Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Resumo

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Resumo

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Introdução

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms^1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change⁴, the spread of invasive species⁵, and host-pathogen interactions^6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism^8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa^11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus^15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant^5,18 and contain more total lipids¹⁹ than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects^20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect²². In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause²³, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

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Protocolo

1. larval criação de duas A. Grupos albopictus à Idade Adulta

1. Definir dois armários de fotoperíodo com iluminação programável a 21 ° C para a expressão diapause óptima ¹⁶ e cerca de 80% de umidade relativa.
   1. Programa de um gabinete para a 16L: luz 8D: ciclo escuro (a não diapausa induzindo LD fotoperíodo). Defina o segundo armário para um 8L: 16D luz: ciclo escuro (diapausa induzindo) ^13.
   2. 'Luzes sobre' programa ao mesmo tempo em ambos os armários para sincronizar o tempo circadiano entre fotoperíodo.
2. Calcular a quantidade de ovos necessários para a realização da experiência. Apontar para 300-500 ovos por gaiola. Pelo menos três réplicas gaiolas diapausa e três réplicas de diapausa gaiolas não são necessários para a produção de ARN. Isso totaliza até cerca de 1,800-3,000 ovos por experimento.
   1. Chocar os ovos, submergindo papéis de ovos em cerca de 500 ml de H ₂ O. deionizada
   2. Adicionar ca. 1 ml suspensão alimento que consiste em alimentos para cães chão e camarão de água salgada, como descrito anteriormente ^24. Cubra o recipiente com malha, e manter a malha no lugar com um elástico.
   3. Coloque no gabinete LD fotoperíodo durante cerca de 24 horas.
3. Transferência larvas eclodidas de 10 x 10 x 2 cm, de Petri pratos cheios com cerca de 90 ml de água desionizada H ₂ O.
   1. Manter cerca de 30 larvas por prato. Larvas de limpar pratos a cada 48-72 hr transferir, por exemplo, todas as segundas, quartas e sexta-feira (MWF) ^24.
   2. Alimentação de cerca de 1 ml suspensão alimento que consiste em alimentos para cães chão e camarão de água salgada em água deionizada cada MWF como descrito anteriormente ^24.
4. Configurar 3-4 gaiolas adultos para cada tratamento fotoperíodo, onde cada gaiola compreende uma réplica biológica.
   1. A partir de lados opostos de 9,5 L baldes, cortar um 10-a-14 centímetros buraco, e um outro furo, com 15 cm de diâmetro. CoVer o primeiro com malha. Cortar aproximadamente um comprimento de um pé da meia ortopédica, e cola uma extremidade em torno do interior do outro furo.
   2. Corte a ponta do pé da meia off e nó fechado - aberto apenas quando o acesso ao interior da gaiola é necessário. Para a tampa gaiola, cortar todo o interior, deixando apenas o aro, e substituir o plástico interior com malha ^24.
   3. Observe o fotoperíodo, replicar número, gaiola data de início, e outras informações relevantes para o experimento com marcador permanente no lado da gaiola.
5. Alinhar a parte inferior das gaiolas adultos com papel de filtro molhado. Humedecer o papel de filtro com água desionizada suficiente _H2O para aumentar a humidade local na gaiola, mas evite a água de pé, que pode estimular a oviposição sobre o papel de filtro ^24. Verifique o filtro de papel por dia, durante a secagem, re-molhado quando necessário.
6. Para produzir ovos suficientes para uma biblioteca de RNA, incluir, pelo menos 100 mulheres / 9.5 L cage, com não mais de 500 mosquitos por gaiola.
7. Recolha MWF pupas e coloque em um copo pequeno de H ₂ O limpo a uma densidade de não mais de 50 pupas por 25 ml _de H ₂ O. Transfira o copo pupas de uma gaiola de adulto. Coloque as gaiolas no respectivo gabinete de fotoperíodo - A. albopictus pupas são fotossensíveis ^15.
8. Certifique-se de diário que H ₂ O em copos é limpo e claro, e remover pupas morto, porque a acumulação de pupas mortos pode causar mortalidade em massa. Retirar H ₂ O copos depois de todos pupas emergir.
9. Coloque passas orgânicas na parte superior da gaiola de malha para fornecer açúcar para adultos emergiram. Monitorar passas, e alterá-las a cada 3-5 dias para evitar o acúmulo de mofo.

2. Manutenção de Adultos para Permitir acasalamento e produção de ovos

1. Manter gaiolas com alta umidade (aprox. 80%), forrando o fundo da gaiola com um papel de filtro umedecido, e fornecer acesso a passas não mofados, como descrito acima (Sections 1,5 e 1,9).

3. Sangue-feeding

1. Prepare-se para as fêmeas de sangue de alimentação entre dois a seis dias após a eclosão de garantir que as fêmeas foram expostos a pelo menos oito dias curtos inequívocas antes oviposição começa por quase 100% dos ovos de diapausa ^14.
2. Prepare o sistema de alimentação Hemotek membrana. Ligue as unidades de alimentação à fonte de alimentação. Ajustar a temperatura de cada unidade a 37 ° C, utilizando o parafuso de ajustamento. Usar um termómetro electrónico e sonda para medir a temperatura da unidade de alimentação durante a calibração.
3. Prepare o reservatório de alimentação. Estique uma praça de alimentação membrana de colágeno sobre a abertura do reservatório de alimentação e fixe-a com um anel-O. Retire cuidadosamente os cantos para remover rugas; aparar o excesso de membrana com uma tesoura.
   NOTA: membrana de colagénio pode não funcionar bem para todas as espécies de mosquitos, e pode ser necessário tentar vários tipos para encontrar a membrana óptima se trabalhar com umexceto A. espécies albopictus. Parafilm funciona bem com o Culex pipiens.
   1. Se o sangue é armazenado congelado, descongelar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr antes de usar.
   2. Mantenha o reservatório de modo a membrana está voltada para baixo, sem suporte e os orifícios de enchimento estão voltados para cima. Usar uma pipeta ou uma seringa para encher o reservatório com cerca de 3 ml de sangue total a partir de galinhas que tem o citrato de sódio como anti-coagulante. Selar orifícios de enchimento com tampões de plástico.
4. Anexar o reservatório preparado para o alimentador rodando no pino na placa de transferência de calor na parte inferior do alimentador. Inverta o alimentador e coloque-o em cima da gaiola, lado membrana para baixo, de modo que os mosquitos podem se alimentar através da malha da gaiola. Mantenha o alimentador na gaiola durante cerca de 45 minutos para maximizar a alimentação.

4. Estimular a oviposição

1. Quatro a cinco dias após a farinha de sangue, equipar cada gaiola com uma cor escura 50 ml c-se forrada com papel não branqueado a germinação das sementes (papel de ovo) ou com texturas toalha não-branqueada de papel e encha até a metade com água deionizada ^9. Se mais de 250 mosquitos estão em uma gaiola, use dois copos.
   NOTA: Para pequenas gaiolas ou frascos single-fêmea ", infusão de feno", em recipientes de oviposição pode aumentar oviposição devido ao odor da flora microbiana ^25.

5. coletar e armazenar ovos

1. Começar a coleta de ovos dentro de 4-5 dias de alimentação de sangue, porque a produção de ovos tipicamente pico cerca de cinco dias após a alimentação de sangue, e depois desaparece ao longo da próxima semana.
2. Varie freqüência de coleta de ovos em necessidades do experimento. Para fins gerais, recolher papéis de ovos em uma programação MWF. Remova papéis de ovos de cada gaiola e substituir por papel novo. Coloque papéis removido recentemente em placas de Petri e guardar no armário fotoperíodo SD para evitar efeitos de confusão de armazenamento de ovos.
3. Permitir papéis de ovo para re principal molhado por 2 dias pós-oviposição para permitir a formação da cutícula serosa, o que aumenta a resistência à dessecação ovo ^26.
4. Posto de Arrecadação aproximadamente 48 hr, ovos secar ao ar livre. Seca-se o papel de tal forma que é mole e ligeiramente húmido ao toque, mas não de modo que o papel molhado é escuro a partir de H ₂ O ou estimula a eclosão dos ovos.
   NOTA: A "x 4" papel 6.5 pode demorar cerca de 3,5 horas para secar. Tenha cuidado para não sobre-seco papéis de ovos, pois isso irá resultar em ovo dessecação ^27.
5. Reservar ovos adicionais, tanto LD e SD fotoperíodo para avaliar a diapausa e interpretar o efeito photoperiodic (ver medição diapausa, Seção 6).
6. Para armazenamento a longo prazo, tenha papéis de ovos a 21 ° C e cerca de 80% de humidade em placas de Petri. Manter pratos de Petri em um recipiente de armazenamento Tupperware com um frasco de água para manter a humidade local como o desenvolvimento embrionário leva quatro a cinco dias a 21 ° C.

ove_title "> 6. Meça diapausa Incidência

1. Use embriões reservados adicionais (ver Estimular oviposição, secção 4), que são 7-20 dias de idade para quantificar a resposta diapausa.
2. Anote o número de ovos presentes em cada papel ovo.
3. Estimular os ovos para chocar, submergindo completamente papéis individuais de ovos em um prato de 90 ml Petri com aproximadamente 80 ml ​​de H ₂ O. deionizada Adicionar aproximadamente 0,25 ml de suspensão de alimentação.
4. Após 24 h contar o número de larvas eclodidas primeiro instar. Colocar a placa de Petri sobre uma superfície preta para visualizar larvas e colocar uma fonte de luz de um lado do prato. As larvas irão mover-se para longe da fonte de luz, o que permite uma contagem de larvas claro indivíduo. Remover larvas indivíduo com uma pipeta, contando para evitar recontando larvas individual.
5. Papers lugar de ovos em uma nova placa de Petri e re-seco. Re-ovos eclodem depois de ~ 1 semana e novamente concordância ovos eclodidos usando o método acima.
6. Papers lugar de ovo com o restante u ovos n-eclodidos em novos 90 ml placas de Petri com solução de branqueamento de aproximadamente 80 ml ^​​28. Certifique-se de que os papéis de ovos estão completamente submerso na solução de branqueamento e deixe durante a noite sob uma coifa para evitar o odor de água sanitária.
   NOTA: Branqueamento solução pode ser armazenada durante ~ 1 semana a 4 ° C, mas de outro modo deve ser feita.
7. Inspecione ovos usando um microscópio de luz como o branqueamento irá limpar o chorion e permitir a visualização de embrionados, ovos un-chocados. Se o ovo é embrionados, o ovo terá uma cor off-white com os olhos aparecem como dois pequenos pontos pretos opostos um ao outro na face dorsal. Contar o número de un-chocado, ovos embrionados ^13.
8. Determinar a diapausa com a seguinte fórmula:% diapausa = nenhum. ovos embrionados un-nascidos / (no. ovos eclodidos + não. ovos un-eclodidas embrionados) x 100 ^13.

7. Extração de RNA a partir de ovos / larvas pharate

ontent "> NOTA: Use Trizol em uma capela de fluxo laminar.

1. Ovos do mosquito da escova contendo embriões em desenvolvimento ou larvas pharate em momentos distintos do desenvolvimento de trabalhos de ovos para moedores de vidro usando um pincel de pêlo de camelo. Triture os ovos em Trizol (1 ml por 50-100 mg de tecido) até que esteja completamente pulverizada. Utilize pelo menos 400 ovos per biblioteca para produzir RNA suficiente.
   1. Alternativamente, encaixe ovos congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C em tubos de microcentrífuga de até um mês antes da moagem em Trizol.
2. Realizar a extracção de ARN em Trizol seguido por precipitação com isopropanol de acordo com as instruções do fabricante.
3. Tratar o banco com solução RNase descontaminação ou outros agentes para remover quaisquer nucleases residuais para evitar a degradação do RNA.
   1. Tratar o RNA extraído com DNase. De acordo com as instruções do fabricante, incubar as amostras de ARN com DNase durante 30 min a 37 ° C. Use 1 & #181; l de ADNase para até 10 ug de RNA numa reacção de 50 ul. Aumentar a quantidade de ADNase, se houver mais do que 10 ug de RNA em uma reacção.
   2. Inactivar ADNase por adição de 5 ul de reagente de inactivação de DNase suspenso. Incubar 5 min à temperatura ambiente, a mistura três vezes durante o período de incubação (vortex suave).
   3. Centrifugar a 10.000 xg por 1,5 min. Transferir o sobrenadante contendo as amostras de RNA tratada para tubos frescos para as etapas subsequentes.
4. Avaliar a qualidade das amostras de ARN totais por fluorometria. Enviar as amostras para uma instalação de especialidade com o instrumento adequado para esta tarefa. A facilidade vai efectuar a electroforese em gel em chips, para determinar os tamanhos de espécies de RNA presentes na amostra, visualizadas por coloração fluorescente instilada no chip. Os resultados serão retornados como um electroferograma.
   1. Determinar a integridade das amostras de ARN total por a presença ou ausência de produtos de degradação, tal como evidenciado pela presença of os picos entre 18S e 5S picos de ARN ribossomal no electroferograma resultante (Figura 1B).

8. RNA Sequencing

1. Enviar amostras de ARN totais com qualidade suficientemente elevada (Figura 1A) e da quantidade (geralmente> 3 ug por biblioteca) para um centro de sequenciação comercial para a construção de bibliotecas enriquecidas emparelhado-finais de ARNm e a sequenciação de ARNm, seguindo protocolos padrão.
2. Se mais de uma faixa está sendo usado para sequenciar um único experimento, dividir bibliotecas individuais em duas pistas de sequenciamento para explicar variação técnica entre pistas durante o seqüenciamento.

9. lllumina Leia Limpeza

NOTA: A Figura 2 resume a porção bioinformática deste protocolo. Para obter uma lista completa de todos os programas e recursos usados ​​na seção bioinformática deste protocolo, consulte a Tabela 1. EmAdicionalmente, Suplementar Arquivo 1 contém exemplos de linha de comando para cada uma das seguintes etapas do protocolo de bioinformática.

1. Use ssaha2 ²⁹ (Tabela 1) para identificar as correspondências com 95% de identidade ou superior para a base de dados do NCBI UniVec núcleo (Tabela 1), A. albopictus sequência rRNA (GenBank # L22060.1) e adaptadores de seqüenciamento (exemplos detalhados de linha de comando fornecidas em Suplementar Arquivo 1). Remover pares de leitura com jogos usando Perl ou uma ferramenta de scripting semelhante, por exemplo, adaptando o script Perl fornecida (Suplementar Arquivo 2).
2. Limpe restante lê com o pacote SolexaQA ³⁰ (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1): aparar as regiões com uma pontuação equivalente Phred inferior a 20 usando as configurações padrão de DynamicTrim.pl.
   1. Remover lê mais curto do que 25 bp com LengthSort.pl em ambos frente e verso lê simultaneamente. Avaliar a qualidade dos arquivos limpos fastq com FastQC (Tabela 1 ) - em particular, verificar se a qualidade sequência per-base e os índices de qualidade per-seqüência estão acima de 20.

10. Digital Normalização

1. Execute uma rodada de normalização digital no limpos lê usando a ferramenta khmer ³¹ (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1), especificamente normalize-by-median.py (usando tamanho k-mer 20, uma cobertura de corte de 20, e x = 1e10).
2. Como alternativa, se uma máquina com alta RAM disponível (centenas de GBs), usar o script normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinity (Tabela 1).

11. De Assembléia transcriptoma Novo

1. Obter acesso a um grupo de computadores ou computador com até 256 Gb de RAM e CPUs 24, dependendo do tamanho do conjunto.
2. Use Trinity ³² (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1) para montar a leitura digital normalizado definido em contigs. Para reduziruso de memória, use --min_kmer_cov 2.

12. Avaliação Assembleia

1. Execute assemblathon_stats.pl do projeto Assemblathon2 ³³ na saída contig Trindade. Este script executa cálculos básicos relevantes para a avaliação da qualidade de montagem, tais como número de andaimes, N50, composição de montagem, e mais (Tabela 1; Suplementar arquivo 1).

13. Anotação do transcriptoma montado

1. Execute Blastx (Tabela 1) do conjunto contra um conjunto de proteínas de referência; para os mosquitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, e Aedes aegypti são referências adequadas. Especificamente, formatar o arquivo fasta proteína de referência para a explosão, seguida de blastx (Suplementar Arquivo 1).

14. Mapa Lê à Assembléia Usando RSEM ³⁴ (Tabela 1)

1. Criar um arquivo 'transcrição-to-gene-map', em que oprimeira coluna contém os IDs de genes de referência, e a segunda coluna os IDs contig. Em um editor de planilhas, trocar as primeira e segunda colunas a partir da saída Blastx, e escrever estas colunas em um arquivo .txt. Use o programa LineBreak para converter as quebras de linha no arquivo .txt resultante para formato Unix.
2. Criar um conjunto de dados de referência a partir do arquivo fasta transcriptoma usando o script rsem-prepare-referência, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1).
3. Calcular os valores de expressão separadamente para cada biblioteca usando o comando rsem-calcular-expressão, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1). Como lê, utilizar os ficheiros emparelhados fastq resultantes do passo de limpeza de leitura (passo 9.2).
   1. Se RNA a partir de uma réplica biológica foi dividida em duas pistas para o seqüenciamento, incluem ambos os arquivos fastq no cálculo expressão para gerar um único arquivo.
4. Converter os resultados de expressão de cada biblioteca a uma matriz facilmente processados ​​por outro pROGRAMAS usando o rsem-gerar-data-matriz do script fornecido, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1).

15. Análise da expressão diferencial

1. Instale R e aparador (Tabela 1).
2. Use read.delim para carregar os resultados RSEM da etapa 14.3 (Suplementar Arquivo 1). Se necessário, completar a contagem para o número inteiro mais próximo.
   NOTA: O guia facetadora recomenda limitar o conjunto de dados de genes com expressão elevada o suficiente para detectar significado.
3. Para formatar os dados para facetadora, gerar um objeto DGEList do arquivo de dados carregado (Suplementar Arquivo 1). Em seguida, normalizar os dados usando TMM normalização (Suplementar Arquivo 1). Estimar as dispersões comuns e tagwise dos dados (Suplementar arquivo 1).
4. Identificar genes diferencialmente expressos com um Benjamini-Hochberg corrigido p <0,05 (File Suplementar 1). Traça-se a distribuição de log-fold-change vs. abundância (Suplementar Arquivo 1).

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Resultados

Fluorometria de duas amostras de RNA representativos mostraram duas bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). O ARN ribossómico 28S de insectos é composta de duas cadeias polinucleotídicas mantidas juntas por ligações de hidrogénio, que são facilmente rompidas por breve aquecimento ou agentes que perturbam a ³⁵ ligações de hidrogénio. Os dois componentes resultantes são aproximadamente do mesmo tamanho que o ARN ribossómico 18S. A segunda amostra de RNA apresentaram altos n...

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Discussão

Este protocolo apresenta métodos para descobrir genes diferencialmente expressos, devido à photoperiodically diapausa induzida em A. albopictus. O protocolo é significativo na medida em que combina de forma única de criação do mosquito e técnicas de bioinformática para fazer todos os aspectos experimentais de um programa de fisiologia molecular acessível a usuários novatos - em especial para as que incidam sobre a resposta ao fotoperíodo diapausa. Os métodos existentes, a nosso conhecimento, não fo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator - Model 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Controlled environment room	Thermax Scientific	N/A	Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb	Philips	392183	4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Filter Paper 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L Bucket	Plastican	Bway Products	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings	Albahealth	23650-040	product no. 081420
Organic Raisins	Newman's Own	UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)	Fisher Scientific	03-007-52	The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels	Seventh Generation	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder	Corning Incorporated	7727-2	These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent	Sigma Aldrich	T9424	Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder	Hemotek	5W1	This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate	Pel-Freez Biologicals	33130-1	The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.