Um método de triagem e Validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase

Resumo

Surgimento de resistência genética a terapia com inibidor da quinase poses desafio significativo para a terapia do cancro eficaz. Identificação e caracterização de mutações resistentes contra uma droga recém-desenvolvido ajuda na melhor gestão clínica e concepção de medicamentos próxima geração. Aqui, descrevemos o nosso protocolo de rastreio in vitro e validação das mutações resistentes.

Resumo

A descoberta de BCR / ABL como um oncogene condutor na leucemia mielóide crónica (LMC), resultou no desenvolvimento de Imatinib, o qual, na verdade, demonstraram o potencial do alvo a quinase em cancros por tratar eficazmente os pacientes de CML. Esta observação revolucionou o desenvolvimento de drogas para alvejar as quinases oncogénicas implicados em várias outras doenças malignas, tais como, o EGFR, B-RAF, KIT e PDGFRs. No entanto, uma grande desvantagem de terapias anti-quinase é o aparecimento de mutações de resistência a drogas que tornam o alvo ter reduzido ou perdido afinidade para a droga. A compreensão dos mecanismos empregados pela variantes resistentes não só ajuda no desenvolvimento dos inibidores de nova geração, mas também dá impulso à gestão clínica usando a medicina personalizada. Nós relatou uma estratégia de rastreamento retroviral vector base para identificar o espectro de resistência conferindo mutações no BCR / ABL, o que tem ajudado no desenvolvimento da próxima geração BCR / ABL inibidores. Usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, aqui descrevemos em métodos de rastreio in vitro que utiliza as células do rato BAF3 expressam a biblioteca mutação aleatória de JAK2 quinase.

Introdução

As proteína-quinases são enzimas reguladoras-chave de vias intracelulares de transdução de sinal que aparentemente modulam cada função celular. Um controle adequado da quinase mediada sinalização é fundamental para a homeostase e desenvolvimento, que se baseia principalmente na regulamentação adequada de quinases, fosfatases e sua degradação por UPS (sistema ubiquitina proteassoma). Quinases desregulados estão no centro do palco de muitos cânceres e envolvida em série de doenças humanas ^1. Genoma humano codifica mais de 500 proteínas cinases que foram ligadas, directa ou indirectamente, para ~ 400 doenças humanas ^2. Estas observações suportado o conceito para direccionamento terapêutico de cinases por pequenas moléculas inibidoras ^3-5.

A demonstração de inibidores da quinase ABL, tais como imatinib, no tratamento de leucemia mielóide crónica (LMC) forneceu a prova de conceito para esta abordagem ^6,7. Esta observação não só revolucionou a formigai-quinase terapêutica mas também aplicada a ideia para identificar as lesões genéticas em outras doenças neoplásicas para direccionamento terapêutico, que levam à descoberta de mutações oncogénicas em JAK2 de policitemia vera (PV) e os pacientes com neoplasias mieloproliferativas (NMP). Esta descoberta gerou grande interesse no tratamento MPNs alvejando JAK2 com inibidores da quinase de moléculas pequenas. Agora, quase uma dúzia de inibidores de JAK2 estão em ensaios clínicos, e um deles foi aprovado recentemente para o tratamento de mielofibrose. Enquanto direccionamento específico de quinases oncogénicas por pequenas moléculas inibidoras em cancros trazer resultados promissores, também sofre de desenvolvimento de resistência ao tratamento. De facto, até agora, os pacientes tratados com inibidores de cinase, tais como imatinib, gefitinib, erlotinib e dasatinib mutações de resistência desenvolvida principalmente através da aquisição de mutações no domínio de cinase de droga que tem como alvo ^8-10. Resistência como resultado de mutação genética destaca as limitações de of monoterapia alvo contra as quinases oncogénicas, e representa o seguinte desafio para o desenvolvimento de quimioterapia do cancro cada vez mais bem sucedidos. Consequências mecanicistas e funcionais de resistência aos medicamentos deve fornecer uma justificação para a selecção e design de compostos de cortesia para o desenvolvimento de drogas. As mutações identificadas via telas in vitro, mostraram um alto grau de correlação com os encontrados em pacientes. Portanto, rastreio in vitro para mutações que conferem resistência aos fármacos para um dado alvo pares droga auxilia em desenvolvimento clínico ou pré-clínicos em identificar os padrões de resistência que são susceptíveis de causar recaída clínica. A identificação dessas formas mutantes não só é útil no acompanhamento dos pacientes para a resposta à droga e recaída, mas também essencial para a concepção de inibidores mais robustos de próxima geração. Por exemplo, o desenvolvimento de inibidores BCR / ABL próxima geração, o nilotinib e ponatinibe, foram possíveis por causa da maior mecentendimentos hanistic adquirida com mutagênese, estrutural, e estudos funcionais.

Anteriormente, relataram os resultados de nossa tela usando mutagênese aleatória de BCR / ABL para revelar o espectro de mutações de resistência aos inibidores tais como Imatinib ^11,12, PD166326 ¹² e ¹³ AP24163. Os resultados não só identificou as mutações que conferem resistência e recidiva da doença clínica, mas também forneceu a compreensão mecanicista da resistência e dos princípios que regem a função quinase ^11,14 drogas. Aqui nós fornecemos detalhes metodológicos adicionais, usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, para permitir uma aplicação mais ampla dessa estratégia de triagem.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos deste protocolo foram conduzidos de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o tratamento ético e tratamento dos animais, e de acordo com um protocolo de uso de animais IACUC aprovado.

1. Linha celular de manutenção

1. Culturas de células BAF3 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml) e meio de cultura gasto de células WEHI. Cultivar células HEK293T em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml). Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2.

2. Construção de plasmídeo

1. Clonar o rato JAK2 e JAK2 sua isoforma oncogénica-V617F em pMSCV-puro-GW por clonase LR, utilizando um processo de recombinação de clonagem padrão.
2. Para a construção do vector de expressão de luciferase (Luc-pMSCV-Cherry-GW) utilizado na in-viimagiologia vo, amplificar a luciferase de pLVX-Tet-ON vector por PCR utilizando iniciadores (LUC-SD / RP-LUC TTACAATTTGGACTTTCCG e SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) seguido pela clonagem em pENTR-SD-TOPO para gerar pENTR-Luc, que é usada para transferir o gene de luciferase em vector retroviral, pMSCV-Cherry-GW de clonagem por recombinação mediada usando clonase LR.

3. Preparação da Random Mutation Library, Triagem e identificação das Mutações

3.1) A mutagénese aleatória

1. Comprimento total Clone de JAK2 tipo selvagem e a mutação V617F em pMSCV-puro-GW retroviral vector usando uma tecnologia de recombinação clonagem comercial.
2. Use 1 ug de ADN plasmídeo de JAK2 V617F-se transformar, XL-1 Vermelho, E. coli, que é defeito nos mecanismos de reparo do DNA permitindo-lhes incorporar mutações aleatórias durante a replicação. Mais especificamente, mistura 50 - 100 ng de ADN (mais do que 100 ng de ADN diminui a eficiência de transformação) com 100 ul de células competentes de um tubo de polipropileno pré-gelada e incubadas em gelo durante 30 min, agitando suavemente a cada 5 min. Para uma boa cobertura a biblioteca, utilizam 4-6 tubos de células competentes.
   NOTA: mais do que 100 ng de ADN diminui a eficiência de transformação
3. Mergulha-se o tubo num banho de água a 42 ° C durante um choque térmico de 45 seg e incubar em gelo durante 2 min. Em seguida, adicionar 1 ml de meio SOC (2,0% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,05% de NaCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4, e 0,4% de D-glucose). Incubar o tubo a 37 ° C enquanto agitando a 225-250 rpm durante 90 min.
4. Placa células de cada tubo em quatro placas de 10 cm de LB-ágar contendo 100 ug / ml de ampicilina. Incubar as placas durante 16-24 horas a 37 ° C.
5. Seguindo colónias visíveis, coletá-los raspando as placas com uma placa raspador estéril. Piscina células de cada placa e isolar o ADN de plasmídeo utilizando um kit de extracção de plasmídeo comercial.
   NOTA: Normalmente, as colônias são menores e tomar 18-24 horas para servisível, porque estes são crescentes estirpes bacterianas lentas. Nesta fase, avaliar a heterogeneidade de mutações na biblioteca por digestão de restrição com um cortador frequente, tais como Sau3A1 ou Taq1 ou sequenciação.

3.2) A produção de retrovirais sobrenadantes e transdução

1. Um dia antes da transfecção, placa de 4 x 10 ⁶ células HEK 293T Onto 100 centímetros pratos em DMEM contendo 10% de FCS, penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina.
2. No dia seguinte, substituir o meio e transfecção das células com mutado biblioteca pMSCV-JAK2-V617F. Para cada placa de 10 cm, misturar 10 ug de ADN (5 ug da biblioteca de plasmídeo e 5 ug de plasmídeo de empacotamento retroviral, pCLEco) com 40 ul de FuGENE para um volume total de 400 ul utilizando meio DMEM livre de soro. Incubar a mistura de ADN e de lípido durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após 20 min adicionar a queda complexo DNA-lipídico sábio em cima de células HEK293T.
3. Após seis horas, mudar o meio de transfecção wom meios frescos e incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C para a produção de vírus. Após 48 horas de incubação, recolher os sobrenadantes virais filtradas através de um filtro de 0,45 um Acrodisc.

3.3) Seleção de clones resistentes In Vitro

1. Para mutantes resistentes à JAK2 V617F-droga, a transdução de 100 milhões de células BAF3 com 100 ml de sobrenadantes de vírus com um título virai de 0,5-1 x 10 ^6. Mais especificamente, misturar 10 ⁸ células com 100 ml de sobrenadante do vírus para um volume total de 300 ml, utilizando meio RPMI, contendo soro a 10% e 24 ug / ml de polyberene (concentração final de ployberene é de 8 ug / ml). Distribuir estes misturadores de células em placas de seis poços múltiplos (4-5 ml por poço).
2. Centrifuga-se as placas a 1.250 xg durante 90 min a 25 ° C. Após centrifugação, incubar as placas a 37 ° C durante 24 horas.
3. No dia seguinte, reunir as células e misture com Ruxolitinib e meio contendo agar macio e banhado em six placas de poços. Para cada concentração de fármaco, misturar 10 mL de células BAF3 transduzidas (10-20 milhões de células) com a quantidade adequada de Ruxolitinib em um tubo de 50 ml. Completar o volume de 40 ml, utilizando RPMI contendo 20% de soro. Adicionar 10 ml de 1,2% de agar para as células, e mixcarefully placa em placas de seis poços.
4. Incubar as placas a 37 ° C durante duas semanas. Escolha as colónias resistentes, utilizando 0,2 ml pontas para pipetas e sub-cultura-los individualmente em placas de 24 poços para 3-4 dias.
5. Colher as células BAF3 resistentes por centrifugação a 450 xg durante cinco minutos à temperatura ambiente. Isolar o ADN genómico utilizando um kit comercial de isolamento de ADN genómico. PCR amplificar comprimento total JAK2 cDNA a partir de 100 ng de DNA genômico utilizando primers (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG e mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) e longa-template expandir sistemas de PCR de alta fidelidade.
6. Separa-se os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose. Extirpar o 3.4 kb de banda DNA representando JAK2 quadro de codificação e isolar o DNAutilizando um kit de extracção de gel comercial. Sequência de todo o comprimento do cDNA utilizando 8 primers internos (P1 - P8) que mede a sequência de codificação e analisar seqüências usando software comercial.

4. Validação in vitro de mutações resistentes

Muitos clones de células transportar mais do que uma mutação, Para testar a contribuição de cada mutação no fenótipo de resistência, gerar variantes seleccionadas por mutagénese dirigida a um local utilizando pMSCV-JAK2V-617F plasmídeo como modelo.

1. Realizar mutagénese dirigida em pMSCV-JAK2 V617F-plasmídeo utilizando um kit de mutagénese comercial e oligonucleótidos concebidos para criar mutações pontuais. Confirme as identidades dos clones mutantes por sequenciação.
2. Transdução de células BAF3 com retrovírus feita usando plasmídeos mutantes seguiram com a seleção usando �puromicina em 1 ug / ml.
3. Placa ⁴ 10 células BAF3-JAK2 V617F (50-ul de meio RPMI com FCS a 10%) em cada poço de uma placa de 96 poços. Separadoly adicionar 50 ul de meio contendo o ruxolitinib aos poços ao longo da placa (concentração final: 0, 1, 3, 5, 10, e 20 uM), e incuba-se as placas durante 60 horas a 37 ° C.
4. Avaliar a viabilidade das células por adição de 10 ul de reagente WST-1 a cada poço, seguido de incubação com a 37 ° C durante 2-4 horas. Ficha absorvância a A450 usando um leitor de placas. Realizar todos os ensaios em triplicado e enredo média absorção contra concentrações INCB018424. Realize uma curva sigmoidal melhor ajuste usando um algoritmo de ajuste de curva não-linear. Conseguir a concentração de droga que resulta em 50% de viabilidade celular como a IC50 celular.
5. Em seguida, placa seis milhões de células BAF3 que expressam variantes de JAK2 em placas de seis poços em meio RPMI contendo 10% de soro com concentrações crescentes de ruxolitinib e incubadas durante 4-6 horas a 37 ° C.
6. Recolher as células por centrifugação a 450 xg durante cinco minutos a 4 ° C. Lavar as células uma vez com PBS, e lise em 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 5 mM de EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM de fluoreto de sódio, 2 mM de vanadato de sódio, e 5% de glicerol suplementado com inibidores de cocktail inibidor de protease e fosfatase. Sonicar a suspensão de células durante 1 min, seguido por adição de tampão de carregamento de gel 5x (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM de DTT, 15% de SDS, 10 mM de benzamidina, 5 mM de EDTA, 5 mM de EGTA, 5 mM de vanadato de sódio , Protease Cocktail, 50% de glicerol, e azul de bromofenol a 0,001%) e desnaturação a 70 ° C durante 5-10 min.
7. Resolver as proteínas em um gel de poliacrilamida SDS 8% em condições de desnaturação. Execute immunoblotting com anticorpo monoclonal anti-phopsho STAT5. Tira as manchas e sondado com um anticorpo policlonal de coelho anti-SATA5. Visualize as bandas que utilizam reagentes ECL de acordo com a recomendação do fornecedor.

5. In Vivo de validação

1. Transdução de células que expressam BAF3 luciferase e cereja (transduzidas com retrovírus feitos de pMSCV-Luc-cherry GW) com vírus que expressam JAK2-V617F e variantes resistentes. Seleccionar células que sobrevivem puromicina selecção para a expressão de JAK2 e suas variantes de resistência.
2. Injectar dois milhões de células em crescimento activo / cereja BAF3-Luc-JAK2 V617F que transportam e as suas variantes resistentes em 200 ul de PBS a 6 ratinhos Balb / c por via injecção venosa da cauda.
3. Depois de três dias de transplantes de células, injectar os ratinhos com Ruxolitinib (100 mg / kg) duas vezes por dia durante duas semanas.
4. Execute-base luciferase bioluminescência de imagem com um sistema de imagem. .
   1. Em resumo, preparar solução luciferina dissolvendo 300 mg a 25 ml de água deionizada estéril, da alíquota em volumes e loja de menores.
      NOTA: luciferina Armazenar a -80 ° C e protegido da luz até à utilização.
   2. Injectar 250 ul a cada rato por IP para conseguir 125 mg / kg em cada rato. Anestesiar os ratos do mesmo grupo em conjunto, utilizando isoflurano inalado (1,5% -2,0%) em uma caixa selada. Aplicar vet pomada em the olho para evitar ressecamento.
      NOTA: O tempo necessário para que os ratos de dormir (10-15 min) permitiu atividade luciferina a pico. Mantenha o tempo consistente entre os grupos para evitar variação.
5. Transferir os ratos imediatamente a fase câmara de imagem e manter a anestesia em 1,5-2% de isofluorano durante os procedimentos de imagiologia. Ratinhos imagem sequencial com 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, e 300 segundos de exposição. Capturar imagens e quantificar a intensidade de bioluminescência usando aquisição de imagem e software de análise. Na sequência de imagens devolver os ratos volta a sua jaula.
6. Para, células de medula óssea no total in vivo quimerismo colheita. Eutanásia os ratos com CO ₂ para 5 min seguido com luxação cervical. Colher os ossos e esmagar em 4 ml de PBS frio para recolher a medula óssea. Analisar as células positivas por cento de cereja sob microscópio de fluorescência e quantificar utilizando FACS. Recolha vinte mil eventos de cada amostra.

Resultados

Surgimento de mutações genéticas coloca grande desafio para a terapia anti-quinase alvo. Estudos de mutação, além de proporcionar idéias mecanicistas e funcionais, que são fundamentais para a seleção e projeto de desenvolvimento de medicamentos de última geração, também permite uma melhor gestão clínica e pode, no futuro, ser mais útil para o tratamento personalizado. Neste experimento, mostramos triagem para mutações de resistência ruxolitinib em JAK2 V617F-quinase (Figura 1). Const...

Discussão

O sucesso clínico de imatinib no tratamento da CML demonstrado não só o potencial de atacar as quinases rouge por inibidores de moléculas pequenas, mas também descoberto limitações de terapia direcionada: recaída clínica e aparecimento de mutações de resistência a drogas no gene alvo. Identificação de mutações de resistência ajuda na melhor gestão clínica e desenvolvimento de inibidores de próxima geração. Este protocolo descreve uma metodologia para a identificação de mutações resistentes a dr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell and Tissue culture
BaF3 Cells	ATCC
HEK293T cells	ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW	A gift from Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW	Made in house
pMSCV-V617F-Cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW	Made in house
pMSCV-Luciferase-puro.GW	Made in house
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1X	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/ml stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)	ChemieTeK	941678-49-5
WST-1	Roche	11644807001
0.45 micron disc filter	PALL	2016-10
70 micron nylon cell strainer	Becton Dickinson	352350
Bacterial Culture
XL-1 red E. coli cells	Agilent Tech	200129
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/ml stock solution
Bacto agar	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit	Qiagen	69506
Expand long template PCR system	Roche	1168134001
Wizard Sv gel and PCR clean up system	Promega	A9282
Pure Yield plasmid mini prep system	Promega	A1222
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells	Invitrogen	12535029
Gateway  LR Clonase Enzyme mix	Invitrogen	11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade	Promega	P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor centrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD		This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting