Aquisição de Vídeo de Alta Qualidade Digital de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvais e adultas Comportamentos de uma perspectiva lateral

Resumo

Aqui nós descrevemos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de Drosophila adulto e fenótipos mutantes larvais de uma perspectiva lateral.

Resumo

Drosophila melanogaster é um poderoso sistema de modelo experimental para o estudo da função do sistema nervoso. As mutações genéticas que causam a disfunção do sistema nervoso muitas vezes produzem larvas viáveis ​​e adultos que têm locomoção fenótipos defeituosos que são difíceis de descrever adequadamente com texto ou representar completamente com uma imagem fotográfica única. Atuais modos de publicação científica, no entanto, apoiar a apresentação de mídia de vídeo digital como material suplementar para acompanhar um manuscrito. Aqui nós descrevemos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de ambos os fenótipos de Drosophila larvas e adultos a partir de uma perspectiva lateral. Vídeo de locomoção das larvas e adultos a partir de uma visão lateral é vantajosa porque permite a observação e análise das distinções sutis e variações nos comportamentos aberrantes de locomotivas. Temos utilizado com sucesso a técnica de visualizar e quantificar aberrant rastejando comportamentos em larvas de terceiro estádio, além de fenótipos e comportamentos mutantes adultos incluindo o grooming.

Introdução

A fruta comum mosca Drosophila melanogaster é um poderoso sistema de modelo experimental para o estudo da função do sistema nervoso ^1-3. Conservação evolutiva da estrutura e função do sistema nervoso, com os seres humanos, assim como a facilidade da manipulação genética e uma vasta variedade de ferramentas genéticas torna o organismo Drosophila estreia para modelar doenças neurodegenerativas humano ^4. As mutações genéticas que causam disfunção do sistema nervoso, muitas vezes resultam em larvas mutante viável e adulto de Drosophila com locomoção diminuída. Fenótipos observados no sistema nervoso mutantes defeituosos incluem taxa de locomoção, coordenação aberrante, e os movimentos espásticas em adultos, assim como os défices de contracção peristáltica da musculatura da parede do corpo, e paralisia parcial de larvas reduzida. Estes fenótipos foram explorados no desenvolvimento de telas genéticas de alto rendimento e ensaios de locomoção das larvas ⁵ mutante, 6 e adulto de Drosophila ^7-10 destina-se a quantificar a disfunção locomoção e a identificação de genes necessários para a função do sistema nervoso. Embora essas abordagens são extremamente úteis para quantificar comportamentos locomotiva larvas e adultos, eles não conseguem transmitir informações qualitativas sobre cada comportamento aberrante específico. Por exemplo, enquanto as larvas de terceiro estádio mutante pode apresentar parâmetros de locomoção alterados em um ensaio comportamental, pode não ser claro se este é o resultado de alterações nas contrações peristálticas rítmicas durante o ciclo de rastreamento, em geral falta de coordenação ou paralisia parcial do corpo posterior musculatura da parede. Aqui nós descrevemos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de Drosophila adulto e fenótipos locomotiva larvais de uma perspectiva lateral. O vídeo digital adquirido de uma perspectiva lateral, permite a observação direta e análise de distinções sutis em locomotive comportamentos de uma orientação mais informativa visão lateral.

Protocolo

1 O sistema de microscópio estéreo

Nota: Apesar de este protocolo é facilmente adaptável a praticamente qualquer sistema de microscópio estéreo acoplado a uma câmera digital com a capacidade de adquirir vídeo, são fornecidos detalhes sobre o sistema utilizado em nosso laboratório (Tabela de Materiais / Equipamentos).

1. Adquirir vídeo digital utilizando um microscópio estéreo trinocular acoplado a uma câmera digital comercial.
2. A fim de acoplar a câmera digital comercial à porta trinocular do microscópio estéreo, remova o ½x C-mount do porto fototubo do microscópio estéreo e substituí-lo por um 1X C-mount.
3. Montar um acoplador câmera digital (43 mm Rosca) ao 1X C-mount.
4. Monte dois anéis abaixadoras, 58 mm a 48 mm, e 48 mm a 43 mm, para o acoplador câmera para colmatar a conexão da câmera digital a um acoplador kit adaptador de lente para a câmera digital.
5. Monte a câmera digital para o kit adaptador de lente.
6. Adquirir vídeo com a ampliação do microscópio e zoom óptico da câmera digital definida para uma ampliação combinada de cerca de 12X (30 quadros por segundo, 640 x 480 pixels). Nota: A ampliação do microscópio estéreo deve ser compensado de acordo com o recém-reconfigurado 1X C-mount da porta trinocular.

2 Imagem Drosophila terceiro instar Larvas

1. Tape um marcador permanente para a placa preta palco de um microscópio estéreo acoplado a uma câmera digital, de modo que o lado da tampa marcador ocupa cerca de ⅓ a ¼ do campo de visão vertical observado no monitor LCD da câmera. Use tops de marcadores como o palco para realizar imagem larval porque eles vêm em uma variedade de cores que pode ser usado para código de cor e diferenciar os genótipos de larvas sendo fotografada.
2. Delimitar o campo de visão observada no monitor LCD da câmara digital na superfície do topo do marcador com uma ponta finamarcador.
3. Selecione uma terceira larva instar a imagem. Os critérios para a selecção de larvas de terceiro instar é o comprimento do corpo, a emergência da fonte de alimentação durante a fase larval do ciclo de vida, a presença dos anteriores e posteriores espiráculos, e a estrutura dos ganchos inferiores do aparelho de boca ^11. Garantir a larva está limpo, lavando-o bem em água.
4. Iluminar o palco marcador permanente topo a partir de cima com a luz a partir de um sistema de iluminação de fibra óptica. Ajuste o ângulo da luz incidente para proporcionar a iluminação ideal.
5. Concentre o microscópio sobre a borda de topo marcador permanente. Comece a aquisição de vídeo digital.
6. Coloque a larva do lado da tampa de marcador de aproximadamente 75 ° a partir do eixo vertical, fora do campo de visão, sendo o anterior da larva virado para o campo de visão (figura 1). Observação: Colocação da larva no lado da tampa de marcador permite que a câmara da ficha movimento the larva de uma perspectiva lateral. Ela ajuda a manter a larva úmido com água, para que não caia do lado da tampa do marcador. Deve ser tomado cuidado, porém, para não usar muita água, como quantidades excessivas vai aderir à larva como rasteja em todo o campo.
7. Gentilmente cutucar a larva com um pequeno pincel para forçá-lo a engatinhar em todo o campo de visão. Seja paciente como as larvas raramente cooperam e muitas vezes tem que ser devolvido ao ponto de partida muitas vezes antes que rastejar em frente do campo.
8. Grave aproximadamente 10-15 min de vídeo ininterrupto e cultura digital e remover todas as filmagens desnecessária pós-aquisição com software de edição de vídeo digital.

3 Imagens Adulto Drosophila

1. Coloque um único adulto Drosophila num descartável 1,5 ml tina espectroscópica de poliestireno.
   Nota: CO ₂ para anestesia de adulto Drosophila imediatamente antes de uma behavprotocolo de análise ioral pode comprometer os resultados ^12. É recomendado que adultos Drosophila dispor de um prazo de 24 horas para se recuperar de CO ₂ para anestesia antes de executar em um teste comportamental ^13.
2. Ligue o final da cuvete com uma pequena bola de algodão. Garantir a bola de algodão é embalado apertado o suficiente para ocupar o espaço grande boné e limita a voar para o compartimento volume reduzido da tina.
3. Coloque a tina na placa de fase branca de um microscópio estéreo e alinhar adequadamente o compartimento de volume reduzido da tina com o campo de visão observada no monitor LCD da câmara digital.
4. Iluminar o cadinho a partir de cima com a luz a partir de um sistema de iluminação de fibra óptica. Ajuste o ângulo da luz incidente para proporcionar a iluminação ideal.
5. Concentre-se o microscópio e começar a adquirir vídeo digital.
6. Grave aproximadamente 30-45 min de vídeo ininterrupto e cultura digital e remover todos os desnecessárioscenas pós-aquisição com software de edição de vídeo digital.

Resultados

Nós utilizamos com sucesso desta técnica para adquirir e quantificar o fenótipo comportamental larval associada com a perda de função do gene stathmin (Figura 2) ^14. O gene codifica uma proteína stathmin regulamentar microtúbulos que particiona dímeros de tubulina de piscinas de tubulina solúvel, e liga os microtúbulos e promove a sua desmontagem ^15,16. Stathmin função é necessária para manter a integridade dos microtúbulos nos axónios dos nervos p...

Discussão

Força Drosophila melanogaster 's como um sistema modelo para estudar a função do sistema nervoso deriva em grande parte da convergência das poderosas ferramentas genéticas disponíveis e da ampla gama de ensaios comportamentais robustos desenvolvidos. Aqui apresentamos uma técnica de microscopia simples e amplamente acessível para a aquisição de vídeo digital de alta qualidade de Drosophila adulto e fenótipos locomotiva larvais de uma perspectiva lateral. Temos utilizado com sucesso esta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trinocular Stereozoom Microscope	Olympus Corporation	SZ6145TR	½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount
1X C-mount	Leeds Precision Instruments	LSZ-1XCMT2
Digital Camera Coupler (43 mm thread)	Qioptiq Imaging Solutions	25-70-10-02
58 mm to 48 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR5848
48 mm to 43 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR4843
Lensmate Adapter Kit for Canon G10	LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Digital Camera	Canon U.S.A., Inc.
1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette	Denville Scientific	U8650-4