Imagem 3-D e Análise de Neurônios Infected<em&gt; In Vivo</em&gt; Com<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Resumo

Usando este protocolo, fomos capazes de imagem 160 um seções do cérebro de espessura de camundongos infectados com o parasita Toxoplasma gondii, que permite a visualização e análise da relação espacial entre o parasita encistamento eo neurônio infectado.

Resumo

Toxoplasma gondii é um parasita obrigatório, intracelular com uma ampla gama de hospedeiros, incluindo humanos e roedores. Em ambos os seres humanos e roedores, Toxoplasma estabelece uma infecção persistente ao longo da vida no cérebro. Enquanto esta infecção cerebral é assintomática na maioria das pessoas imunocompetentes, no desenvolvimento do feto ou indivíduos imunocomprometidos, como a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) pacientes, essa predileção por e persistência no cérebro pode levar a doença neurológica devastadora. Assim, é claro que a interacção Toxoplasma cerebral é crítico para a doença sintomática produzido pelo Toxoplasma, ainda que têm pouca compreensão da interacção celular ou molecular entre as células do sistema nervoso central (SNC) e do parasita. No modelo do rato do CNS toxoplasmose tem sido conhecida há mais de 30 anos, que os neurônios são as células em que o parasita persiste, mas há pouca informação disponível sobre o qualparte do neurônio é geralmente infectados (soma, dendritos, axônio) e se esta relação celular muda entre as linhagens. Em parte, esta falta é secundária à dificuldade de imagem e visualização de neurônios infectados inteiros a partir de um animal. Tais imagens tipicamente exigiria cortes seriados e costura de tecido fotografada por microscopia eletrônica, microscopia confocal após immunostaining. Através da combinação de várias técnicas, o método aqui descrito permite a utilização de secções espessas (160 um) para identificar e imagem inteira de células que contêm cistos, permitindo a visualização e análise de neurónios individuais, cronicamente infectadas tridimensional sem a necessidade de imunomarcação, microscopia electrónica ou cortes seriados e costura. Usando esta técnica, podemos começar a compreender a relação celular entre o parasita eo neurônio infectado.

Introdução

O objetivo geral deste método é a obtenção de alta resolução, imagens tridimensionais de neurônios individuais que são infectadas pelo parasita intracelular obrigatório Toxoplasma gondii.

Toxoplasma é muitas vezes considerada um dos parasitas mais bem sucedidas porque a sua gama de hospedeiro intermediário grande, que inclui os seres humanos e roedores. Em ambos os seres humanos e roedores, após a infecção aguda por meio da ingestão de alimentos ou água contaminados, Toxoplasma é capaz de causar uma infecção persistente do SNC através da conversão a partir da sua forma de replicação rápido (a taquizoíto) para a sua replicantes lento e encistamento forma (o bradyzoite ). Em indivíduos imunocompetentes, esta infecção latente CNS é pensado para ser relativamente assintomática, mas em indivíduos imunocomprometidos, tais como pacientes com Aids ou transplantados, recrudescência do parasita pode levar a toxoplasmose cerebral fatal ^1,2. Além disso, estudos recentes have demonstrado que a infecção com Toxoplasma latente pode conduzir a alterações comportamentais em roedores ^3,4, embora o mecanismo permanece desconhecido.

Surpreendentemente, apesar destes dados que destacam a importância da interação CNS- Toxoplasma, relativamente pouco se sabe sobre esta relação, especialmente no nível celular e molecular. A capacidade de estudar os aspectos, mesmo simples da interação cérebro-parasita tem sido prejudicado em parte por limitações tecnológicas. Por exemplo, a maior parte do trabalho que mostra que os neurónios são as células em que os cistos persistem tem sido feito com microscopia electrónica (EM) de ^5,6. Embora EM dá alta resolução, é demorado, trabalhoso e caro. Imunofluorescência (IF) ensaios foram recentemente utilizados em conjunto com microscopia confocal para confirmar o trabalho feito por EM ^7. Se os ensaios são tecnicamente fácil de executar e relativamente baratos, mas utilizando estas técnicas para understand a relação espacial entre o cisto eo neurônio infectados requer reconstrução de série, que é demorado, tecnicamente difícil, e pode levar à perda de informações valiosas. Assim, temos desenvolvido um método que pode ser usado com o modelo de ratinho de toxoplasmose cerebral e nos permite imagem da totalidade de neurónios infectados sem EM ou imuno-histoquímica (IHQ). Ao desenvolver essa técnica, podemos começar a explorar a relação entre celular da célula infectada e do cisto de uma forma relativamente rápida e barata.

O método foi desenvolvido combina técnicas mais recentes para compensação óptica e seções do cérebro de imagem grossas por microscopia confocal ⁸ com um sistema que marca em células in vivo que foram injectados com proteínas do parasita ^9,10. Neste sistema, que infectar ratinhos Cre-repórter que expressam uma proteína fluorescente verde (GFP) apenas após ¹¹ recombinação mediada por Cre com Toxoplasma Estirpes que expressam uma proteína fluorescente vermelha (RFP) e injectam recombinase Cre em células hospedeiras ^9. Esta combinação nos permite colher o cérebro de camundongo infectado após a infecção do SNC é estabelecida, cortar seções do cérebro de espessura, e rapidamente identificar áreas pertinentes para a imagem, encontrando o RFP ⁺ cistos. É importante notar que, como expressão numa célula hospedeira de GFP depende unicamente da injecção de Cre por parasitas, e não sobre a infecção, um número de células GFP ⁺ não contêm parasitas ^10. Como o objetivo deste protocolo é o de ser capaz de neurônios infectados imagem inteira, o foco é apenas na GFP ⁺ neurônios que contêm também uma RFP ⁺ cisto, mas o protocolo também pode ser usado para a imagem da GFP ⁺ / RFP ^- neurônios.

Uma vez que o cérebro infectado é colhida e seccionados, as seções são tornadas transparentes por clearing glicerol. Regiões apropriadas de seções são então fotografada com microscopia confocal, almugido visualização inédita de células hospedeiras infectadas e os parasitas encistadas na sua totalidade. Aqui nós fornecemos um protocolo completo para a identificação, limpeza opticamente, e de imagem infectado neurônios.

Protocolo

NOTA: Os ratos foram criados e mantidos em uma sala com temperatura controlada e umidade com 12 hr inverteu ciclos claro / escuro com comida e água disponível ad libitum na Universidade de Arizona. Os experimentos foram conduzidos sob as diretrizes e aprovação do Cuidado e Uso Comitê da Universidade do Arizona animal Institucional. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Os ratinhos Cre-repórter são em murganhos C57BL / 6 de fundo ¹¹ e estão disponíveis comercialmente.

1. Rato Infection

NOTA: O método de infecção com Toxoplasma gondii rato descrito abaixo foi usado em estudos anteriormente publicados ^10-12.

1. Crescer estirpes Toxoplasma em fibroblastos de prepúcio humano (HFFS) cultivadas em Dulbecco Modificado Alto Teor de Glucose Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, e 2 mM de L-glutamina (cDMEM) em um balão T-25 no interior de um 5% de _CO2 até parasitas formaram grandes vacúolos parasitóforos.
2. Parasitas de libertação seringa por raspagem células a partir do fundo do balão e passar a solução resultante através de uma agulha de calibre 25 ligada a uma seringa de 3 ml de 2 vezes no interior do frasco, em seguida, transferir toda a solução a uma seringa de 5 ml caso ligado a uma agulha de calibre 27 que foi colocado de cabeça para baixo dentro de um tubo cônico de 15 ml. Conecte o êmbolo para a seringa e passar a solução parasita dentro do tubo cônico.
3. Centrifugar o tubo durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante em seguida, voltar a suspender o sedimento em 4-6 ml estéril de grau USP 1x salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (solução mãe).
4. Coloque um hemocitômetro com 10 ml de solução de estoque, aguarde 5-10 min para os parasitas de se contentar em seguida, contar o número de parasitas nos quatro cantos e centro de praças da quadrado do meio grande.
5. Diluir Parásites para tamanho do inóculo apropriado de 100K / 200 mL 1x PBS, em seguida, injetar camundongos por via intraperitoneal (ip) com um volume total de 200 mL.
   NOTA: Para este procedimento, os ratos foram inoculados com 100K Tipo III (CEP) ¹³ taquizoítos em 200 mL 1x PBS. Ao infectar ratinhos com outras linhagens de Toxoplasma, a concentração do inoculo pode necessitar de ser ajustado para ter em conta nível de virulência.

2. Perfusão e colheita Cérebro

NOTA: Este protocolo foi realizado aos 21 dias pós infecção (dpi), pois isso representa o ponto de tempo em que os números de cistos de pico são encontradas no cérebro de rato, mas outros pontos de tempo pode ser utilizado. Tamanho, número, localização e presença ou ausência de cistos depende de muitos fatores, incluindo a estirpe do mouse, tipo cepa do parasita, bem como tamanho do inóculo ^{7,14 - 17.} Os investigadores deverão determinar individualmente o inóculo apropriado para o mouse e Toxoplasma estirpe ele / ela usa.

1. Configuração todas as ferramentas de coleta cirúrgica (Figura 1).
2. Para cada rato, preparar e manter em gelo: seringa de 20 ml cheia com 0,9% de cloreto de sódio (NaCl) + 10 U / ml Heparina em 1x grau USP estéril PBS (Heparina / Saline); Seringa de 20 ml cheia com 4% de paraformaldeído (PFA); Frasco de cintilação com 15 ml de 4% de PFA. Para vários mouses, prepare um copo cheio com o valor total de cada solução necessária para todos os ratos, em seguida, elaborar uma seringa fresco cheio de solução para cada perfusão.
3. Anestesiar o ratinho ip com 200 ul / 25 g de peso corporal de ketamina / xilazina cocktail (24 mg / ml e 4,8 mg / ml, respectivamente) no dia de interesse. Monitorar o mouse para o nível de anestesia, verificando toe pitada reflexo. Continue com o protocolo apenas uma vez o mouse mostra nenhuma resposta a uma pitada dedo do pé firme.
   NOTA: Outros métodos de anestesia pode ser usado, desde que o nível adequado de anestesia for atingido antesprosseguir com o protocolo.
4. Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre a plataforma de espuma coberta. Pin todos os quatro membros para fora aos pés, em seguida, pulverizar o tórax e abdome, com 70% de etanol (EtOH) (Figura 2A). A adição de várias toalhas de papel estéreis sob o rato pode ser utilizado para ajudar a absorver o excesso de fluidos de perfusão.
5. Levante a pele logo abaixo do esterno com uma pinça, em seguida, usar a tesoura para fazer uma incisão. Puxe a pele de volta para expor o tórax (Figura 2B).
6. Elevador processo xifóide e fazer uma incisão abdominal logo abaixo do diafragma, expor o fígado, que está francamente dissecada para longe do diafragma. Adicione duas incisões, uma do lado esquerdo e uma do lado direito através do diafragma e a parte inferior das costelas. Estender as incisões direita e esquerda a cerca de 1 / 2-2 / 3 forma-se a caixa torácica, o qual é então reflectida para trás para abrir a cavidade torácica (Figura 2C).
   NOTA: Tenha cuidado para não cortar quaisquer órgãos ou vasos sanguíneos principais dutocar esse procedimento pois isso irá comprometer a qualidade da perfusão.
7. Perfundir transcardíaca com 10-20 ml de heparina / solução salina seguido por 10-20 ml PFA a 4%.
   NOTA: Se a perfusão for feito corretamente, o fígado vai mudar de vermelho para bronzear (Figura 2D). Se não for feito corretamente, os vasos sanguíneos será visível (Figura 2E).
8. Vire o mouse sobre seu abdômen, pés re-pin em seguida, pulverizar cabeça e pescoço com etanol 70%. Elevador de pele a partir da base do pescoço e fazer uma incisão. Remova a pele para expor o crânio (Figura 2F). Decapitar cabeça ao nível dos ombros. Remover o crânio, remover suavemente o cérebro, e colocá-lo dentro de um frasco de cintilação preenchido com PFA a 4% (Figura 2G-H).
   NOTA: Se bem perfundidos, o cérebro vai aparecer branco, sem vasos sanguíneos visíveis (Figura 2?). Se o cérebro não está bem perfundido, vasos sanguíneos será visível (Figura 2J).
9. Coloque a centelhação frasco com cérebro em PFA a 4% a 4 ° C durante a noite, coberto de luz. Lavar o cérebro em USP não grau 1x PBS e transferir para um frasco de cintilação de novo preenchido com refrigeradas 1x PBS. Armazenar o cérebro em 1x PBS a 4 ° C, cobertas de luz.
   NOTA: clearing de sucesso e de imagem foi realizado com seções armazenados em 1x PBS por até um mês, mas o melhor é a seção do cérebro dentro de alguns dias como o armazenamento prolongado em PBS irá inverter a fixação PFA e poderia levar a menos do que as imagens mais favoráveis . A autofluorescência e aumentou borrão foram observados em algumas secções fotografadas após armazenamento em 1x PBS, durante um mês ou mais.

3. Cérebro Seccionamento

1. Remover o cérebro de 1x PBS e colocá-lo numa matriz cerebral (Figura 3A) para permitir mais preciso e uniforme corta através do cérebro. Aparar o cerebelo e olfativos lâmpadas, se presente, e depois cortar o cérebro coronally em 2 ou 3 seções.
   NOTA: aparar e de corte do cérebro pode ser feita sem o auxílio de uma matriz cerebral. Número de secções cortadas coronalmente dependerá da distância do corte do Vibratome sendo usado. O cérebro pode ser seccionado em qualquer orientação, embora secções coronais e sagitais são mais comumente utilizado para a identificação neuroanatômico.
2. Cole cada seção do cérebro em um bloco de montagem espécime com cianoacrilato. Apor um pequeno bloco de gel de agarose a 5% por trás da secção de cérebro de apoio (Figura 3B).
   Nota: Os outros mecanismos de apoio podem ser utilizados, mas sem apoio, o Vibratome pode empurrar o cérebro causando corte irregular.
3. Corte o tecido em 160 mm (distância de trabalho do objectivo usado para imagens) de espessura com a Vibratome definido para uma velocidade de 4 e amplitude de 9.
   NOTA: As definições para velocidade e amplitude pode ser ajustada dependendo da máquina específica a ser utilizada, a fim de obter mesmo, as secções lisas. Se as configurações estiveremnão estiver correto, o resultado pode ser seções irregulares, esgarçamento do tecido ou vibração marcas.
4. Recolha cortes de tecido em um frasco de cintilação preenchido com frescas, refrigeradas 1x PBS se eles estão indo para ser apagada dentro de uma semana. Se seções não vão ser apuradas dentro de uma semana, as seções lugar em 1,5 ml microtubos cheios de solução de criopreservação e armazenamento a -20 ° C.

4. Compensação óptico de tecido cerebral Secções

NOTA: Este protocolo foi modificado de um método previamente publicado ^8.

1. Preparar 25%, 50%, 75% e 90% vol / vol de glicerol em 1x PBS + 2% de Tween-20 (Gl / PBST).
2. Remover secções de 1x PBS ou, se em crioconservante, enxaguar em 1x PBS e transferir para um frasco de cintilação contendo 10 ml de 25% Gl / PBST. Coloque o frasco num agitador a 4 ° C, cobertas pela exposição à luz, durante 12 h.
3. Confirme se todas as seções ter afundado ao bottom do frasco. Aspirar a 25% Gl / PBST, deixando apenas o suficiente para cobrir as seções, em seguida, encher o frasco com 10 ml 50% Gl / PBST e coloque em um shaker a 4 ° C, coberto de exposição à luz, durante 12 horas. Repita esse processo para os 75% Gl / PBST então a 90% Gl / PBST. Deixar seções no 90% Gl / PBST, durante 24 horas para chegar a compensação máxima. Ao longo do processo de limpeza, observar compensação óptica progressiva (Figura 4).
   NOTA: Este processo pode ser acelerado se as soluções forem alterados imediatamente após secções ter afundado até o fundo do frasco. Em 75% e 90% de soluções, secções não irá afundar todo o caminho para o fundo do frasco, mas irá flutuar no meio.

5. Montagem tecido cerebral Secções

1. Corte um No. 1.5 lamela em 5 peças para criar um espaçador. Use um lápis régua e com ponta de diamante para marcar e quebrar a lamela ao longo das linhas tracejadas mostrado na Figura 5A. Descartar tele o centro peça, organizar as 4 peças exteriores sobre uma lâmina de vidro simples para criar uma janela, e em seguida, escove claro unha polonês sobre as costuras para aderir as peças do espaçador para o slide na configuração correta (Figura 5B).
   NOTA: O espaçador será utilizado para criar o espaço necessário entre a lâmina e a lamela de montagem para as secções compensados. A lamela pode ser cortada em diferentes formas de criar qualquer janela tamanho necessário. Espaçadores de espuma pré-cortadas estão também disponíveis comercialmente. Para permitir que unha polonês para secar completamente, o melhor é fazer slides com espaçadores de pelo menos um dia antes de seções de montagem.
2. Seções de transferência para um slide usando uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada. Certifique-se de preencher arredores com 90% de Gl / PBST. Cuidadosamente abaixe uma lamela sobre as seções tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas. O excesso de Gl / PBST pode ser mau para longe com um livre de fiapos wipe.
3. GFP Imagem ⁺ neurônios que contêm RFP ⁺ Cistos Toxoplasma gondii com um microscópio confocal imediatamente (Figura 7A-B), em seguida, armazenar lâminas planas e coberto de luz, a 4 ° C.
   NOTA: Como alternativa, selo desliza completamente em torno de todas as bordas para armazenar e fotografada em um momento posterior. Uso de unha polonês claro para selar slide é opcional e pode torná-lo mais difícil de remover lamela se fosse para remover seções do slide em uma data posterior para posterior processamento.

6. Criação de Imagens

Nota: Qualquer microscópio pode ser usado que tem a capacidade de obtenção de alta resolução z-stacks.

1. Depois de inicialmente encontrar o plano focal em 10X, mudar para um objetivo 20X e digitalizar através da seção para identificar um cisto localizado dentro de um GFP ⁺ celular. Centralize a região de interesse (ROI) no campo de visão.
2. Mude para uma objetiva de 40X. Concentre cima e para baixo ao longo de todo o ROI para certificar-se que a célula inteira e cyr são visíveis.
   Nota: As imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal com um Oil DIC M27 objetiva de 40X / 1.30.
3. Usando o software de imagem instalado, obter uma pilha de z, que inclui toda a célula com cisto. Média de configurações utilizadas para obter imagens são mostradas na Figura 6.
   NOTA: As definições podem ter de ser ajustada dependendo de cada cortes de tecido investigadores e capacidades de microscópio.
4. Obter uma imagem máxima projeção do z-stack, definindo o número de projeções para 1. Obtenha uma visão de rotação completa, definindo o número de projeções para 64.
   NOTA: Outros pacotes de software estão disponíveis e podem ser usadas para obter máxima projecção, de rotação, bem como outros pontos de vista de imagens z da pilha.
5. Analisar a imagem com software de análise de imagem.

Resultados

A Figura 7 inclui imagens representativas de dois neurónios GFP ⁺ 160 a partir de dois mm de espessura diferentes, bem como uma medida representativa da distância de cisto-a-célula no corpo para a Figura 7B. Figuras contendo cisto 7 A e B mostram que esta nova protocolo permite a visualização do neurónio infectada na sua totalidade. A Figura 7C mostra que com esta técnica de imagiologia, é agora possível para quantif...

Discussão

Tendo em conta que as alterações celulares em células hospedeiras infectadas têm sido associados a resultados da doença em infecções com outros organismos intracelulares, tais como HIV, raiva, e Chlamydia ^18,19, desenvolvemos uma técnica que nos permite estudar as interações íntimas que ocorrem entre o CNS célula hospedeira e Toxoplasma. O método descrito aqui realiza este objetivo, permitindo imaging eficiente de neurônios cronicamente infectadas. Antes do desenvolvimento deste método...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible