Aproveitando-se de Redução Interação gota-superfície para otimizar o transporte de Bioanalytes em microfluídica Digital

Resumo

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

Resumo

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of “lab-on-a-chip” platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.

Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.

Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

Introdução

A miniaturização dos dispositivos que funcionam com líquidos é de suma importância para o desenvolvimento de plataformas "lab-on-a-chip". Nesse sentido, as duas últimas décadas têm testemunhado um progresso significativo na área da microfluídica, com uma variedade de aplicações. ^1-5 Contrastando com o transporte de fluidos em canais fechados (canal microfluídicos), DMF manipula gotas em matrizes de eletrodos. Um dos méritos mais atraentes desta técnica é a ausência de partes móveis para o transporte de fluidos, e movimento é imediatamente interrompida ao desligar sinais elétricos.

No entanto, o movimento das gotículas é dependente de conteúdos das gotículas, certamente uma característica indesejável para uma plataforma universal "lab-on-a-chip". Gotículas contendo proteínas e outros analitos aderir a superfícies do dispositivo, tornando-se inabalável. Indiscutivelmente, esta tem sido a principal limitação para o alargamento do âmbito de aplicações DMF; ^6-8alternativas para minimizar a proliferação indesejada superfície envolvem a adição de espécies químicas extras para a gota ou seus arredores, o que poderia afetar o conteúdo da gota.

Anteriormente, o nosso grupo desenvolveu um dispositivo para permitir o transporte de células e proteínas em DMF, sem aditivos adicionais (dispositivos Campo-DW). ⁹ Isto foi conseguido através da combinação de uma superfície com base na fuligem vela, ¹⁰ com uma geometria do dispositivo que favorece a gotícula de rolamento e leva a uma força ascendente sobre a gotícula, diminuindo ainda mais a interacção gotícula-superfície. Nesta abordagem, gota movimento não está associado a molhar a superfície ^11.

O objectivo do método descrito abaixo é detalhado para produzir um dispositivo de DMF capaz de transportar gotas contendo proteínas, células e organismos inteiros, sem aditivos adicionais. Os dispositivos de campo-DW pavimentar o caminho para as plataformas totalmente controlados que trabalham em grande parte de forma independente da gota de químicory.

Aqui, nós também apresentam simulações mostra que, apesar da alta tensão necessária para o funcionamento do dispositivo, a queda de tensão através da gotícula é uma pequena fracção da tensão aplicada, indicando efeitos insignificantes sobre bioanalytes no interior da gotícula. Na verdade, os testes preliminares com Caenorhabditis elegans (C. elegans), um nemátodo usado para uma variedade de estudos em biologia, mostram que os vermes nadar sem perturbações como as tensões são aplicadas.

Protocolo

NOTA: Nos procedimentos descritos a seguir, as diretrizes de segurança do laboratório deve ser sempre seguido. De particular importância é a segurança quando se lida com alta voltagem (> 500 V) e de manuseamento de produtos químicos.

1. revestimento de um substrato condutor com vela Fuligem

1. Cobre corte de metal em retângulos (75 x 43 mm, 0,5 mm de espessura). Limpe cada substrato de cobre por imersão em etchant cobre por cerca de 30 segundos, lavar com água corrente por cerca de 20 segundos, e seque com papel.
   NOTA: Se estiver usando o método 1 a seguir, alterar as dimensões de 75 x 25 mm para caber na máquina.
2. Varrer uma vela de parafina iluminada sob o substrato de cobre durante 30-45 segundos, para se obter um revestimento de fuligem aproximadamente uniforme (cerca de 40 um de espessura). Mantenha o substrato em ~ 1 cm para dentro da chama. Não toque na superfície fuligem frágil.

2. Proteger a camada de fuligem com Revestimento

NOTA: A camada de fuligem é muito frágil, E devem ser revestidos para protecção. Duas alternativas simples (métodos 1 e 2 abaixo) são sugeridos aqui, mas protocolos mais robustos estão atualmente em desenvolvimento.

1. Método 1
   1. Coloque a amostra para o evaporador de metal ou de sistema de pulverização. Seguindo os procedimentos de funcionamento do sistema, evacuar a câmara, e começar a deposição controlada de ouro sobre a camada de fuligem (150-200 nm). Deixe o dispositivo de arrefecer até à temperatura ambiente.
   2. Dip-revestir o substrato metalizado em uma solução de 1-dodecanotiol (1% v / v, em etanol a 95%, ACS / grau USP), durante 10 minutos dentro de uma capa química. Então, segurando o aparelho em um ângulo perto de 60 °, lavar cuidadosamente a superfície com várias gotas de etanol só. Deixe os dispositivos seca, durante a noite.
2. Método 2
   1. Em uma capa de química, imediatamente depois do revestimento do substrato com a fuligem e ao mesmo tempo o substrato ainda está quente da chama da vela, depositar algumas gotas de líquido fluorado sobre um lado dosubstrato, e inclinar o substrato a um ângulo próximo de 90 °. Deposite mais gotas, e deixá-los rolar sobre a superfície inteira fuligem.
      NOTA: Quando a gota cai em um ponto, a fuligem serão lavados daquela área. Deixe as gotículas de líquido propagação fluorado, tanto quanto possível.
   2. Asse o substrato sobre uma placa quente (160 ° C durante 15 min) no interior de uma capa química.
   3. Deixe o substrato se sentar durante a noite à temperatura ambiente antes do uso. Armazenar indefinidamente.

⁽¹² Adaptado de Abdelgawad et al.) 3. Fabricação de Top Eletrodos

1. Desenhe os eletrodos utilizando software de design gráfico. Cada eletrodo é de 2 mm de comprimento, 0,3 mm de largura, ea diferença entre os eletrodos é de 0,3 mm. A diferença entre contatos (para encaixar no conector, veja abaixo) é de 2,3 mm (Figura 1).
2. Apare um laminado de cobre flexível (35 mm de espessura) para o formato Monarch (3,87 x 7,5 polegadas). Use outros tamanhos if compatível com a impressora. Coloque o laminado na bandeja de alimentação manual de uma impressora colorida.
3. Certifique-se de usar o "preto rico", ou "Registro de preto", ao imprimir na folha de cobre (ver ¹² Abdelgawad et al. Para mais detalhes) para permitir que uma camada mais densa de tinta preta sobre o substrato de cobre, protegendo o padrão impresso durante gravura . Deixe o substrato seco impresso completamente, durante a noite.
4. Dentro de uma capa química, aquecer (40 ° C) num copo com 50 ml de produto corrosivo de cobre. Mergulhe o laminado impresso no copo e agite-o na solução por cerca de 10 min. Tempo de condicionamento depende da solução de produto corrosivo de cobre. A cada poucos minutos, verifique a corrosão e ver se o padrão está intacta.
5. Cuidadosamente lavar o laminado com água, e remover o revestimento com acetona e etanol na capa química. Lavar uma vez, e seca suavemente com a toalha de papel laminado.
6. Cuidadosamente anexar o laminado com eletrodos a uma ABLslides ss (75 x 25 mm, ~ 1 mm de espessura), usando fita dupla face. Evite bolsas de ar.
7. Anexar um filme de perfluoroalcoxi PFA aos eletrodos utilizando fita. Isso serve para evitar o contato acidental dos eletrodos com a gota, o que prejudica top eletrodos devido a curto-circuito.

4. A interface eletrônica (circuito na Figura 2)

1. Soldar os relés e os capacitores C a uma placa de circuito universal.
2. Monte o restante dos 10 pilotos de revezamento em uma placa de ensaio sem solda para circuitos eletrônicos.
3. Fio de entrada de cada motorista relé para um canal na placa de controle.
4. Tirar com cuidado os melhores eletrodos em um conector (Figura 3). Fio condutor de saída de cada retransmissão a um eléctrodo de topo, como mostrado na figura. Note que existe um contato do conector aterrado entre um par de fios de relés, para minimizar o ruído elétrico.
   NOTA: O conector fica em uma plataforma ajustável para controlar tele distância (0,1-0,5 mm) entre o substrato superior e inferior (fuligem-revestido).
5. Utilizar um programa para controlar a temporização para a aplicação de alta voltagem (HV) (cerca de 0,8 seg) para quatro eléctrodos, ao mesmo tempo, deslocando um eléctrodo na direcção de movimento (ou seja, durante 0,8 seg, accionar 1234; em seguida, 2345, 3456, etc. ., 0,8 segundos para cada grupo, e depois para trás, move-se de forma de gotículas na direcção oposta, como bem).

5. Visualização Gota e Manuseio

1. Para gravar gotícula de movimento, utilizar o sistema de visualização, o qual é composto por uma 24X - montagem de ampliação 96X combinado com uma câmara CCD. Ligue o gravador de vídeo para a câmera usando S-video.
2. Pipetar uma gota de 4 ul contendo C. elegans em meios na parte inferior do substrato revestido de fuligem.
3. Trazer os melhores eletrodos para ~ 0,3 milímetros acima da gota. A gota deve ser próximo ao centro, logo abaixo do quinto eletrodo, para facilitar a operação.
4. Ligue a interface eletrônica e alta tensão (500 V _RMS), e ajustar a distância do eléctrodo superior à gota, até que começa a se mover. Não deixe que os melhores eletrodos tocar a gota.
5. Recolha de dados de registo do número de transferências de gotículas de sucesso no dispositivo em resposta a impulsos eléctricos. Uma experiência de sucesso é caracterizado por, pelo menos, 700 transferências de gotículas, ou seja, uma transferência após cada pulso eléctrico.
6. Recolha de dados continuamente, até que a gotícula não mais mover-se em resposta a 5 a 10 pulsos.
   NOTA: Quando a superfície começa a degradar-se, o movimento pode ser restaurado, trazendo os melhores eléctrodos mais perto da gotícula.

Resultados

Anteriormente, foram utilizados dispositivos Campo-DW para permitir o movimento de proteínas em DMF. Em particular, as gotas com albumina de soro bovino (BSA) pode ser movido a uma concentração 2000 vezes mais elevada do que o relatado anteriormente por outros autores (sem aditivos). Isto era devido à interacção reduzida entre as gotículas e a superfície; A Figura 4 mostra uma gota contendo fluorescentemente marcado com BSA (ver Freire et al ⁹ para obter mais informação sob...

Discussão

A etapa mais crítica do protocolo é a proteção da camada de fuligem, diretamente associado ao sucesso em gotas em movimento. Metalização da camada de fuligem (método 1 acima) permite que perto de 100% de sucesso de fabricação. No entanto, o tempo máximo de operação é de cerca de 10 min; possivelmente, fracções de gotículas são molhar a fuligem através de furos na camada de metal. Revestimento da camada de fuligem com o líquido fluorado é a alternativa mais fácil e rápida, e exige o mínimo de recur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin candle			Any paraffin candle
Sputtering system	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Other softwares might be used as well.
Copper laminate	Dupont	LF9110
Laser Printer	Xerox	Phaser 6360 or similar	Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 or similar	Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board	Allied Electronics	70219535 or similar
Connector	Allied Electronics	5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software)	National Instruments	NI-6229 or similar
High-voltage amplifier	Trek	PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relay	Allied	8862527
Visualization system	Edmund Optics	VZM 200i or similar	System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC or similar	It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4