Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Faz com cistos no peixe-zebra Rins

Resumo

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Resumo

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introdução

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões têm sido amplamente utilizados como um modelo para estudar o desenvolvimento renal e doença renal policística. Há muitas vantagens na utilização do peixe-zebra como um modelo animal: a viabilidade de estudar interacções genéticas, a capacidade de usar morpholinos anti-sentido (MO) para knockdown proteína, a oportunidade para ensaiar rapidamente um grande número de embriões, e a facilidade de visualização de órgãos em fenótipos ¹ larvas vivas. Os pronephros é o primeiro rim para desenvolver nos vertebrados e é funcional em peixes-zebra larval ^2. A estrutura dos pronephros peixe-zebra é relativamente simples quando comparado com os metanefros de mamífero, o terceiro e último rim para desenvolver em mamíferos. O néfron é a unidade de trabalho do rim, com cada rim humano que contenham entre 500,000-1,000,000 néfrons ^3,4 e cada rim do rato tendo aproximadamente 13.000 néfrons ^5, o que torna difícil observar a estrutura de néfrons único in rins humanos ou do mouse. O peixe-zebra tem apenas dois nefrónios, cada nefrónio peixe-zebra e contém todos os componentes principais encontrados nos glomérulos e túbulos de ratos e seres humanos ⁶ e tipos de células renais especializadas semelhantes. Comparado a outros modelos de vertebrados, como Xenopus, o néfron zebrafish mais se assemelha a de néfrons mamíferos porque tem um sistema fechado ^7.

Nos últimos anos, o genoma do peixe-zebra foi sequenciado, permitindo a ampla introdução de ferramentas genéticas, amplos recursos mutantes, e coleções de linhas repórter transgênicos em modelos de peixe-zebra. Os peixes-zebra pronephros formas entre 12-72 h pós fertilização (hpf) e podem ser facilmente visualizados em embriões transparentes. Proteína tumor do Wilm WT1 é um fator essencial para o desenvolvimento do rim. Linhas de peixes-zebra transgénicos que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostram GFP expression especificamente localizados em regiões pronephric em embriões de peixe-zebra, a partir de 17 hpf ^8. Nephronophthisis (NPHP), uma doença do rim autossómica recessiva cística, é causada por mutações de genes NPHP ^9. NPHP4 knockdown por morfolino causou a formação de cistos na Tg (wt1b: GFP). Fish ¹⁰ Portanto, este peixe transgênico é um modelo adequado para a observação de estruturas renais e formação de cistos durante o desenvolvimento do rim. Importante, a influência de moduladores de desenvolvimento do rim pode ser estudada usando esta estirpe em um tempo de trabalho e modo eficiente.

Nosso trabalho descreve o uso de Tg (wt1b: GFP) de peixe como um modelo para visualizar a formação de cistos nos rins depois de modulação gene. Usamos partida e emenda local anti-sense MOs derrubar o gene Wnt5a no peixe-zebra. Wnt5a é uma glicoproteína segregada não canónicas da família Wnt, que desempenha um papel importante no desenvolvimento de vários órgãos e pós-natal celularfunção ^11. Wnt5a funciona através de vias de Wnt não canónicas, incluindo a via de polaridade celular planar (PCP), que tem sido encontrado para desempenhar um papel na divisão celular orientada durante o alongamento tubular renal. Wnt5a regula a via Wnt / PCP, formando um complexo com o receptor de tirosina cinase semelhante (Ryk), que transduz mais Wnt5a sinalização através da formação de um complexo com a proteína da polaridade celular planar VANGL 2 (Vangl2), promovendo assim a estabilidade Vangl2 ^12. Os defeitos na via de PCP pode resultar na divisão celular aleatória e causar a formação de quistos renais. Utilizou-se o Tg (wt1b: GFP) linha peixe-zebra para observar a formação de cistos nos rins seguinte Wnt5a knockdown. A Tg (wt1b: GFP) modelo de peixe-zebra permite imagens ao vivo e observação oportuna da estrutura renal. Após Wnt5a knockdown, formação de cistos nos rins foi encontrado com início às 24 hpf; a 72 hpf, os cistos podem ser encontrados nos glomérulos e dos túbulos proximais. Este método também poderia ser usado para screen outros genes que podem causar a formação de cistos nos rins.

Protocolo

Declaração de Ética: NOTA: Todas as experiências de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Eastern Virginia Medical School.

1. Preparação Morpholino

1. Concepção e síntese de tradução-bloqueio (AUG-) e de inibição de splicing (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para o gene de interesse, conforme as instruções do fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte as informações do fabricante na Tabela 1.
   NOTA: MOs são enviados como ações liofilizada em garrafas de vidro.
2. Adicionar alto grau de água estéril para os frascos de vidro para re-suspender OMs para uma concentração final de 25 ug / uL. Certifique-se de que o oligonucleótido esteja completamente dissolvido. Se alguns restos sólidas, aquecer o frasco contendo a solução de estoque de oligonucleótido a 65 ° C durante 5 a 10 min e agitar com vortex brevemente.
3. Guardar a solução estoque MO na RT. Não armazená-los a 4 ° C ou -20 ° C; C, porque temperaturas mais baixas, pode causar o oligonucleótido MO para se ligarem à parede do recipiente. Medir a concentração da solução-mãe usando um espectrofotómetro (consulte a tabela 1) cada vez que uma nova solução de estoque MO é feita.
4. Preparar a solução de trabalho de MO no dia da injecção por diluição da solução de reserva com alto grau de água esterilizada para a dose desejada. Adicionar 0,5% de vermelho de fenol para atingir uma concentração de 0,05%. Por exemplo, para fazer a solução de trabalho 5 ul com uma concentração de 15 ng / nL, adicionar solução de estoque 3 ul MO e 0,5 ul de 0,5% de vermelho de fenol para 1,5 ul de água.
   NOTA: Com esta concentração de trabalho, cada gota (500 pl) de injeção contém 7,5 ng de MO e duas gotas conter 15 ng de MO.

2. Preparação do aparelho de injecção

1. Vidro Compra agulhas pré-puxou (por favor, consulte a Tabela 1 para obter informações detalhadas). Como alternativa, puxe a agulha wi injeção de vidroth um puxador de agulha.
2. Ligue o compressor de ar e ajuste a configuração para 50 psi de pressão. Ligue a fonte de luz microscópio de dissecação e Pico bomba de micro-injecção e ajustar as configurações da seguinte forma: segurar a pressão de 20 psi, ejetar 10 psi de pressão, valor do período de 2,5 e 100 ms gama de gating.
3. Carregar o vidro pré-agulha puxada com 5 ul de solução de injecção e colocar a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Espere até que toda a solução atingir a ponta da agulha sem bolhas de ar visíveis. Inserir o suporte de agulha numa posição adequada ao lado do microscópio e inserir a agulha no suporte de vidro. Ajustar o ângulo de injecção de 45 graus.
4. Traga a ponta da agulha em vista ao microscópio, de alta para fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Quebre a ponta da agulha com uma pinça de ponta fina.
5. Coloque uma régua e um tubo capilar com diâmetro interno de 0,15 mm de lado a lado, sob o microscópio;injectar a solução em uma extremidade do tubo capilar para fazer uma coluna de líquido. Ajustar o tempo de ejecção para chegar a cada 17 gotas por 1 milímetro de comprimento da coluna de líquido, então o volume de cada gota nl é 1 (volume da gota π = raio x ² x comprimento (coluna de líquido) / contagem (de gotas).
   NOTA: Uma gota com um diâmetro de 0,1 mm dá um volume de injecção de cerca de 500 pl (volume da gota = 4/3 x π raio x ^3).

3. Preparação de Fertilized embriões Zebrafish e injeção com Morpholinos

1. Configure Tg (wt1b: GFP) casais reprodutores de peixes-zebra transgénicos acordo com protocolos publicados para criação de peixe-zebra padrão e manutenção. Coletar embriões após desova natural, e mantê-los em uma placa de Petri 10 centímetros cheia de água E3 (5 mM NaCl, 0.17mm KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4). Comece injeção MO imediatamente ^13. Monitorar morfologia do embrião sob o microscópio e certifique-se de injeção MO está no um-estágio de célula, ou o mais tardar no estágio de quatro células.
   1. Transferir os embriões para a placa de Petri 10 centímetros com cunha em forma de agar calhas. Aspirar a água E3 extra e pressione suavemente os embriões nas calhas.
   2. Manipular os embriões com a micropipeta para visualizar embriões em estágio 1 de células ao microscópio de dissecação. Penetrar no cório e, em seguida, a gema para injectar uma ou duas gotas de MO na gema (1 gota = 500 pl). Transferir os embriões injectados com 10 cm de placa de Petri com água E3 e incubar a 28,5 ° C.
2. Após as injeções, remover os embriões mortos e registrar o número de embriões injetados. Substitua a água E3 no prato a cada 24-48 horas.

4. Experimentos Fenótipo de resgate

1. Selecione uma orthologue de outra espécie que tem uma estrutura de pares de bases principal diferente (geralmente 3-7 descasamentos de pares de bases) e é, portanto, resistentes à MO, para o salvamento. Por exemplo, neste experimento, escolhemosrato, porque a sequência de ratinho Wnt5a ARNm é diferente da sequência de peixe-zebra.
2. Conceber um conjunto de iniciadores com o iniciador directo de partida no local da translação e o iniciador reverso de perto para o fim da região de codificação do ARNm. Adicionar uma sequência do promotor de T7 na extremidade 5 'da sequência iniciadora para a frente. Neste experimento, foram utilizadas as seguintes as seqüências de primers; para a frente: 5'- taa tac GAC TCA tag cta gga cta tga tgc tgc tga AGC tga a- 3 'e inverter: 5'- TCA ctt gca GAC gta ctg gtc- 3'.
3. Executar um 50 ul de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) com o conjunto de iniciadores (0,5 uM de cada iniciador) concebido de cima e de 0,1 ug de ADN molde contendo a sequência de rato Wnt5a ADNc com o seguinte programa de PCR: 1 ciclo a 95 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 95 ° C (30 s), 58,5 ° C (30 segundos), 72 ° C (1 min); e passo de extensão final a 72 ° C durante 7 min.
4. Depois de terminar tele de bicicleta, correr 2 l do produto da PCR em gel de agarose 1% para garantir que a banda é o tamanho certo. Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Verifique concentração de DNA com um espectrofotômetro. Armazenar o produto de PCR purificado a -20 ° C ou se utilizar directamente na tampado transcrição de ARN no passo seguinte.
5. Sintetizar in vitro de mRNA tampado com um kit de síntese de ARN tampado acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se o ARNm em 20 ul de ARNase isenta de água e determinar a concentração. Alíquota da RNA e armazenar a -80 ° C.
6. No dia da injecção, preparar uma solução de trabalho do mRNA com água estéril livre de RNase. Note-se que 40 pg é geralmente a dose mais elevada de ARN em que os efeitos não específicos ou tóxicos do ARN não ocorrem. Manter a solução de trabalho em gelo. Injectar o embrião com MO e, em seguida, o mRNA de resgate, ou co-injectar os dois juntos. Por exemplo, se a concentração da prepar ARNmed no passo 4.5 é de 0,6 mg / mL, adicionar 0,67 mL de ARNm (0,4 ug) de 4,33 ul de ARNase isenta de água para fazer uma concentração final de 0,08 mg / mL, seguida de uma gota (500 pl) de cada injecção contém 40 pg do ARNm. Prepare MO como descrito na etapa 3.

5. Preparação de embriões injetados para imagens fluorescentes

1. Após incubação a 28,5 ° CO / N, adicionar 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para a água para impedir a melanização E3, que afecta a observação da estrutura pronephros utilizando microscopia de fluorescência. No entanto, não adicione PTU antes gastrulação, porque afeta o desenvolvimento embrionário precoce.
2. Às 48 hpf, dechorionate manualmente os embriões com uma pinça fina. Tire fotos de 48 e 72 embriões HPF sob uma dissecção microscópio de luz.
   NOTA: Estas imagens podem ser tomadas sem anestesia.
3. Aproximadamente 10 minutos antes da imagiologia sob o microscópio de fluorescência, anestesiar os embriões, colocando-os emuma placa de Petri contendo 10 centímetros de 160 ug / ml tamponado tricaina. Aguarde 5-10 min, e em seguida, toque levemente o peixe-zebra para confirmar que eles não se movem e, portanto, a anestesia está funcionando.
4. Depois os embriões são anestesiados, montá-los em 3% metil celulose e orientá-los em uma posição propensa sob um microscópio de dissecação (consulte a Tabela 1).
5. Observe a estrutura pronephros sob um microscópio de fluorescência (consulte a Tabela 1) e tirar fotos em diferentes ampliações (10x e 20x).

Resultados

Wnt5a derrubar foi conseguido através da introdução de tradução bloqueando MO (AUG-MO) ou exon / intron fronteira emenda MO (tala-MO) para embriões de peixes-zebra no estádio de uma célula. O AUG-MO tem como alvo o codão de iniciação e, portanto, inibe tanto a mensagem Wnt5a materna e zigótica. A tala MO-alvo o terceiro local de splice dador e inibe apenas a transcrição zigótica de Wnt5a (Figura 1A). O AUG- e morphants splice- phenocopied uns aos outros com defeitos múl...

Discussão

Doença policística dos rins (PKD) é uma das principais causas da doença renal da fase final em seres humanos e é caracterizada pela formação progressiva cisto, o alargamento renal e desenvolvimento anormal túbulo ^14. Autossómica dominante de PKD (ADPKD) é uma doença genética em que a mutação de qualquer um de PKD1, que codifica policistina-1 (CP1), ou PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), resulta em doença renal policística. Muitos outros genes, especialmente aqueles que codificam proteínas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop