Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Resumo

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Resumo

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido. O potencial de ação dirigido influxo de Ca2 ⁺ para o terminal pré-sináptico, através de canais de cálcio dependentes da voltagem (VGCCs) localizados na membrana rosto lançamento, é o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores. Crucial para a rapidez da transmissão sináptica é a sincronia espacial e temporal entre a chegada do potencial de acção, e a maquinaria VGCCs a libertação de neurotransmissores. A capacidade de gravar diretamente de Ca2 ⁺ correntes da membrana rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais é imprescindível para uma compreensão precisa da relação entre pré-sináptica de Ca2 ⁺ e liberação de neurotransmissores. Acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica para a gravação eletrofisiológico ainda não está disponível na maioria das preparações e Ca ^{2 +} entrada pré-sináptica tem sido caracterizada utilizando técnicas de imagem e MeasureMe atual macroscópicoNTS - técnicas que não têm resolução temporal suficiente para visualizar Ca2 ⁺ entrada. A caracterização de VGCCs diretamente nos terminais pré-sinápticos individuais não foi possível nas sinapses centrais e, até agora, foi alcançado com sucesso apenas no tipo cálice sinapse do gânglio ciliar e pinto em cálices de ratos. Temos abordado com sucesso este problema na sinapse reticuloespinhal gigante da lampreia medula espinhal através do desenvolvimento de uma preparação agudamente dissociada da medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de estruturas pós-sinápticos. Podemos fluorescently rotular e identificar terminais pré-sinápticos individuais e orientá-las para a gravação. Usando esta preparação, caracterizamos VGCCs diretamente para o rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais usando imunohistoquímica e eletrofisiologia abordagens. Ca2 ⁺ correntes foram registrados diretamente na membrana o rosto liberaçãoterminais pré-sinápticos individuais de f, o primeiro registo a ser realizada nas sinapses centrais.

Introdução

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido e preciso. Ação potencial invasão do terminal pré-sináptico leva à abertura de VGCCs localizados na membrana rosto liberação, o aumento resultante na pré-sináptica de Ca2 ⁺ age como o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores ^1. Todos estes passos ocorrem dentro de centenas de microsegundos ^2, e, portanto, requerem acoplamento espacial de VGCCs apertado para a vesícula máquinas de fusão ^3. Pré-sinápticos de Ca2 ⁺ fluxos têm sido caracterizadas principalmente por meio de imagens abordagens utilizando Ca2 ⁺ corantes sensíveis ^4. Incorporando ^Ca2 tampões que modulam Ca2 ⁺ nos neurónios pré-sinápticos tem sido utilizado para caracterizar indirectamente a relação entre o cálcio pré-sináptico e a neurotransmissão ^3. Além disso, a modulação da pré-sináptico livre concentração de Ca2 ⁺ por uncaging Ca2 ^{+ 5} ou gravação macroscopic correntes de Ca2 ⁺ têm sido utilizados em conjunção com medidas de fusão e / ou a libertação de vesículas; como medidas de capacitância ⁶ ou pós-sinápticos respostas ² para abordar a mesma questão. No entanto, a caracterização de Ca2 ⁺ correntes directamente na face de libertação, a secção especializada da membrana pré-sináptica, onde a despolarização da membrana é convertida em Ca ^{2 +} correntes provocando a fusão das vesículas sinápticas e a libertação de neurotransmissores, é essencial para se obter uma medida precisa do ^Ca2 requisito para a fusão das vesículas sinápticas. Além disso, a capacidade de caracterizar directamente as correntes de Ca2 ⁺ nos terminais pré-sinápticos individuais, acoplado com medições simultâneas precisos de fusão das vesículas e libertação permite uma elucidação preciso da relação de temporização entre o curso do tempo da acção potencial, pré-sináptico corrente ^{2 +} Ca, fusão das vesículas e liberação. Acesso à membrana rosto liberaçãonão está disponível na maior parte dos terminais pré-sinápticos, devido a fechar por aposição dos dendritos pós-sinápticos. Esta inacessibilidade tem sido um grande obstáculo na caracterização de VGCCs uma vez que impede medidas diretas de corrente nos terminais pré-sinápticos individuais. Caracterização direta de pré-sinápticos Ca2 ⁺ correntes nos terminais pré-sinápticos individuais, até agora, não foi possível nas sinapses centrais e só foi alcançado em dois terminais pré-sinápticos do tipo coletor; cálice do tipo sinapse do pinto gânglio ciliar ^7-10 e rato calyces ^11,12. Em todos os outros terminais pré-sinápticos, incluindo a sinapse reticuloespinhal gigante na lampreia medula espinhal ^13, a falta de acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica exigiu o uso de abordagens indiretas, tais como Ca2 ⁺ radiológico para o estudo pré-sinápticos de Ca2 ⁺ fluxos.

Figura 1 lampreia sinapse reticuloespinhal gigante. (A) Secção transversal da lampreia medula espinhal indicando orientação dorso-ventral. Axônios reticulospinais são marcadas com asterisco verde. (B) reconstrução 3-D da sinapse reticuloespinhal na lampreia medula espinhal mostrando axônio pré-sináptico reticuloespinhal fazendo numerosos en passant contatos (marcado por setas verdes) sobre o neurônio pós-sináptico ^13. Terminais pré-sinápticos têm sido marcados com Alexa Fluor 488 conjugado com hidrazida faloidina (verde), enquanto que o neurónio pós-sináptico foi preenchido com Alexa Fluor 568 hidrazida (vermelho).

Lampreia gigantes axônios reticulospinais, localizado na região ventral da medula espinhal paralelo ao eixo Figura 1a rostral-caudal, forma múltipla en passant contatos sinápticos em neurônios doespinhal chifre ventral ¹⁴ Figura 1b ^13. De célula inteira macroscópica ^Ca2 correntes foram registadas a partir de axônios reticulospinais na medula espinhal intacta ^13,15. No entanto, tentativas anteriores para cegos medição directa de correntes de Ca ^{2 +} em axónios reticulospinais na medula espinhal lampreia intacto usando ligado de células técnica de fixação de membranas ^13, não têm tido sucesso, devido à falta de acesso à membrana cara de libertação pré-sináptica devido aos processos de pós-sinápticos opostas Figura 1b. A membrana de libertação cara tenha sido previamente tornado acessível pela remoção do neurónio pós-sináptico ^11, perturbação mecânica da sinapse antes da gravação de ¹² ou tratamento enzimático acoplado com dissociação mecânica ^16. Dada a complexa organização da medula espinhal, que seria extremamente difícil identificar o neurônio pós-sináptico e recolhê-lo mecanicamente ou perturbar ªe sinapse. Por isso, decidimos usar o tratamento enzimático ¹⁷ seguido de dissociação mecânica.

Usando essa abordagem, temos desenvolvido uma preparação profundamente dissociada da lampreia medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados viáveis ​​com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de quaisquer processos de pós-sinápticos, proporcionando assim o acesso irrestrito aos terminais pré-sinápticos individuais. Em conjunto com um microscópio invertido padrão e imagens de fluorescência, que nos permite identificar e alvejar terminais pré-sinápticos fluorescente identificados individualmente, com uma pipeta de patch que contém uma solução de gravação que isola as correntes de Ca2 ⁺ 4c figura e Figura 4d, para gravar utilizando célula- ligado técnica tensão-grampo. Ca2 ⁺ correntes foram registrados diretamente na membrana rosto liberação pré-sináptica de indivíduo terminais pré-sinápticos Figura 4f. Este é um significant avanço no campo da transmissão sináptica, uma vez que é o primeiro exemplo de gravação a ser realizada nas sinapses centrais.

Protocolo

1: Preparação de poli-D-lisina Hydrobromide

1. Prepare 1 mg / ml de bromidrato de poli-D-lisina em tampão borato 0,1 M (pH 8,5).
2. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.

Revestimento 2 Poli-lisina de Lamelas

Nota: Executar todas as etapas de limpeza e revestimento em uma câmara de fluxo laminar.

1. Coloque lamelas em uma placa de Petri contendo 1 N de ácido clorídrico (HCl) durante 2 horas.
2. Aspirar todo o HCl e enxágüe com 70% de etanol (EtOH) 2-3x.
3. Deixar em EtOH a 70% durante 1 hora.
4. Aspirar todo o etanol 70% e enxágüe com 100% EtOH 2-3x.
5. Deixar em EtOH a 100% durante 2 horas. Aspirar todo o EtOH.
6. Secar com papel de filtro e secar ao ar durante alguns segundos.
7. Colocar N em 1 mg de solução de poli-lisina / / ml de S.
8. Lavar lamelas dia seguinte com Millipore 4-5x água.
9. Ar seco poli-lisina sobre lamelas de vidro revestidas em rolos de uma caixa de Petri limpa.
10. Para immunohistochemistry, utilizar 35 × 10 mm tampas prato Petri. Prepare Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) alinhado pratos vertendo PDMS (elastómero e agente de cura de 10: 1, em peso) para o prato com uma espessura de 0,3 cm, e deixar solidificar a 30 ° CO / N. Uma vez que este se pôs, cortar dois centímetros por 1 centímetro talhado no PDMS. Limpar e revestir a inserção com poli-lisina, seguindo os mesmos passos como mencionado acima para lamelas.
11. Armazenar poli-lisina lamelas revestidas e pratos cobertos para dentro da câmara de fluxo laminar, até à sua utilização (cerca de 2 semanas, mas obter melhores resultados através da preparação de adesivos, periodicamente a cada 3-4 dias).
12. Prepare um bloco de PDMS, para fixar a medula espinhal no fatiador de tecido vibrando. Elastómero Mistura A e B de elastómero 1: 1 em peso. Verte-se uma placa de Petri de 100 x 15 mm e permite fixar O / N a 30 ° C. Corte um pedaço retangular do PMDS e cola-lo para a placa de base de corte com cola epóxi. Permitir que a cola para definir que fixa os PDMS no lugar e cortar várias seções finas na superfície para obter um apartamentosuperfície para fixar o tecido no.

3. aguda dissociação da Lampreia Medular para produzir isolados reticulospinais Axons

1. Anestesiar um ammoecoete ou adulto lampreia (Petromyzon marinus) com metanos tricaina (MS-222; 100 mg / L). Adicionar anestésico dentro da água, em um copo de plástico coberto por uma tampa, contendo a lampreia para ser sacrificado.
2. Decapitar lampreia em frio (4 ° C) solução de Ringer com a seguinte composição (em mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 de _CaCl2, 1,8 de _MgCl2, 4 de HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) e remover o corpo músculos da parede para expor a superfície dorsal da espinal-medula.
3. Remover meninge Primitiva a partir da superfície dorsal da medula espinal utilizando fórceps finos. Não retire ventral Primitiva meninx nesta fase.
4. Corte medula espinhal em um centímetro peças longas.
5. Fixar um pedaço da medula espinhal usando finas pinos de insetos, lado dorsal voltada para cima, em um PDMS forrado cortar pla base dete (ver 2.12) numa câmara de tecido de vibração fatiador contendo a solução de Ringer com gelo.
6. Retirar uma secção central da coluna dorsal da espinal medula por corte ao longo do eixo rostro-caudal com a lâmina, deixando para trás secções da coluna dorsal intactas no rostral e caudal termina para servir como lida durante o processo de dissociação Figura 2a e a Figura 2b. Use configuração de velocidade mais lenta que permite cortar e uma configuração de profundidade que remove apenas a coluna dorsal deixando a coluna subjacente axônio reticuloespinhal Figura 2b sem danos.
7. Incubar cortados pedaços da medula espinal, à TA, durante 45 minutos, em uma mistura de 1 mg / protease ml (Tipo XIV a partir do Streptomyces griseus) e 1 mg / ml de colagenase preparado (Tipo IA a partir de Clostridium histolyticum) em solução de Ringer (adaptado a partir de El Manira & Bussières , 1997 17).
8. Pedaços da medula espinhal Pin tratado com enzimas que utilizam pinos finos em um PDMS forrado Petri Conta pratoining solução de Ringer frio (4 ° C).
9. Remover ventral Primitiva meninx com uma pinça fina.
10. Cortar extensões laterais da medula espinal, com uma lâmina de bisturi, no ponto médio da secção dorsal cortado deixando a coluna central do axónios reticulospinais intactas na medula espinhal A Figura 2d.
11. Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lente.
12. Coloque a lamela poli-lisina revestido (Figura 3a, parte superior, retângulo vermelho) na ranhura da câmara de gravação Figura 3 e aplique graxa de vácuo para todas as bordas (espaço entre os retângulos vermelhos e azuis na Figura 3a, a fim de facilitar um selo. Parafuso o top no lugar. Coloque a câmara na inserção no equipamento de gravação.
13. Adicionar a solução de Ringer na câmara de gravação, utilizando uma pipeta Pasteur.
14. Conecte o tubo de saída do frasco contendo solução anticongelante pressão para o tubo de entrada de dispositivo de resfriamento termoelétrico. Conecte o output tubagem do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico para a extremidade de entrada da camisa de arrefecimento externo e a extremidade de saída do reservatório para a Figura 3b.
15. Coloque um pedaço de medula espinal de cada vez na câmara de gravação e separar cuidadosamente a medula espinhal mantê-la ao longo da lamela em todos os momentos, utilizando fórceps revestidos de Teflon, até axônios são isolados Figura 2e e na Figura 2f.
16. Traga a temperatura da solução de gravação e 10 ° C, passando o pressurizado (gás de azoto é empurrado para dentro do frasco) de solução de anticongelante (por deslocamento), por intermédio do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico, através da camisa de arrefecimento exterior da câmara de gravação Figura 3b.
17. Permitir axónios para se recuperar por 1 h após a dissociação, a 10 ° C.

Figura 2 Representação esquemática do protocolo de dissociação para o isolamento dos axônios reticulospinais. (A) A remoção da coluna dorsal. A seta indica a direcção de corte do tecido. Os cornos dorsais são marcados pelo alfabeto D (cor da fonte vermelho), enquanto os cornos ventrais de o alfabeto V (cor fonte vermelha) (b). Coluna dorsal removida na porção central da medula espinhal expondo os axónios reticulospinais (linhas verdes ). Os cornos ventrais, que permanecem intactos após o processo de corte, são marcadas pelo alfabeto V (cor de fonte vermelha). (C) o tratamento de 45 minutos com protease e colagenase enzimas cocktail (1 mg / ml). (D) Corte de extensões laterais da medula espinal; indicando a posição, a direcção e extensão do corte lateral. (e) dissociação mecânica da medula espinhal. As setas indicam a posição do fórceps e direção da força de separação durante a dissociação. (F) Representative exemplo de preparação dissociada axônio reticuloespinhal. Setas verdes marcar regiões de axônios reticulospinais agudamente dissociadas sem quaisquer processos pós-sinápticos.

Figura 3 Esquema de câmara para experimentos de eletrofisiologia gravação. Dimensões fornecidas são em polegadas. Retângulo vermelho mostrado no diagrama basepiece (a) indica o posicionamento da lamela no sulco lamela no basepiece. A região entre o rectângulo vermelho e azul, mostrado no diagrama basepiece (a) é o local onde está aplicado o lubrificante alto vácuo. (B) mostra a câmara de gravação montadas.

4. rotulagem e identificação dos terminais pré-sinápticos com FM 1-43

1. Rotular terminais pré-sinápticos, incorporando FM 1-43 em vesicles durante sináptica exo-endocitose durante a alta K + despolarização. Perfundir preparação com 5 uM de FM 1-43 (em 5 ml de solução de Ringer contendo KCl 30 mM).
2. Perfundir preparação com 1 mg / ml ADVASEP-7 (em 5 ml de solução de Ringer), para remover o excesso de corante FM) ^18.
3. Perfundir preparação, com a solução de Ringer durante 15 min à lavagem e qualquer corante Remant o ADVASEP.
4. Imagem com 100 X lente de imersão em óleo (1,25 NA) num microscópio de fluorescência invertido, em conjunto com uma câmara CCD digital e software de aquisição de imagem micromanager, usando protocolos de imagem de fluorescência padrão.
5. Identifique os terminais pré-sinápticos marcados com fluorescência para direcionar para a gravação Figura 4c e 4d Figura.

5. Imunohistoquímica de isolados reticulospinais Axons

1. Preencha prato inserção (seção Protocolo de 2.10.) Com bivalente-ion (Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} livreSolução de Ringer.
2. Fabricar pipetas de patch em uma micropipeta extrator P-87. Colocar uma pequena quantidade de cola de sutura numa extremidade de inserção da poli-lisina usando uma pipeta de remendo de 1,5 mm (diâmetro exterior de vidro) e de sucção (tubagem de silicone com um diâmetro interno de 0,89 milímetros com uma ponta de micropipeta ligada à extremidade de aspiração).
3. Realizar dissociações utilizando o mesmo procedimento tal como mencionado na secção protocolo 3 Figura 2. Colocar uma extremidade da medula espinal em que a cola de sutura e pressionar suavemente com uma pinça para aderir fortemente à superfície. Colocar uma gota de cola de sutura na outra extremidade da inserção e alongar suavemente a medula espinal até axônios são dissociados e prender a extremidade livre da medula espinal, arrastando-o suavemente sobre a cola de sutura. Fixe no lugar pressionando suave para baixo com a pinça.
4. Taxas bivalente libertar solução de Ringer com solução normal de Ringer por perfusão.
5. Permitir que os axônios se recuperar por 20 min pós dissociation a 10 ° C.
6. Fix axónios dissociados em 4% de paraformaldeído (PFA) {preparado de Tampão Fosfato Salino (PBS (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na ₂ HPO ₄ 10, KH ₂ PO _{4 a} 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtre solução PFA antes da utilização através da passagem por um filtro de seringa de 0,2 uM.
7. Lavar a PFA irrigando glicina 0,1 M (em PBS) durante 10 min.
8. Incubar em 0,1% de Triton-X (em PBS) durante 10 min.
9. Lavar irrigando PBS durante 20 min.
10. Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 6 horas a 4 ° C.
11. Adicionar em anticorpo primário para VGCC de interesse (diluição 1: 200 em PBS) e incuba-se durante 20 horas a 4 ° C.
12. Lavar irrigando PBS durante 20 min.
13. Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 10 min a 4 ° C.
14. Adicionar em anticorpo secundário (1: 400 em PBS) e incuba-se escura durante 2 horas a 4 ° C.
15. Lavar irrigando com PBS durante 20 min.
16. Bloco com 1% de soro bovino Albumin (em PBS) durante 20 min.
17. Adicionar em Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / ul concentração de trabalho; estoque preparadas em metanol a 200 Unidades / mL).
18. Lavar irrigando com PBS durante 20 min.
19. Imagem com lente de imersão em água 100X microscópio confocal.

6. eletrofisiológica Recording

1. Fabricar pipetas de patch vidro alumino-silicato (resistência pipeta 2-5 mohms) em uma micropipeta extrator P-87. Projeto pipeta patch de tal forma que a ponta da pipeta engloba diâmetro inteiro terminal pré-sináptico.
2. PDMS remendo pipetas revestimento por imersão a pipeta de adesivo sob 50-60 psi de pressão em PDMS ²³ (juntar um tubo de silicone, 0,89 mm de diâmetro interno, ligada a um cilindro de gás de azoto, para a extremidade traseira da pipeta patch) e secam-se utilizando um calor arma. Como alternativa, o revestimento manualmente pipeta com PDMS, aplicando o revestimento o mais próximo da ponta quanto possível, sob um microscópio composto.
3. Incêndio pipetas de patch polonês usando um microforge (um filamento de platina personalizado construído montada no palco de um microscópio composto).
4. Identificar axônios isolados demonstrando terminais pré-sinápticos marcados por microscopia de fluorescência.
5. Encha solução de gravação (concebido para isolar correntes de Ca ^{2 +,} 10 mM de CaCl ₂ ou 90 mM de _BaCl2, como portador de carga, tamponada com HEPES, pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) para a pipeta de adesivo utilizando uma seringa.
6. Insira remendo pipeta no suporte da pipeta e posição acima do banho usando um MP225 motorizada manipulador. Abaixe cuidadosamente a pipeta de patch para o banho e posição contra o rosto de um terminal pré-sináptico fluorescently identificado.
7. Avança a pipeta remendo lentamente até que o contato é feito com a membrana. Neste ponto, conseguir uma vedação gigaohm por sucção boca suave através de um tubo colocado no suporte da pipeta.
8. Para atingir os níveis extremamente baixos de ruído de fundo necessários para a gravação de um único canal de Ca2 ⁺ correntes, use um Axopatch 200B com um andar de entrada arrefecida para as gravações. Os dados da amostra em 20-50 kHz e filtrar por 5 kHz filtro de Bessel. Realizar aquisição de dados utilizando um Axograph X.
9. Use um protocolo passo padrão, em incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar um pré-pulso no protocolo, o protocolo anterior passo, para assegurar activação máxima de canais de Ca ^{2 +.} Incorporar uma mV etapa 10 vazamento no protocolo passo para pós-análise subtração das correntes de fuga.

Resultados

Isso gera protocolo dissociação saudáveis ​​e funcionais axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter os terminais pré-sinápticos funcionais capazes de evocado vesículas sinápticas exo-e endocitose Figura 4c e 4d Figura. Secções das regiões isoladas dos axônios reticulospinais podem ser claramente identificados em microscópio de luz para estar livre de quaisquer outros processos...

Discussão

Nosso protocolo de dissociação é significativo por ceder axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter funcional pré-sináptica terminais Figura 4c e 4d Figura. A ausência de processos pós-sinápticos que se opõem ao terminal pré-sináptico permite o acesso a gravação direta para a membrana rosto liberação pré-sináptica nos terminais pré-sinápticos individuais, que não eram possíveis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm Syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22 x 60 mm Coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100 x 15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35 x 10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300,000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodies R-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces Griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Pressure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	14046230132
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon