Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Resumo

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the Apc^Min/+ colorectal cancer model.

Resumo

Células mielóides são as células do sistema imunológico mais abundantes e dentro de tumores têm sido mostrados para promover a progressão do tumor. Técnicas de imagem intravital modernos permitem a observação do comportamento celular ao vivo dentro do órgão, mas pode ser um desafio em alguns tipos de câncer devido ao órgão e tumor acessibilidade, tais como intestino. A observação direta de tumores intestinais não foi previamente relatado. Um procedimento cirúrgico descrito aqui permite a observação direta da dinâmica de células mielóides dentro dos tumores intestinais em ratos vivos, utilizando camundongos transgênicos repórter fluorescente e traçadores injectáveis ​​ou anticorpos. Para este propósito, um de quatro cores, multi-região, com lentes de micro-disco giratório microscópio confocal que permite imagens contínuo a longo prazo com a aquisição de imagem foi usada rápida. Apc ^{Min / +} ratinhos que desenvolvem adenomas múltiplos do intestino delgado são cruzados com ratos c-fms-EGFP para visualizar as células mielóides e com camundongos ACTB-ECFPpara visualizar as células epiteliais do intestino das criptas. Procedimentos para a marcação de diferentes componentes, tais como tumores, vasos sanguíneos e neutrófilos, e o processo para o posicionamento do tumor para a imagiologia por meio a superfície serosa também são descritos. Filmes time-lapse compilados a partir de várias horas de imagens permitem que a análise do comportamento de células mielóides in situ no microambiente intestinal.

Introdução

Evidência esmagadora demonstra agora que o microambiente do tumor, consistindo em populações celulares heterogéneas, incluindo fibroblastos, células endoteliais, células imunitárias e inflamatórias, matriz extracelular e factores solúveis, desempenha um papel crucial na iniciação e progressão de tumores sólidos, contribuindo para quase todos características de câncer ^1. Com efeito, durante a progressão do tumor, há interações dinâmicas constantes entre as células cancerosas transformadas e células do estroma que evoluem para gerar um microambiente favorável à malignidade ^2. Entre as células do sistema imunológico que se infiltram no microambiente do tumor, as células mielóides são os mais abundantes ^3. Consistindo de macrófagos associados a tumores (TAM), células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs), células dendríticas (DC) e de neutrófilos (PMNs), as células mielóides são recrutadas a partir da medula óssea e infiltrar progressivamente tumores, libertando citocinas, factores de crescimento e proteases que pode promovercrescimento do tumor e se espalhar ^4. A interferência entre células cancerosas e células mielóides é complexo, mas dinâmico. Assim, a compreensão da natureza de suas interações é crucial para determinar por que essas células promovem a progressão do câncer, em vez de participar de uma resposta imune anti-tumor, e pode ajudar a encontrar novos alvos para controlá-lo.

A observação direta por microscopia intravital fornece informações sobre a dinâmica de células dentro dos tecidos de camundongos ao vivo ^5. A quatro cores, multi-região, disco giratório com lentes micro-sistema confocal foi projetado para estudar células estromais dentro de tumores mamários ^6. Esta abordagem permite a imagiologia contínua a longo prazo e inclui várias vantagens, tais como: (a) de aquisição de imagens rápidas para minimizar artefactos de movimento, (b), a anestesia de longo prazo, (c) quatro aquisição de cor a seguir diferentes tipos de células, (d) marcação fluorescente de diferentes componentes tumorais, e (e) a observação de diferentes microambientes tumorais sagacidadehin o mesmo mouse para evitar mouse para variabilidade rato ^7-9. Com esta tecnologia, os diferentes comportamentos de células têm sido relatados no vírus do tumor mamário de modelo (MMTV) polioma meio conduzido pelo promotor T oncogene (Pymt) que mostra as fases progressivas da tumorigénese. Os linfócitos T reguladoras (Treg, visualizadas pelo transgene Foxp3 ^EGFP) migram preferencialmente na proximidade dos vasos sanguíneos que o DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblastos associada a carcinoma (FSP1 ^{+ / +} -EGFP) e células mielóides (c-fms -EGFP) exibem maior mobilidade na periferia do tumor do que no interior da massa do tumor. Na condição de hipóxia sistémica aguda, as células migraram de forma diferente: Tregs parar a migração em contraste com as células mielóides que continuam a mover-se ^6. Além disso, no mesmo modelo de rato, demonstrou-se que as alterações de sensibilidade com doxorrubicina fase do tumor, a distribuição da droga está relacionada com a resposta a fármacos, e doxorrubicinatratamento conduz ao recrutamento dependente de CCR2 de células mielóides ao tumores. Assim, imagens ao vivo também pode ser usado para obter insights sobre as respostas de drogas no local e na biologia do chemoresistance ^10,11.

Polipose adenomatosa coli (APC) mutações genéticas ocorrem geralmente em adenomas colorretais humanos e carcinomas ¹² e mutação de uma única cópia dos resultados gene APC em polipose adenomatosa familiar (FAP), o que confere um risco extremamente elevado para câncer de cólon ^13. A estirpe de ratinhos Apc ^{Min / +} carrega uma mutação no códon 850 truncamento do gene APC e desenvolve espontaneamente várias adenomas intestinais em todo o intestino delgado ^{de 14 16.} Imagens intravital longo prazo do intestino é difícil por causa da capacidade de invasão do procedimento, uma vez que a abertura da cavidade peritoneal, é necessária para o acesso ao intestino. Imagens ao vivo de curto prazo ruaudies ter sido previamente publicada no intestino saudável ^17,18, mas a observação direta de longo prazo de tumores intestinais não foi relatado. Um procedimento cirúrgico foi concebido e aperfeiçoado para visualizar tumores através da superfície serosa do intestino, usando o sistema de microscopia intravital fiação disco previamente utilizado para tumores mamários ^6,10 imagem. Neste artigo, é descrito um protocolo que permite que se siga o comportamento de células mielóides no interior dos tumores do intestino delgado, utilizando Apc ^{Min / +} mice.

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC), UCSF. Todos os experimentos com imagens eram procedimentos não-sobrevivência e os animais foram sacrificados imediatamente após o final da aquisição da imagem.

1. geração de camundongos

NOTA: Apc ^{Min / +,} ratinhos portadores de uma mutação no gene APC, desenvolvem espontaneamente 50-100 adenomas do intestino delgado.

1. Cruz Apc ^{Min / +} ratinhos com a linha de ACTB-ECFP, ECFP que expressa sob o promotor de actina, e ainda com a linha de c-fms-EGFP, que expressa EGFP sob o promotor de c-fms para detectar as células mielóides. Animais heterozigóticos para ACTB-ECFP e c-fms-EGFP são utilizados para detectar a fluorescência.
2. Use camundongos em 3-4 meses de idade a imagem adenomas claramente detectáveis.

2: Preparação de Materiais antes da cirurgia

NOTA: Os detalhes do microscópio set-up ter sido anteriormente descrito ^6,7.

1. Microscópio
   1. Ative o cobertor térmico. Ligue o laser de argônio para 488 nm de excitação e de estado sólido de 405 nm, 561 nm e 640 nm lasers. Ligue o microscópio, a unidade de controlo de disco giratório, a AOTF, a unidade de controlo do laser, e do controlador da câmara.
   2. Abra o obturador microscópio, que transforma o LED vermelho. Ligue o computador e câmera de software.
2. Plataforma de Imagem
   1. Certifique-se de que a inserção palco é limpo. Caso contrário, limpe com água e sabão e depois seque.
   2. Tome duas lamelas e usar fita laboratório para fixá-los na inserção. Coloque a inserção no palco e limpe-o com algodão embebido em álcool.
   3. Usando fita laboratório, anexar a manta de aquecimento para o lado direito do palco.
   4. Verificar a integridade da membrana de borracha sobre o cone de nariz e que se mudam necessary. Posição e fixar o cone do nariz para entrega anestesia isoflurano ao animal usando gaze e fita de laboratório.
3. O isoflurano anestesia Sistema
   1. Encher o tanque de isoflurano.
   2. Ligar o vácuo e ajustar para 1,2 L / min.
   3. Adicione água destilada até o nebulizador e ligar o nebulizador para o sistema de isoflurano.
   4. Ligue o analisador de oxigênio e conectá-lo ao sistema de isoflurano. Ligue o tanque de oxigênio e garantir que o analisador de oxigênio mostra 100%. Ajustar o fluxo de O ₂ a 0,2 L / min.
   5. Ligue o tanque de nitrogênio e ajustar o fluxo de 0,8 L / min. Verifique se o analisador de oxigênio mostra 21%.
4. Preparação de Ferramentas de Cirurgia e Plataforma
   1. Limpe duas pinças e tesouras de dissecação com água e sabão.
   2. Ligue o esterilizador talão quente e deixá-lo chegar a 250 ° C. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos para 30 seg. Deixe-os esfriar.
   3. Coloque uma imersão laboratório no banco cirurgia.
   4. Use uma tampa de isopor como uma plataforma cirúrgica. Cubra com um pedaço de laboratório de imersão. Prepare um segundo pedaço de laboratório giratória para mudar após o barbear o mouse.
   5. Coloque o cone do nariz com a linha de anestesia na tampa de isopor coberto, e anexá-lo para a tampa de isopor (não no laboratório de imersão) com alguma fita e usar duas agulhas em ambos os lados do cone do nariz para mantê-lo no lugar.
   6. Montar betadine, toalhetes com álcool, gaze estéril, super cola, lâminas de microscópio, barbeador elétrico, e quatro pedaços de fita de laboratório.

3 Preparação de Injeções

1. Sob o capô, preparar uma seringa de insulina (28 G x ½ cm), com 7 ul de estoque AF647 conjugado Ly-6G (Gr1) anticorpo (1 mg / ml) em 100 ul de 2000 kDa rodamina-dextrano (4 mg / ml ) para injecção retro-orbital. Injeção retro-orbital é recomendado na APC ^{min / +} camundongos desde anemia que se desenvolve nesses animais faz com que o difficu veias da caudalt para detectar através da pele.
2. Prepara-se uma segunda seringa de insulina com 1 mg / kg de atropina diluído em 150 ul de PBS por via subcutânea (sc) de injecção antes de imagem para amortecer movimentos peristálticos do intestino.

4 Preparação do Intestino for Imaging

1. Verifique se a linha de anestesia para a câmara de indução está aberto, e as linhas para a mesa cirúrgica e microscópio estão fechados.
2. Transferir o animal à câmara de anestesia. Fechar a câmara de anestesia e ligar o isoflurano a 4% (com O ₂ 21%).
3. Quando o mouse respira profundamente e lentamente (após 5-6 min), transferi-lo para o estágio cirúrgico no seu flanco e injetar a solução de anticorpos Gr1 e / ou solução de dextrano retro-orbital.
4. Abrir o tubo de anestesia ligada à plataforma cirúrgica. Feche a linha para a câmara de anestesia e coloque o mouse sobre a sua volta com seu nariz no cone anestesia.
5. Reduzir o isofluranoconcentração de 4% a 2,5%.
6. Verifique se o mouse é bem anestesiados por beliscar a sua pata e teste do reflexo corneal.
7. Adicionar oftálmica pomada lubrificante nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
8. Prenda os membros do mouse para o estágio cirúrgico, acrescentando fita laboratório.
9. Remover os pêlos da superfície ventral usando um barbeador elétrico. Também remova o cabelo da pata traseira esquerda para posicionar o oxímetro antes da aquisição. Retire a imersão laboratório a partir da fase cirúrgica e substituir por uma limpa para evitar a contaminação de cabelo.
10. Desinfetar a superfície ventral com algodão embebido em álcool e betadine.
11. Injectar a solução de atropina (de 3,2) sc em um flanco do mouse.
12. Adicione de 1 cm ventral incisão na linha média através da pele e do peritoneu com uma tesoura e por um par de pinças. Retire cuidadosamente 3-4 cm de intestino e identificar um ou vários tumores de imagem.
13. Tome um copo de MICRoscope corrediça e a posição de uma linha de assinante do intestino em que com um tumor no topo.
14. Adicione um pouco de super cola para alguns locais ao longo do intestino para anexá-lo ao slide. Esperar um minuto para a cola secar. Usar um marcador para desenhar uma linha sobre a lâmina apontando para o tumor de modo a facilitar a sua localização com o confocal.

5. posicionar o mouse no Palco e Preparação para Aquisição de Imagem

1. Retire a fita de laboratório de membros.
2. Abrir o tubo de anestesia para a fase de microscópio e fechar a uma plataforma para o cirúrgico.
3. Transferir o mouse com cuidado para o estágio do microscópio com o lado ventral para baixo e seu nariz no nariz do avião. Prenda a linha de anestesia com alguma fita laboratório.
4. Re-posicione o mouse e / ou o slide, a fim de ter o intestino no centro de uma das janelas caiu de cobertura. Gentilmente fita para baixo o slide com fita laboratório.
5. Fixe a sonda oxímetro no membro esquerdo do mouse parasiga seu coração e níveis de taxas e de saturação de oxigênio arterial respiratórias.
6. Cubra o mouse com a manta de aquecimento para evitar a hipotermia.
7. Diminuir a concentração de isoflurano de 2,5% para 1-1,5% para exames.

6 Aquisição de imagens usando o μManager Software

1. Aumente a velocidade CSUX a 2.500 rpm para melhorar a qualidade da imagem nas definições de configuração.
2. Use o menu suspenso para escolher Objetivo 10X 0,5 NA ou 20X 0,75 NA Fluar da lente objetiva.
3. Escolha o laser de 405 nm menu dropdown Color.
4. Clique na Live e ajustar o foco com o microscópio.
5. Clique em Auto para ajustar automaticamente intensidades máximas e mínimas de pixel da imagem de exibição com base nos valores de pixels extremos da imagem. Um histograma de intensidade dos pixels da imagem da tela é apresentada no gráfico na parte inferior da janela principal.
6. Ajuste a exposição da câmera na janela do Painel de Controle Piper poralterando o número de relógios (um relógio é 33,333 ms).
7. Se o sinal estiver muito brilhante com a menor exposição, diminuir a intensidade do laser, usando a unidade de controle do microscópio.
8. Verifique a intensidade do sinal para 488 nm, 561 nm e 640 nm linhas de laser. Ajustar a intensidade do laser com a sua própria unidade de controlo do laser de (488 nm e 561 nm) ou a unidade de controlo do microscópio.
9. Na janela de multi D Aquisição, marque a caixa pontos Tempo e digitar o número de pontos de tempo e intervalo de tempo desejado.
10. Verifique a caixa de Z-pilhas, escolha "Z relativa" e definir Z-start e Z-final em relação à posição atual.
    NOTA: Para 10X ou 20X objetivo, comece com 3 planos Z, 8 m ou 4 mm para além respectivamente.
11. Marque a caixa Várias posições (XY) para geração de imagens de vários locais, em seguida, clique em Editar lista de posição, marcar 4-6 posições diferentes.
12. Verifique a caixa de Canais e adicionar canais de Novo e selecione lasers linhas do menu suspenso e tipe em exposição para cada canal (em múltiplos de 33,333 ms).
13. Verifique Salvar imagens na janela "aquisição multi D".
14. Selecione uma pasta e todas as imagens adquiridas serão automaticamente salvos nesta pasta com o prefixo do nome dado.
    NOTA: Cada aquisição contínua será salvo em uma subpasta separada, como arquivos TIFF individuais para cada fatia Z em cada cor em cada ponto de tempo.
15. Salve todas as configurações clicando em Salvar configurações na janela de multi D Aquisição.
16. Clique em Obter na janela de aquisição do Multi-dimensional para começar a aquisição.
17. Se a sonda oxímetro não é usado ou pára de funcionar bem (quando pulso não é estável ou difíceis de detectar), verificar a eficiência da anestesia a cada 15 minutos durante o procedimento de imagem por beliscar a pata e verificar o reflexo corneal. Ajuste as anestesia se o mouse é sensível a estes estímulos.
18. Após a aquisição, a eutanásia o mouse, aumentando a concent isofluranoração de 5%. Quando há movimentos respiratórios são detectáveis, retire o mouse do palco e realizar um deslocamento cervical.

7 Análise de imagens usando o Imaris Software

1. Conversão para .IMS Arquivos (Recurso Figura 1A)
   1. Abra o software da câmera, clique em Arquivo, em seguida, o conversor de grupo.
   2. Clique em Adicionar arquivos e escolha o primeiro arquivo da primeira posição. Repita o procedimento para cada posição.
   3. Para cada arquivo carregado, clique em Configurações e verifique se as configurações de "t" para o tempo, "c" para os canais e "z" para Z-stacks aparecem nessa ordem.
   4. Salve na pasta desejada. Navegar e criar um novo arquivo convertido.
   5. Clique em Set para todos e Start.
2. Ajustes (Recurso Figura 1B)
   1. Vá para a pasta convertido específico e abrir o primeiro arquivo.
   2. Na janela de Ajuste Display, ajustar o fundosinal de corte, modificando o número mínimo para cada canal, se necessário.
   3. Se necessário, ajustar a intensidade do sinal através da modificação do número máx (quanto menor o número máximo, maior é a intensidade do sinal).
      NOTA: Os ajustes do sinal de intensidade / contraste permitir o destaque de um comportamento de célula ou um compartimento para ter uma visualização mais agradável. Isso não muda o resultado em si.
   4. Clique em Editar e Imagem em Propriedades.
   5. Mudar as x, y, e z (valores para uma objectiva 10X, x e y = 0,712, z = 8 um, por uma objectiva 20X: x e y = 0,36, z = 4 mm).
   6. Clique em Todos os Eqüidistante para ajustar pontos de tempo. Adicione a data de início ea hora de início da aquisição. Adicione a data final e hora final da aquisição (Figura 1C Suplementar).
   7. Clique no botão Play para assistir ao filme.
   8. Clique em Editar e excluir pontos de tempo para apagar as imagens borradas.
   9. Para juntar duas aquisições separadas together em um filme, ir para o último instante do primeiro filme e clique em Editar> Adicionar pontos de tempo para adicionar o segundo arquivo.
3. Salvando como um filme (Figura 1D Suplementar)
   1. Clique na Record, escolha a extensão mov e um factor de compressão de 0.
   2. Clique em Salvar.

Resultados

Usando fiação de microscopia confocal de disco, tecidos não tumorais e tumorais no intestino delgado de Apc ^{Min / +;} ACTB-ECFP; ratinhos c-fms-ECFP pode ser visualizada a partir da superfície serosa. Depois de imagem, software da câmera é usada para analisar e ajustar a aquisição (Figura Complementar 1). Após a administração intravenosa (iv) injecção de 2.000 kDa fluorescente rodamina-dextrano e um anticorpo conjugado Ly-6G 647, vasos sanguíneos e PMN ...

Discussão

Neste trabalho, um protocolo detalhado é descrito por disco giratório de imagem confocal da dinâmica de células mielóides em tumores intestinais por várias horas em um animal vivo, fotografada do lado da serosa do intestino.

Para evitar a inflamação e a ter condições fisiológicas óptimas, a imagiologia do intestino tem que ser feito no órgão intacto. No entanto, a imagem do lado da serosa do intestino é difícil, uma vez que a luz tem de passar através de diferentes camadas d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ApcMin/+ mice	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
Nitrogen	UCSF
Oxygen	UCSF
1x PBS	UCSF cell culture facility
Saline Buffer	UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse
Atropine	LARC UCSF		Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes	Becton Dickinson	326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe	Becton Dickinson	329465
Remium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5M	24x50-1
Betadine	LARC UCSF
Heat blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch	Electron Microscopy Sciences	72310-10
Anesthesia system	Summit Anesthesia Support
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
Stage insert	Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit Anesthesia Support
Imaris	Bitplane
μManager	Vale lab, UCSF		Open-source software
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b