Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Resumo

Nós relatamos um dispositivo e um novo método para estudar células e embriões. células individuais são precisamente ordenados em matrizes microcavidade. Seu confinamento 3D é um passo para ambientes 3D encontrados em condições fisiológicas e permite a orientação organela. Ao controlar a forma da célula, esta configuração minimiza variabilidade relatados em ensaios convencionais.

Resumo

As células biológicas são geralmente observados em superfícies planas (2D). Esta condição não é fisiológica, e fenótipos e formas são altamente variáveis. A triagem com base em células em tais ambientes têm limitações, portanto, graves: organelas celulares mostram fenótipos extremos, morfologias celulares e tamanhos são organelos celulares heterogêneos e / ou específicos não pode ser correctamente visualizado. Além disso, as células in vivo situam-se num ambiente 3D; Nesta situação, as células mostram diferentes fenótipos principalmente por causa da sua interacção com a matriz extracelular em torno do tecido. A fim de padronizar e gerar fim de células individuais em um ambiente 3D fisiologicamente relevantes para ensaios baseados em células, relatamos aqui a microfabricação e aplicações de um dispositivo para o cultivo in vitro de células 3D. Este dispositivo é composto por uma matriz 2D de microcavidades (tipicamente 10 cavidades ⁵ / ^cm2), cada um cheio com células individuais ou embriões. posi celularção, a forma, a polaridade e organização celular interna tornar-se então normalizados mostrando uma arquitetura 3D. Usamos moldagem réplica de padrão de uma matriz de microporos, (PDMS) camada 'eggcups', em um polidimetilsiloxano fina aderiu em uma lamela. Cavidades foram cobertas com fibronectina para facilitar a aderência. As células foram inseridos por centrifugação. A porcentagem de preenchimento foi otimizado para cada sistema que permite até 80%. As células e os embriões viabilidade foi confirmada. Esta metodologia foi utilizada para a visualização dos organelos celulares, tais como aparelhos de Golgi e núcleo, e para estudar processos activos, tais como o encerramento do anel cytokinetic durante a mitose celular. Este dispositivo permitiu a identificação de novas funcionalidades, tais como acumulações periódicas e heterogeneidades de miosina e actina durante o encerramento do anel cytokinetic e fenótipos compactadas para Golgi e alinhamento núcleo. Caracterizamos o método de células de mamíferos, levedura de fissão, brotação de levedura, C. elegans wom adaptação específica em cada caso. Finalmente, as características deste dispositivo torná-lo particularmente interessante para ensaios de rastreio de drogas e medicina personalizada.

Introdução

Actual em ensaios baseados em células in vitro são bidimensional (2D). Esta configuração não é natural para células de mamíferos e, por conseguinte, não é fisiologicamente relevante ^1; células mostram uma diversidade de formas, tamanhos e fenótipos heterogêneos. Eles apresentam sérias limitações adicionais quando aplicado para aplicações de rastreio, tais como uma distribuição desordenada dentro do plano e fenótipos extremos de organelos celulares (fibras de stress, em particular). Isto é particularmente importante em ensaios clínicos para o teste de drogas, onde os altos orçamentos são gastos a cada ano. A maioria destas drogas que falham quando aplicados a modelos animais por causa da condição de cultura 2D artificial nas fases iniciais de rastreio de drogas. Além disso, ao utilizar esta abordagem, organelos celulares específicos podem não ser correctamente visualizado, tal como o anel de actomiosina cytokinetic durante a mitose celular, e, geralmente, estruturas que estão a evoluir no plano perpendicular ao plano de observação. Algunsnovos ensaios 2D têm sido propostos a fim de ultrapassar os inconvenientes acima mencionados e conhecimentos importantes sobre a organização do citoesqueleto foram observados ^2,3. No entanto, estes ensaios ainda apresentam uma séria limitação: células apresentam um fenótipo muito propagação em contraste com o que se observa in vivo, em que as células apresentam uma arquitectura 3D. Estes artefactos associados com o método de cultura pode desencadear características não-fisiológicos, tais como fibras de stress ^1,4,5 melhoradas.

Tridimensionais ensaios de cultura celular fornecer várias vantagens quando comparados com os ambientes 2D ^6,7. Eles são fisiologicamente mais relevante, e os resultados são, portanto, significativa. Como um exemplo, as células embebidas em hidrogéis mostram estruturas 3D-like, mas as suas morfologias diferem de uma célula para outra ^8,9. No entanto, as suas morfologias diferem de uma célula para outra, o que complica as aplicações de rastreio. Uma estratégia alternativa é incorporar únicacélulas em cavidades microfabricados ^10,11. posição da célula, forma, polaridade e organização célula interna pode, então, tornar-se normalizada. Além de fornecer a arquitetura 3D-like para as células, microcavidades também permite estudos de triagem de alto conteúdo ^10,12-14; As células individuais podem ser ordenadas em microarrays e organelos celulares e suas evoluções pode ser observada em paralelo. Essa regularidade fornece boas estatísticas com baixo número de células e melhores resoluções temporais / espaciais. Os compostos úteis são mais fáceis de identificar com segurança.

Neste estudo, nós mostramos a fabricação e aplicação de um novo sistema de células única cultura 3D-like de alto conteúdo de triagem aplicações ^10,12,13. O dispositivo consiste de uma matriz de microcavidades elastoméricos (10 ⁵ cavidades / cm ^2), cunhada 'eggcups »(CE). Dimensões e volume total de CE neste trabalho são otimizados para o volume típico de células NIH3T3 e HeLa individuaisdurante a divisão celular. Morfologia das cavidades cilíndricas - - é seleccionado a forma da célula orientar correctamente para a visualização de processos activos. Moldagem réplica é usado para padrão de um conjunto de CE para um (PDMS) camada fina polidimetilsiloxano aderiu em um vidro lamela ^15,16. As células são introduzidas na CE por centrifugação. Relatamos aqui a observação e normalização das organelas celulares (fibras de stress de actina, aparelho de Golgi e núcleo) em 3D (CE), em comparação com as mesmas células em 2D (plana) superfícies. Nós também relatam a observação de processos dinâmicos ativos, tais como o fechamento do anel actomiosina cytokinetic durante a mitose de células ^17. Por fim, mostramos resultados desta metodologia em outros sistemas com paredes rígidas, como a levedura de brotamento, levedura e C. embriões elegans, o que confirma a aplicabilidade da nossa metodologia para uma ampla gama de sistemas modelo.

A seguir, apresentamos um p detalhada e exaustivarotocolo, a fim de fabricar e aplicar as 'eggcups' para microfabricação 3D. Nossa abordagem é simples e não precisa de um quarto limpo. Nós antecipamos que essa nova metodologia será particularmente interessante para testes de rastreio de drogas e medicina personalizada, em substituição de placas de Petri. Finalmente, o nosso dispositivo irá ser útil para estudar a distribuição de respostas de células a estímulos externos, por exemplo no cancro ou ¹⁸ em pesquisa básica ^19.

Protocolo

1. Microfabricação de 'Eggcups'

1. Fabricação do Mestre: microcavidades matriz
   1. Aqueça uma bolacha de 3 '' de silício de até 200 ° C para evaporar qualquer presença de umidade.
   2. Spin-coat uma fina camada de SU-8 fotorresiste. Ajustar o volume da resina e velocidade de centrifugação em função do tipo e espessura do material fotosensitivo desejado. Esta espessura vai ditar a profundidade das 'Eggcups »(CE). Para uma camada de espessura de 30 um e SU-8 2025, spin-coat a 2,800 rpm.
   3. Pré-coze a bolacha a 65 ° C durante 1 min (passo 1 de 2) para uma espessura SU-8 2,025 camada de 30 um. Adaptar o tempo, dependendo do tipo de foto-resistente e de espessura desejada. Verifique o fabricante folha de dados para obter detalhes.
   4. Pré-coze a bolacha a 95 ° C durante 3 min (passo 2 de 2) para uma espessura SU-8 2,025 camada de 30 um. Adaptar o tempo, dependendo do tipo de foto-resistente e de espessura desejada. Verifique o fabricante folha de dados para obter detalhes.
   5. carregar owafer no alinhador máscara de exposição aos raios UV. Coloque a máscara de fotolitografia nele. A máscara mostra um padrão de características circulares (discos), de 20 um de diâmetro. Garantir um perfeito contato entre si.
      NOTA: Diferentes fabricantes oferecem máscaras de fotolitografia. A resolução espacial irá determinar o custo final. máscaras de acetato de fornecer resolução aceitável (≈10 mm) a baixo custo. máscaras de cromo proporcionar uma melhor resolução, mas são mais caros. Adaptar os diâmetros dos discos (a partir da máscara de fotolitografia) para o volume de células. Dimensões dos discos sobre a máscara irá determinar o diâmetro da cavidade do dispositivo. diâmetros pequenos levarão a um enchimento de baixa; demasiado grande diâmetro não vai limitar as células. Para as células HeLa e NIH3T3, diâmetros de 20 um a 25 um são sugeridos.
   6. Verifique a fonte de exposição antes da lâmpada de UV e optimizar o tempo de exposição de acordo. Irradiar (comprimento de onda = 365 nm) 41,5 seg (ou o tempo de exposição optimizado) a250 mJ / cm ^2.
      NOTA: SU-8 2025 é um fotorresiste negativo, o que significa que as regiões expostas a UV será curado. Neste caso, as características circulares eram negros e transparente descanso. trabalho fotorresiste positivo no sentido oposto: regiões não expostas são curados. Selecione o fotorresiste em conformidade, dependendo do design e foto-máscara.
      NOTA: proteger os olhos da luz UV com óculos de segurança apropriados.
   7. Remover suavemente a máscara da camada foto-resistente.
   8. Pós-coza a bolacha a 65 ° C durante 1 min (passo 1 de 2) para uma espessura SU-8 2,025 camada de 30 um. Pós-coza a bolacha a 95 ° C durante 3 min (passo 2 de 2) para uma espessura SU-8 2,025 camada de 30 um. Adaptar o tempo, dependendo do tipo de foto-resistente e de espessura desejada. Verifique o fabricante folha de dados para obter detalhes. Depois de pós-cozimento, arrefecer a bolacha à temperatura ambiente no banco por cerca de 1 min.
   9. Coloque a bolacha no spin-coater e soltar alguns mm de SU-8 desenvolvedor para cobrirtoda a área da bolacha. Desenvolver durante 2 min e, em seguida, spin-revestimento a 1.000 rpm durante 30 segundos. Repita o procedimento três vezes.
   10. Lavar com 2-propanol para se assegurar a remoção completa de subdesenvolvidos SU-8. Aparecimento de regiões branco é uma indicação de desenvolvimento incompleto. Se assim for, repetir o passo de desenvolvimento de um tempo adicional.
   11. Duro-coza a bolacha a 200 ° C para assegurar a robustez das microestruturas fabricadas. Este passo é opcional.
   12. Armazenar o disco de contacto 3 '' com microestruturas dentro de um 94 milímetros x 15 mm numa caixa de Petri de poliestireno.
       NOTA: Não há necessidade de tratamento de superfície, em especial, silanização, para as próximas etapas.
2. Fabricação do polidimetilsiloxano (PDMS) Réplica: Colunas matriz
   1. Misturar completamente numa proporção 1:10 (w / w) do agente de reticulação e o pré-polímero de um total de 30 g no interior de um tubo de 50 ml.
      NOTA: Usando uma proporção de 1:10 (v / v) também está a trabalhar.
   2. Centrifuga-se o tubo a 1.800 xg durante 5 min pararemover bolhas de ar.
   3. Gota suavemente o PDMS no topo das microestruturas.
      NOTA: Se aparecerem bolhas de ar durante esta etapa, desgaseificar a amostra utilizando uma bomba de vácuo para 15-20 min.
   4. Colocar a amostra num forno a 65 ° C durante 4 h.
      NOTA: O tempo de cura varia entre os utilizadores e, em conjunto com o agente de reticulação: proporção de pré-polímero. Desta vez vai ditar a rigidez do PDMS. Recomenda-se a curar mais de 2 horas e se ater a um tempo de cura fixo.
   5. Usar um bisturi para cortar suavemente a área de interesse (stamp) de cerca de 1 cm ^2, que inclui cerca de 10 ou ⁵ 'microcavidades Eggcups'.
      NOTA: Corte pela primeira vez as PDMS e, em seguida, retire-a suavemente. Para verificar a qualidade da réplica de PDMS com um microscópio óptico.
3. Fabricação de 'eggcups' por moldagem réplica. No que se segue, duas estratégias alternativas para a fabricação de '' Eggcups são descritos. Ambos os protocolos são similar e fornecer resultados idênticos:
   1. estratégia 1
      1. Ative o selo PDMS fabricada por tratamento com plasma de oxigênio durante 30 segundos. Armazenar temporariamente os selos activados numa placa de Petri fechada para evitar a deposição de pó.
         NOTA: Ajuste o tempo de exposição, se forem utilizados outros gases para o plasma.
      2. Coloque o PDMS activados selo de cabeça para cima (o lado com as estruturas) numa placa de Petri ao lado de uma tampa do tubo de 15 ml. Encha a tampa com 200 mL de trimetilclorosilano (TMCS). Feche a placa de Petri e deixar o silanizar selo para 7 min.
         NOTA: Alguns deformação temporária no selo e / ou mudança de cor (branco) pode ser observada. O selo irá recuperar a sua forma original em curto período de tempo e as estruturas não irá ser afectada.
         NOTA: TMCS produz inalação e dérmica toxicidade aguda, e é altamente inflamável (com recapitular ignição capaz de ocorrer através de distâncias consideráveis). Por conseguinte, ele deve ser usado numa câmara de exaustão para longe da fontes de ignição.
      3. Coloque o selo PDMS sobre o spin-coater com as estruturas de cabeça para cima. Colocar uma pequena gota de alguns microlitros (cerca de 20 uL) de PDMS líquidos (1:10 w / w reticulante: pré-polímero) na parte superior das estruturas. Spin-revestimento a 1.500 rpm durante 30 segundos para depositar uma camada fina de PDMS na parte superior das estruturas.
         NOTA: Se o selo não se encaixa no spin-coater chuck lugar do selo no topo de uma tampa placa de Petri com um pequeno furo no seu centro.
      4. Colocar o selo no forno a 65 ° C durante 4 horas para curar a camada de PDMS revestido por centrifugação depositado.
      5. Ative a camada de PDMS fina, colocando o selo PDMS de cabeça para cima, juntamente com uma lamela de vidro # 0 de 25 mm de diâmetro, usando oxigênio líquido de limpeza de plasma durante 30 segundos. Avançar rapidamente para a próxima etapa.
         NOTA: lamelas com outras espessuras, formas, dimensões e podem ser usados ​​também. No entanto, algumas estruturas celulares poderiam ser difíceis de visualizar dependendo da espessura da lamela e seleccionado objectivoampliação e / ou NA e / ou distância de trabalho. Verifique a folha de dados objetivos.
      6. Coloque em contato o selo (o lado com a camada fina revestida de rotação) com a lamela de vidro. Pressione suavemente tudo em torno da superfície do selo com uma pinça para fazer a 'ligação'. Finalmente, manter uma pressão constante no topo do selo para cerca de 10 seg.
      7. Após 30 min gentilmente 'casca' o selo para fora da lamela, a fim de "libertar" 'eggcups' (veja a Figura 1). Lavar cuidadosamente com etanol e seco. Se PDMS 'eggcups' não são bem aderida à lamela de vidro (ou seja, se destacam durante a etapa 'unpeeling'), considere ajustar as configurações do aspirador de plasma e reiniciar no passo 1.3.1.5.
         NOTA: Este passo é delicada. Prestar atenção, a fim de evitar a ruptura da lamela e / ou desprendimento da camada de PDMS fina.
      8. Cole um pedaço pequeno (identificador) de PDMS curado de 1 mm x 1mm x 3 mm de volume na extremidade da lamela com uma pequena gota de PDMS líquidos e curar o PDMS como antes. Isto irá facilitar a manipulação da amostra depois (ver a Figura 1). Este passo é opcional.
   2. estratégia 2
      1. Hidrofilizar as PDMS selos fabricados por tratamento com plasma de oxigénio durante 30 seg. Armazenar temporariamente os selos activados numa placa de Petri fechada para evitar a deposição de pó.
         NOTA: Ajuste o tempo de exposição, se forem utilizados outros gases para o plasma.
      2. Hidrofilizar a 25 milímetros lamelas de vidro de diâmetro # 0 oxigênio tratamento de plasma de 15 W durante 30 segundos. Avançar rapidamente para a próxima etapa.
         NOTA: lamelas com outras espessuras, formas, dimensões e podem ser usados ​​também. No entanto, as estruturas celulares será difícil de visualizar dependendo da espessura lamela seleccionado e as características objectivas (ver nota abaixo).
      3. Spin-revestimento uma pequena gota de PDMS (1:10 w / w reticulante: pré-polYmer) de alguns microlitros para as lamelas de vidro. Girar-revestimento a 1.500 rpm durante 30 segundos para uma espessura final de cerca de 50 um.
      4. Cole um pequeno pedaço (identificador) de PDMS curados of 1 mm x 1 mm x 3 mm de volume na extremidade da lamela com uma pequena gota de PDMS líquidos e curar o PDMS como antes. Isto irá facilitar a manipulação da amostra depois (ver a Figura 1). Este passo é opcional.
      5. Armazenar temporariamente as lamelas PDMS-revestidos em um limpa limpe dentro de uma placa de Petri para proteger da deposição de poeira.
      6. Coloque uma gota de reagente de silanização em cima de cada selo e deixe evaporar em 1-2 min. Em seguida, secá-las sob uma corrente de N _2.
         NOTA: Nesta etapa, uma deformação temporária do carimbo pode ser observado durante a evaporação. O selo irá recuperar a sua forma original depois de se secar com N _2, sem qualquer deformação permanente de microestruturas.
      7. Deixe cair muito suavemente o selo silanizada em cima doPDMS-spin-revestido lamela de vidro armazenado na caixa de Petri. Certifique-se de que ambos os lados são completamente paralelo durante o contacto. Evite pressionar ou mover o selo após colocá-lo sobre a lamela PDMS-revestidos.
      8. Colocar a placa de Petri com amostras no vácuo durante 1-2 h para remover as bolhas de ar.
         NOTA: Certifique-se de que as amostras são totalmente horizontal para evitar o deslocamento de selo. Evita também potencialmente vibração causada pela bomba de vácuo.
      9. Coloque as amostras em estufa a 65 ° C durante 4 h.
      10. Delicadamente, retire o selo para revelar 'eggcups'. Lavar cuidadosamente com etanol e seco.
          É necessária prática neste momento: NOTA. Preste atenção em evitar a ruptura da lamela e / ou descolamento da camada de PDMS fina.

2. Introdução de células para o '' Eggcups

A fim de introduzir células de mamíferos dentro "eggcups ', PDMS ne superfícieeds a ser funcionalizado com proteínas de adesão da matriz extracelular. Este exemplo utiliza a fibronectina, mas outras proteínas de interesse, tais como colagénio, pode ser utilizada.

1. Hidrofilizar dos eggcups 'no limpador de plasma de oxigênio durante 30 segundos.
   NOTA: Otimizar os parâmetros, se necessário.
2. Prepara-se uma solução em PBS 1x de 20 ug ^mL-1 de fibronectina a partir de fontes de bovinos.
3. Esterilizar dos eggcups 'com UV durante 5 min. Depositar uma pequena gota (cerca de 20-50 mL) de solução de fibronectina para cobrir toda a área 'Eggcups' e incubar durante 1 h à TA. Proteger a amostra de secagem.
4. Lavar cuidadosamente as 'eggcups' com PBS 1x. Repita 3 vezes.
   NOTA: A amostra está pronta para usar imediatamente ou armazenadas a 4 ° C no escuro durante várias semanas.
5. Introduzir uma peça de plástico feito por encomenda cilíndrico de 63 mm de altura de 26 mm de raio exterior e 7 mm de dimensões raio interno para um tubo de 50 ml (verFigura 2) ²⁰
   CUIDADO: Use itens UV-esterilizado ou esterilizá-los uso anterior.
   NOTA: Esta peça pode ser facilmente fabricado no laboratório. ou por qualquer loja de máquina disponível.
6. Colocar 13 ml de meio de cultura de células no interior do tubo (ver Tabela 1). O meio deve preencher pelo menos 2 cm acima da peça cilíndrica para a sua imersão completa da amostra.
   NOTA: Para mais informações sobre tipos específicos de células, e outros sistemas modelo tais como leveduras ou C. elegans embriões, e do meio correspondente utilizado, consulte a secção 5 e Tabela 1. O protocolo descrito foi otimizado para HeLa, células NIH3T3, e outras linhas de células (ver Tabela 1).
7. Introduzir muito suavemente dos Eggcups 'no interior do tubo e paralela ao lado superior da peça de plástico. Use uma pinça afiada para manter a amostra usando a alça PDMS. Pressione suavemente as lamelas até que ela se encontra em cima do lado superior da peça de plástico, unaté que esteja completamente imerso (ver Figura 2).
   NOTA: É recomendado o uso de pinças afiadas e retas. Com pinças curvas, a manipulação da amostra é difícil e pode causar a ruptura.
8. células de cultura até 80-100% de confluência numa placa de Petri P60 e recolhê-las por tripsinização.
   NOTA: As células podem ser de tipo selvagem, transfectadas ou tratadas com qualquer droga de interesse.
   NOTA: Evitar a formação de agregados de células, o que evitará células individuais para introduzir os 'eggcups'. Para otimizar esta etapa, pipeta cima e para baixo cuidadosamente após tripsinização.
9. células em meio de cultura de 5 ml de re-suspender. Pipetar 200 ul de células no topo dos Eggcups ''.
   NOTA: Drop células como centrado possível no topo dos eggcups ", mas evitando o contato físico. Isto irá evitar a ruptura e / ou danos da amostra.
10. Centrifugar a 1.800 g durante 2 min.
    NOTA: Após a primeira centrifugação, o check-in de um microfoneroscope a porcentagem de preenchimento dos "eggcups '.
11. Pipeta novamente 200 uL de células em cima dos Eggcups 'e centrifugar a 1800 xg durante 2 min. Repetir para um total de três vezes, a fim de optimizar a percentagem de enchimento.
    NOTA: Após a última centrifugação, verifique com um microscópio a percentagem de enchimento do 'eggcups'. Se necessário, repita os passos de enchimento + centrifugação até atingir a porcentagem de preenchimento desejado.
12. Retirar a amostra do tubo utilizando as pinças cortantes, segurando a pega de PDMS. Certifique-se de ter cuidado em não as células 'perturbadoras' que são realizadas nos "eggcups '(ver Figura 2).
13. Colocar a amostra em uma placa de Petri com meio. Lavar para remover o excesso de células que não estão nas Eggcups '' por pipetagem para cima e para baixo três vezes, com cuidado ao lado de cada lado (no total 4 lados) da matriz microestrutura.
    NOTA: Pipetting muito forte pode liberaralgumas células fora dos "eggcups '.
14. Substituir o meio com meio fresco para remover as células nonattached.
    NOTA: Nesta etapa pode ser adicionado um medicamento de interesse.
15. Fix células ou prepará-los para time-lapse passo imaging.See 4.1.

3. Observação da dinâmica celular activa em "Eggcups ': Cytokinetic anel de fechamento

NOTA: Este exemplo usa células HeLa que são transfectadas com MYH10-GFP e Lifeact-mCherry para miosina e actina, respectivamente, as moléculas activas principais envolvidos no fecho do anel cytokinetic durante a mitose celular. O dispositivo é preparado com microcavidades de 25 um de diâmetro. Por sua observação, foi utilizado um microscópio invertido epifluorescência, equipado com uma objectiva de óleo 60X (1,40 NA, DIC, Plano de Apo) e GFP (miosina) e TxRed (actina) filtros. Alternativamente, foi utilizado um microscópio confocal vertical, equipado com um 25X ou 63X HCX IR APO objectivo L de água (0.95 NA). Para este EXAmple, é altamente recomendável para sincronizar as células usando o bloco timidina dupla, bloco mitótico ou mitótico método shake-off ^21-24.
NOTA: A espessura do PDMS utilizado para «Eggcups 'permite o uso de uma variedade de objectivos, tanto em microscópios invertidos e posicionado na posição vertical.

1. Lugar "eggcups 'em um suporte de microscópio e preenchê-lo com 1 ml de meio de observação de 10% FCS G-15. Para evitar a evaporação, colocar uma tampa de vidro no topo do suporte ou aplicar uma fina camada de óleo mineral no topo da medium.Select o objectivo óleo de 60X.
   NOTA: meio L-15 é adequado para não-CO ₂ atmosferas. Note também que alguns compostos de DMEM são auto-fluorescente. Quando se utiliza esta forma, recomenda-se a photobleach os compostos fluorescentes, iluminando-a com uma lâmpada de alta intensidade durante 1-2 horas.
   NOTA: Evite a utilização de tampas de plástico quando se trabalha com imagens DIC.
2. Coloque o suporte com 'eggcups' e obserforma vação ao microscópio. Concentre-se cuidadosamente usando a luz de campo claro até que as Eggcups '', e as células estão no mesmo plano de observação.
3. Abra o software e ajustar os parâmetros. Selecione os filtros TxRed e GFP para actina e miosina; ajustar o tempo de exposição para cada canal. Uma taxa de aquisição típico é de 5 segundos para ambos os canais.
   NOTA: O tempo de exposição pode ter de ser ajustada dependendo da configuração utilizada, corante ou outros organelos celulares de interesse.
4. Selecione a região de interesse e buscar um anel cytokinetic usando o GFP ou canal TxRed. Focar com precisão.
   NOTA: O anel é mais acentuada na miosina e mais fácil de reconhecer.
5. Executar a aquisição automática em ambos os canais até que o anel está completamente fechada.
   Nota: Alguns fotodegradação podem ser observadas. Ajustar os parâmetros de microscópio, a fim de reduzi-lo.

4. Observação de organelas celulares fixos nas 'Eggcups'

Este passo pode ser realizado antes ou após o passo 3 #. As células podem ser directamente fixo depois do passo de centrifugação e coradas para o organelo de interesse ou após a observação ao microscópio. Este exemplo mostra a coloração das fibras aparelho de Golgi, núcleo e actina em fibroblastos NIH3T3 em Eggcups ''.

1. Fixação de células no 'Eggcups'
   1. Prepare a 3% de paraformaldeído (PFA) e aquecido a 37 ° C. Retirar a amostra 'eggcups' a partir do tubo de 50 ml (ou titular do microscópio) e colocá-lo dentro de um P35 placa de Petri. Lavar uma vez com PBS 1x.
      NOTA: Os protocolos para a preparação de paraformaldeído a 3% são amplamente disponíveis em outro lugar.
      CUIDADO: Use luvas de borracha nitrílica e óculos de protecção durante a preparação da PFA.
   2. Remover completamente o PBS e soltar 1 ml de 3% PFA e incubar durante 17 min. Remover o PFA e lavar duas vezes com 1 ml de PBS 1X. permeabilizar as células com 1 ml de 0,5% Tritpor 3 min e lavar duas vezes com PBS 1x durante 5 min.
2. Coloração de células em '' Eggcups
   1. Incubar as células de coloração de Golgi com o anticorpo primário de coelho policlonal anti-Giantin em uma diluição de 1: 500 em PBS. Colocar uma gota 100 ul de solução de anticorpo para uma folha de película de plástico e incuba-se as células no interior dos Eggcups "de cabeça para baixo durante 45 minutos.
      NOTA: Proteger a amostra com uma tampa para evitar a secagem.
   2. Solte cuidadosamente os 'Eggcups' e colocá-los em uma placa de Petri P35. Lavar 3 vezes, 5 min cada, com PBS 1x.
   3. Prepare um coquetel em PBS com o anti-coelho anticorpo secundário de cabra Cy3 (1: 1.000) e com faloidina Alexa Fluor 488 (1: 200) para a coloração de fibras de actina estresse.
   4. Incubar as células com uma queda de 100 ul de solução de anticorpo para uma folha de película de plástico e incuba-se as células no interior dos Eggcups "de cabeça para baixo durante 45 minutos.
   5. Lançamento cuidadosamente o 'eggcups "e colocá-los em uma placa de Petri P35. Lavar 3 vezes, 5 min cada, com PBS 1x.
   6. Incubar as células de coloração núcleo colocando uma gota 100 uL de 1 ug ^mL1 DAPI em PBS para uma folha de película de plástico e incuba-se as células no interior dos Eggcups "de cabeça para baixo durante 45 minutos. Este passo pode ser realizado com o passo 4.2.3.
   7. Solte cuidadosamente os 'eggcups' e colocá-los em uma placa de Petri P35. Lavar 3 vezes, 5 min cada, com PBS 1x.
   8. células de montagem usando um Glicerol 15 mL: PBS (1: 1 v / v) numa lâmina de microscópio de vidro padrão e selar a amostra com unha polonês para evitar a secagem.
      NOTA: Dependendo da espessura 'eggcups', a montagem pode ser difícil. Recomenda-se, em seguida, para armazenar a amostra numa placa de Petri de P35 em PBS, protegido contra a secagem.
3. A observação ao microscópio
   NOTA: Para este exemplo um microscópio confocal na vertical é usado, equipados com detectores PMT e híbridos. Um ou 25X 63 X HCX IR APO objectivo L de água (0.95 NA) foi seleccionado para fornecer um campo largo da amostra e mostrar a aplicabilidade do aparelho para aplicações de rastreio de alto conteúdo.
   1. Selecione o objetivo 25X ou 63X de água.
      NOTA: objetivos diferentes podem ser usadas, dependendo da aplicação e do sinal. Mas o uso de objetivos elevados abertura numérica é recomendada.
   2. Colocar a amostra fixa com os 'eggcups' e se concentrar cuidadosamente usando a luz brightfield (contraste de fase ou DIC) até dos eggcups 'e células estão no plano de observação.
   3. Abra o software e ajustar os parâmetros. Selecione os filtros GFP, Cy3 e DAPI para actina, de Golgi e de observação núcleo, respectivamente; ajustar o tempo de exposição para todos os canais.
      NOTA: O tempo de exposição pode ter de ser ajustada dependendo da configuração.
   4. Selecionar e concentrar a região de interesse; iniciar a captura de imagem (veja a Figura 3).

TLE "> 5. Adaptação para a observação de células de levedura e C. elegans Embryo

1. As células de levedura de fissão e de brotamento
   NOTA: Este exemplo utiliza células de levedura de fissão que são marcadas com RLC1-mCherry e CHD-GFP para miosina e actina, respectivamente. As células de levedura de germinação não está marcado com fluorescência aqui. Para a observação levedura foi utilizado um giro confocal disco microscópio invertido. Um objectivo óleo 100X HCX PL APO CS (1,4 NA) foi utilizado para todas as aquisições. Alternativamente, as células também foram observadas utilizando um microscópio de contraste de fase invertida equipado com uma objectiva 20X ar contraste de fase LCPlanFl (0,4 NA). Neste exemplo, o protocolo é idêntico para os dois tipos de células.
   1. Preparar a superfície 'Eggcups' como descrito acima. Para fissão e células de levedura de germinação, preparar cavidades de 5 um de diâmetro (ver Tabela 1). Neste caso, a superfície não necessita de ser funcionalizado com proteínas de adesão.
      NOTA: O ca de enchimenton ser otimizado usando 'eggcups' cónicos. Esta forma captura e retém as células, evitando libertar durante o passo de enxaguamento após a centrifugação. Encher percentagem é óptima a cerca de 80%. Estes 'eggcups' cónicos podem ser fabricados por meio de Deep Reactive Ion Etching ^13.
   2. Cultura de células de levedura no meio de cultura apropriado (ver Tabela 1) até atingir uma densidade óptica (OD) na gama de 0,2 e 0,8. Sonicar a cultura de células de levedura para remover agregados.
   3. Inserir células de levedura em 'eggcups' por centrifugação. Por centrifugação, 4 ml de células cultivadas em a OD apropriada é adicionada ao tubo com Eggcups ''. Após a primeira centrifugação, agite o tubo com as células que não estão em dos eggcups 're-suspender, enquanto as células nas' eggcups 'não sejam perturbados. Sem abrir o tubo, centrifugar novamente e repita esta etapa duas vezes. Isto assegura a deposiçãodas células a partir da cultura nas microcavidades vazios e irá aumentar a percentagem de enchimento.
      Nota: Quando se trabalha com leveduras, recomenda-se pré-aquecer a centrífuga à temperatura de trabalho durante as experiências
      NOTA: O protocolo pode ser uma pausa aqui e continuou até 12 horas mais tarde. Neste caso, armazenar a amostra à temperatura de trabalho e cobri-lo para evitar a evaporação.
   4. Coloque 'eggcups' em um suporte de microscópio e preencher o suporte com meio filtrante esterilizada para a imagem latente. Agora lavar as células com o mesmo material até que as células de levedura flutuantes são removidos eficientemente. Tome cuidado para não perturbar as células em 'eggcups' durante o processo de lavagem.
   5. Selecione o objectivo de óleo 100X e concentrar-se cuidadosamente. Abra o software e ajustar os parâmetros. Para levedura, selecione a GFP filtros e TxRed para actina e miosina e ajustar o tempo de exposição para ambos os canais. A taxa de aquisição típico é de 3 segundos.
      NOTA: Dependendoo fluoróforo, tipo de marcação e o set-up, tempo de exposição varia para outros sistemas.
2. C. elegans Embrião
   NOTA: Este exemplo usa C. elegans embriões de 25-30 uM de largura e de 50-55 ^ m de comprimento. Os embriões foram cultivados, tal como indicado em ^25. Um protocolo visual simples de como manipular C. elegans pode ser encontrado em ^26. A observação foi realizada utilizando um microscópio de contraste de fase invertida equipado com uma objectiva 40X de ar 0,55 NA.
   1. Preparar a superfície 'Eggcups' como descrito acima, e de 25 um em diâmetro (ver Tabela 1). Neste caso, a superfície não necessita de ser funcionalizado com proteínas de adesão.
   2. Cultura do C. embriões elegans no meio de cultura adequado (ver Tabela 1).
   3. Insira embriões em 'eggcups' por centrifugação como descrito acima (ver secção 2,6-2,12) utilizando água ultrapura como meio de cultura.
      NOTA: Os embriões foram 'comportando «normalmente em água ultrapura durante a duração da experiência. Como alternativa, use um buffer M9 fisiológica para experimentos de longa duração.
   4. Lavar a amostra como descrito acima (ver secção 2.14). Coloque os 'eggcups' em um suporte de microscópio. Selecione o objetivo de ar 40X e concentrar-se cuidadosamente. Abra o software e ajustar os parâmetros. Selecione uma taxa de aquisição de 3 seg.

Resultados

Dos eggcups »(CE) são uma metodologia de alto teor-triagem romance que permite a visualização de células orientadas e embriões em um ambiente 3D. Além disso, alguns processos celulares, que são difíceis de observar em culturas 2D padrão (planas), pode ser observada por este novo método. A Figura 1a mostra um resumo do processo de microfabricação CE (ver também a secção 1 em o protocolo acima descrito ). O método é simples, rápido, eficiente e sem qualquer exigência de equipamentos es...

Discussão

moldagem réplica foi utilizado a fim de fabricar os Eggcups ''. O processo de fabricação não precisa de uma sala limpa; é fácil e simples, embora alguns prática pode não ser necessária. Em particular, libertando o selo PDMS é a etapa mais importante, a fim de produzir uma grande área de '' Eggcups alta qualidade. Por esta razão, um cuidado especial tem de ser tomada neste passo. Se essa etapa for repetidamente falhando, considere para otimizar os parâmetros do plasma mais limpos antes da sil...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2