestino incorporar vivos em uma solução de 3-4% de agarose e cortou secções espessas (150-500 um) sobre um vibratome. Combinar a rigidez da agarose com a rigidez do intestino que está sendo cortada e empiricamente determinada fase de desenvolvimento. Geralmente, uma solução de agarose a 3% funciona bem para os intestinos menores de E14.5 e uma solução a 4% funciona bem para os intestinos E15-E16.
   8. Cole as seções vibratome a uma membrana de policarbonato aposta em uma tela de malha (como na Seção 3.1.1) ecultura como descrito na Seção 3.1.2-3.1.6.
   9. Conduzir a imagens ao vivo usando um de dois fótons microscópio confocal de fluorescência (excitação laser entre 690-1,040 nm) em uma posição vertical com uma mesa ajustável.
   10. Dois fótons de laser sintonizado 900 nm proporciona uma penetração profunda com a melhor resolução para sinais de GFP. Reduz danos aos tecidos, enquanto Imaging. Além disso, a configuração da potência do laser de emissão mais baixa possível reduzir o dano tecidual. Tipicamente, para obter uma boa excitação de GFP, usar 12% de energia em que o laser de dois fotões.

Resultados

Culturas de explantes de intestino fetal inteiros permite a análise da localização, distribuição e duração das moléculas de sinalização que coordenam o desenvolvimento intestinal, como este sistema permite a manipulação da sinalização com reagentes farmacológicos ou proteínas recombinantes. O sistema de cultura Transwell (Figura 1A, reproduzido a partir de Walton et al., 2012) ² fornece uma interface ar-líquido, o que faz com que seja possível colocar droga ou prote...

Discussão

A natureza dinâmica e interações complexas de tecido do intestino desenvolvimento requer visualização 3D para ter uma apreciação plena desses eventos morfogenéticos. Com a evolução da tecnologia de imagem, a capacidade de examinar vilosidades morfogênese em detalhe está a desenvolver / melhorar e, com isso, a compreensão da comunicação espacial e interação durante a organogênese é bastante reforçada.

Os métodos alternativos para a cultura de intestinos inteiros foram tam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416