Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Resumo

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Resumo

Red / terapia near-infrared luz (R / NIR-LT), entregue por laser ou diodo emissor de luz (LED), melhora os resultados funcionais e morfológicas em uma série de lesões do sistema nervoso central em vivo, possivelmente reduzindo o estresse oxidativo. No entanto, os efeitos do R / NIR-LT sobre o stress oxidativo têm sido mostrados para variar, dependendo do comprimento de onda, ou a intensidade da irradiação. Estudos comparando parâmetros de tratamento são escassos, devido à ausência de dispositivos disponíveis no mercado que oferecem vários comprimentos de onda ou intensidade, adequado para alta through-colocar em estudos de otimização in vitro. Este protocolo descreve uma técnica para a distribuição de luz num intervalo de comprimentos de onda e intensidades para optimizar as doses terapêuticas requeridas para um dado modelo de lesão. Colocámos a hipótese de que um método de entrega de luz, na qual os parâmetros de comprimento de onda e intensidade pode ser facilmente alterada, pode facilitar a determinação de uma dose óptima de R / NIR-LT para reduzir as espécies reactivas de oxigénio(ROS) in vitro.

Luz de xénon não coerente foi filtrada através de filtros de interferência de banda estreita para proporcionar diferentes comprimentos de onda (comprimentos de onda centro de 440, 550, 670 e 810 nm) e as densidades de energia (8,5 x 10 ^-3 a 3,8 x 10 ^-1 J / cm ²⁾ de luz para células de cultura. A emissão de luz a partir do aparelho foi calibrado para emitir, as doses terapeuticamente relevantes quantais iguais de luz em cada comprimento de onda. Espécies reactivas foram detectados em glutamato salientou células tratadas com a luz, utilizando DCFH-DA e H ₂ O ₂ corantes fluorescentes sensíveis.

Nós entregue com sucesso luz na faixa de fisiologicamente e comprimentos de onda e intensidades terapeuticamente relevantes, para células de cultura expostas a glutamato como um modelo de lesão do SNC. Embora as densidades de energia de R / NIR-LT utilizados no presente estudo, não exerceu um efeito sobre ROS gerada pelas células cultivadas, o método de entrega de luz é aplicável a outros sistems incluindo mitocôndrias ou mais modelos de cultura fisiologicamente relevantes fatia organotípicas isolado, e poderia ser utilizado para avaliar os efeitos sobre uma gama de medidas de resultado do metabolismo oxidativo.

Introdução

Espécies reactivas de oxigénio (ROS) são necessárias para uma variedade de vias de transdução de sinal, e por reacções normais do metabolismo celular, incluindo aqueles de ^uma neuroprotecção. No entanto, quando o mecanismo antioxidante endógeno são incapazes de controlar a produção de ROS, as células podem sucumbir ao estresse oxidativo ^2,3. Após lesão do SNC, os aumentos associados na presença de ROS e stress oxidativo estão pensados ​​para desempenhar um papel importante na progressão da lesão ^4,5. Apesar da extensa série de estratégias para atenuar o estresse oxidativo que foram avaliados, não existem actualmente, estratégias anti-oxidantes clinicamente relevantes totalmente eficazes para atenuar a produção de ROS e estresse oxidativo associado no uso clínico seguinte neurotrauma ^6. Por conseguinte, a atenuação de estresse oxidativo continua a ser um objectivo importante para a intervenção terapêutica ^7.

Melhorias seguiring R / NIR-LT têm sido relatados em uma ampla gama de lesões e doenças, incluindo reduções no tamanho do infarto do miocárdio, complicações renais e hepáticas durante diabetes, degeneração da retina, lesões do SNC e acidente vascular cerebral ^8, talvez por reduzir o estresse oxidativo. Com especial atenção às lesões do SNC, os estudos pré-clínicos de eficácia de luz 670nm têm mostrado bons efeitos em modelos de degeneração da retina ^9-11, lesão medular ^12, a morte neuronal ^13. Os ensaios clínicos foram conduzidos para a idade degeneração macular relacionada à seca e estão em andamento para o curso ^{de 14,} no entanto, os resultados destas experiências não parecem promissores, talvez devido a uma falha de empregar um tratamento eficaz parâmetros ^15. Como tal, R / NIR-LT não tem sido amplamente adotado como parte da prática clínica normal em neurotrauma, apesar de ser um fácil de administrar, não-invasivo e tratamento relativamente barato. Barreiras à tradução clínica incluem a falta de uma clprimitiva entendeu mecanismo de ação e ausência de uma efetiva ^16,17 protocolo de tratamento padronizado. A literatura atual sobre a terapia da luz revela uma infinidade de variações nos parâmetros de tratamento no que diz respeito às fontes de irradiação (LED ou laser), comprimento de onda (por exemplo, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), a dose total (joules de irradiação / unidade de área), duração (tempo de exposição), timing (pré ou pós-insulto), frequência de tratamento e tipo de parto (pulso ou contínuo) ^8. A variabilidade dos parâmetros de tratamento entre os estudos torna a comparação difícil e tem contribuído para o ceticismo quanto à eficácia ^16.

Portanto, a optimização de R / NIR-LT é claramente necessária, com sistemas de cultura de células com capacidade para fornecer o mecanismo de rastreio de alto débito necessário para comparar as múltiplas variáveis. No entanto, existem alguns sistemas de iluminação disponíveis no mercado que podem fornecer flexibilidade e controle suficiente sobre wavelength e intensidade para realizar tais experimentos de otimização. Comercialmente disponíveis dispositivos LED, geralmente não são capazes de fornecer múltiplos comprimentos de onda ou de intensidade, resultando em vários investigadores que utilizam dispositivos de diferentes fabricantes de LED, a qual pode variar não só na intensidade, mas também o espectro de comprimento de onda da luz emitida. Temos abordado esta questão através do emprego de uma fonte de luz Xenon banda larga filtrada através de filtros de interferência de banda estreita, gerando assim uma gama de comprimentos de onda e fluências de luz, permitindo um controlo apertado, preciso dos parâmetros do R / NIR-LT.

É importante notar que a dose terapêutica do tratamento é definido pelo número de fotões que interagem com o photoacceptor (cromóforo), que, no caso de R / NIR-LT é postulada como sendo o citocromo c oxidase (COX) ^18. Energia Photon entregue varia de acordo com o comprimento de onda; significando doses iguais de energia em diferentes comprimentos de onda será comvalorizada de diferentes números de fótons. Por conseguinte, a luz emitida a partir do dispositivo foi calibrado para emitir um igual número de fótons por cada um dos comprimentos de onda escolhidos para ser testado. Nós desenvolvemos um sistema que pode ser utilizado para entregar R / NIR-LT a uma gama de comprimentos de onda e intensidades para as células in vitro e demonstraram a capacidade para medir os efeitos da entregues R / NIR-LT sobre a produção de ROS nas células sujeitas a estresse glutamato.

Protocolo

1. Optical Calibration: Medindo Light Output

1. Para preparar o aparelho de distribuição de luz, ligar uma fonte de luz de banda larga (por exemplo, Xenon ou lâmpada de tungsténio) para uma fonte de alimentação adequada. A posição de uma lente de colimação em frente da fonte de luz para produzir um feixe colimado de luz. Passar a luz através de um filtro de calor líquido para remover a maior parte do calor do feixe de luz. Dependendo da aplicação, focar o feixe colimado sobre a abertura de entrada de um guia de luz líquido, o qual proporciona uma distribuição mais flexível da luz (por exemplo., Numa incubadora).
2. Na outra extremidade do guia de luz líquido, posicionar uma segunda lente de colimação e, em seguida, um suporte para a interferência e filtros de densidade neutros. Verifique se esse arranjo produz um local uniformemente iluminado de luz da faixa de onda e intensidade desejada.
   Nota: A distância entre a extremidade do guia da luz e o plano da amostra pode necessitar de variar em funçãoa área que deve ser iluminado, mas lembrar que, como a distância entre a extremidade do guia da luz aumenta, a intensidade da luz diminui. No presente estudo, essa distância é de 14 centímetros e produz uma secção transversal da viga que ilumina uniformemente numa área bem 3x3 sobre uma placa de 96 poços.
3. Certifique-se de que a luz difusa entre a lâmpada e componentes ópticos associados é incapaz de alcançar o espécime.
4. Ligue o refrigerador de água para o filtro de calor líquido e garantir que há intercâmbio de água através do revestimento do filtro. Ligue a fonte de energia da lâmpada e aguarde pelo menos 5 min para a fonte de luz de banda larga para se estabilizar. Nota: O uso do sistema de arrefecimento a água é necessária para impedir o excesso de aquecimento do dispositivo.
5. Selecione um filtro de interferência de banda estreita (geralmente descrito por seu comprimento de onda centro, transmitância de pico e largura à meia altura FWHM) de largura de banda () para gerar a banda desejada de iluminação. Nota: Os filtros de interferência de banda estreita utilizados no estudo foram 442 nm, 550 nm, 671 nm e 810 nm.
6. Medir a luz produzida pela lâmpada no plano em que a amostra está a ser posicionado durante o tratamento. Medir a luz utilizando uma sonda calibrada irradiância (colector de co-seno) ligado a um espectroradiómetro adequado, utilizando um software proprietário de acordo com as instruções do fabricante.
7. Use filtros de densidade neutra para ajustar a intensidade de luz até a saída desejado é obtido. Nota: No presente estudo, a intensidade de luz que passou por cada filtro de interferência é ajustada para proporcionar uma saída quantal igual em cada uma das quatro bandas de ondas de tratamento. É importante verificar a calibração regularmente, como a saída da lâmpada está sujeita a alterações.
   Nota: Seguindo-se o conjunto do aparelho, as células estão prontas para ser iluminado a Figura 1 é uma representação do equipamento de difusão de luz utilizado no presente estudo..

Figura 1. Imagem do aparelho de distribuição de luz. Illustrated são a fonte de energia de luz, lâmpada de xenon com habitação, lente de colimação, filtro de água, abertura de entrada, guia de luz líquido, segunda lente collimating, porta-filtro, quadro tratamento e fosco cartão preto. Note-se que os filtros de comprimento de onda e intensidade de banda estreita não são mostrados.

2. Preparação celular

1. O R / NIR-LT método de entrega descrito pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou no sistema de modelo in vitro; como tal, as descrições seguintes de cultura de células são em geral, utilizando técnicas bem estabelecidas para a cultura de feocromocitoma (PC12), Müller (RMC1) e células da retina mistas primárias.
2. Antes da semeadura de células para tratamento de luz e ensaio de estresse oxidativo, cultura células imortalizadas em seus respectivos meios de crescimento contendo suplementos adequados (eg., FBS, antibióticos) em flas T75ks até 70-80% de confluência.
3. Separar as células imortalizadas a partir de frascos T75, usando o método apropriado para o tipo de célula a ser testada, por exemplo., Tripsina. Se necessário, antes de prosseguir com a sementeira de células em 96 poços de placas de ensaio, os poços da placa de ensaio revestimento com 10 ug / ml de poli-L-lisina durante 1 hora (por ex., Para células PC12) ou 10 ug / ml de poli-L-lisina para 1h, seguida por uma incubação de S / N com 10 ug / ml de laminina (por exemplo., para as células da retina mistos).
4. Células de centrífuga para recolher o apropriado (por exemplo., 3 ​​min a 405 xg durante células PC12 ou 10 min a 218 xg durante células RMC1), remover o sobrenadante e ressuspender em 8 ml de meio de cultura celular apropriado.
5. Se as células da retina são misturados a ser utilizado, a partir de preparar P0-5 filhotes de ratos neonatal por digestão enzimática (papaína), de acordo com os procedimentos estabelecidos ¹⁹
6. Contar o número de células viáveis ​​excluindo 0,4% (w / v) de corante azul de tripano, utilizando um hemocitómetro.
7. Ajustar a densidade celular such células que será de aproximadamente 70-80% confluentes após 24 ou 48 horas em cultura. (Para células PC12 a densidade de sementeira é de 4,0 x 10 ⁵ células viáveis ​​/ ml, para as células RMC1, é 2,5 x 10 ⁵ células viáveis ​​/ mL e para as células da retina mistos é 8 x 10 ⁵ células viáveis ​​/ ml). Após a adição de células ou para placas de 96 poços claras ou negras (usados ​​para a H ₂ O ₂ ou ensaio de DCFH-DA, respectivamente), em 100 ul de meio de crescimento adequado, permitir que a placa se sentar sobre uma superfície plana a 37 ° C, 5 % de CO ₂ (ou o que quer que as condições são apropriadas para o tipo específico de célula) durante pelo menos 24 horas para permitir a aderência das células.
8. Células de cultura em meios de crescimento nos apropriados 96 bandejas bem até que eles sejam 70-80% confluentes (24h de PC12 e as células RMC1, 48h para as células da retina em comum).

3. A adição de glutamato Stressor a Células

1. Prepare monossódico do ácido L-glutâmico concentrações hidrato de sal estressor de 0-10mm em grow completo adequadomeios de cultura th.
2. Remova a mídia a partir das células e lavar cuidadosamente as células 3 vezes com PBS (PC12) ou HBSS (RMC1 e células da retina mistas). Após lavagens, adicionar meio contendo glutamato para um volume total de 100 ul / poço.

4. Primeiro doses de tratamento com luz

1. Imediatamente após a adição de glutamato ou o estressor de escolha, expor células para tratamento de luz nos comprimentos de onda e intensidades desejados, colocando sob o aparelho de distribuição de luz preparada. Certifique-se de alterar o resultado da quantal do feixe de luz, utilizando as combinações estabelecidas de filtros de densidade neutra, dependendo do comprimento de onda a ser administrado.
   Nota: Nas experiências actuais, expor as células a tratamento com luz durante 3 min a manter a temperatura em repouso as placas de 96 poços em um bloco 37 ^o C de calor. O tempo de tratamento pode ser variada como requerido.
   1. Coloque um cartão preto fosco debaixo das células para evitar a luz refletindo em poços adjacentes no 96-well tabuleiro designado para outros parâmetros de tratamento.
2. Se se deseja o tratamento por longos períodos de tempo, adicionar tampão de Hepes 25 mM para manter o pH do meio de cultura celular ou, de preferência, colocar as placas e aparelhos de tratamento dentro de uma incubadora com CO ₂ a concentração regulado para 5% de CO _2, ou as condições que são óptimas para o tipo de célula específico.
3. Após a conclusão do tratamento de luz, colocar as células numa superfície nivelada e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ (ou qualquer outra coisa condições são óptimas para o tipo de célula), durante 24 h.
   Nota: dosagens adicionais de R / NIR-LT pode ser administrado como descrito acima, se o desejar.

5. final Dosagem de tratamento de luz e Detecção de ROS

1. Antes de realizar a etapa final do tratamento de luz, preparar os reagentes a serem utilizados para a detecção de ROS. Preparar tampão de citrato 50 mM (pH 6,0), Triton X-100, e H ₂ O ₂ reagente de detecção funcionandosolução de (1: 2: 97 proporção de 10 mM de solução stock de reagente de H ₂ O ₂ de detecção; 10 U / ml de peroxidase de rábano; citrato de sódio 50 mM (pH 6,0)). Prepare a DCFH-DA com uma concentração final de 100 uM em meio adequado.
   Nota: reagente DCFH-DA por células PC12 está em meio RPMI, reagente DCFH-DA para células RMC1 está em meio DMEM. Note-se que os reagentes de detecção disponíveis comercialmente têm sensibilidades diferenciadas para ROS específico e reagentes devem ser escolhidos com cuidado para fornecer a informação desejada para uma aplicação individual.
2. Administrar o tratamento de luz para as células, como descrito no passo 4.1-4.1.2. Assegurar que as células estão sendo tratados com as fluências desejados / comprimentos de onda da luz.
3. Imediatamente após o tratamento de luz, remova a mídia contendo glutamato e lavar duas vezes com solução tampão apropriado (para células PC12, PBS é usado e para células RMC1, HBSS é usado). Realizar os ensaios de ROS nas células, como se segue:
   1. H ₂ O ₂ ensaio: adicionar 45 ul de tampão de citrato 50 mM (pH 6,0) e 5 ul de Triton X100 a cada um dos poços. Agitar suavemente as células num agitador orbital durante 30 segundos e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 15 minutos. Adicionar 50 ul de H ₂ O _{2 a} solução de trabalho de detecção e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Medir a fluorescência utilizando um leitor de placas com um comprimento de onda de excitação de 530 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm.
   2. DCF ensaio: adicionar 100 uL da solução de DCFH-DA de cada um dos poços de 100 uM e incubar durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO _2. Remover o meio contendo 100 uM DCFH-DA e lava-se com solução tampão adequado (como descrito acima) duas vezes. Adicionar 90 ul de solução tampão e 10 ul de Triton X-100 a cada um dos poços e agitar suavemente num agitador orbital durante 30 segundos antes dos 15 minutos de incubação a 37 ° C. Meça DCF fluorescência derivada usando um leitor de placas com um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um Wavel emissãoength de 530nm.
   3. Expresso ROS valores relativos à concentração de proteína de células remanescentes nos poços, utilizando um kit colorimétrico para quantificar a concentração de proteína de acordo com as instruções do fabricante, com referência a uma curva padrão para calcular mg de proteína.

Resultados

A saída de luz emitido num comprimento de onda de 670 nm foi calibrado usando filtros de densidade neutra, de modo a irradiar células com uma gama de densidades de energia que engloba uma dose de luz de 670 nm previamente demonstrado ser benéfico in vivo (0,3 J / cm ^{2) 20.} Como o número de filtros de densidade neutra em frente da fonte de luz aumentou, a intensidade (W / m ²⁾ diminuída, permitindo que menos que a luz passe para a área alvo. A Tabela 1 apresenta os dados de calibraç?...

Discussão

Temos adaptadas com êxito um sistema de entrega de luz preciso e calibrado para proporcionar um mecanismo para o estudo de optimização de R / NIR-LT in vitro. Parâmetros de comprimento de onda e intensidade da R / NIR-LT são capazes de ser manipulado com precisão e de forma eficaz usando este sistema. Determinou-se que o tratamento de luz das células não levar à morte da célula, apesar de ROS não foram reduzidos nos comprimentos de onda e as doses entregues, nos tipos de células testadas. As intensi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B