Rato Pneumonectomia modelo de crescimento compensatório pulmonar

Resumo

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Resumo

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Introdução

A principal função do pulmão é o de proporcionar para o oxigénio e dióxido de carbono troca entre um organismo e a atmosfera. Nos seres humanos, uma série de condições congênitas e adquiridas levar à redução da área de superfície do pulmão o que resulta em redução da função pulmonar. Apesar de uma série de terapias, como corticóides inalatórios, broncodilatadores, oxigênio suplementar e ventilação mecânica crônica são usados ​​para atenuar as consequências da redução da função pulmonar ^1-3, a terapia ideal para essas condições seria promover o crescimento do tecido pulmonar funcional - ou seja, pulmão regeneração.

Regeneração de tecidos de mamíferos tem sido bem documentada. O espinhoso Rato Africano pode regenerar grandes áreas da pele, sem a formação de cicatrizes ^4. A falange distal em seres humanos podem se regenerar após uma lesão ou amputação ^5-7. Seguindo pneumonectomy (PNX), o crescimento compensatório pulmonar ocorre em camundongos ^{8, 9} ratos, fazergs ^10, e os humanos ^11. Por definição, o crescimento compensatório pulmonar envolve não apenas a expansão dos espaços aéreos existentes, mas re-septation desses espaços aéreos ampliada com a expansão da microcirculação associada ^12. Análise da expressão gênica tem demonstrado que este modelo recapitula muitos dos eventos de sinalização de desenvolvimento pulmonar ^13. Quatro semanas após rato PNX, área superficial alveolar é equivalente ao de animais operados simulados ^14. Neste artigo, são apresentadas a PNX mouse e procedimentos PNX sham.

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Protocolo

Declaração uso Animal:: NOTA Todos os procedimentos deste estudo foram realizados com a aprovação e seguir as orientações da Institutional Uso de Animais e do Comitê Care (IACUC) no Hospital Infantil de Cincinnati. Oito semanas de idade C57BL / 6J machos foram obtidos a partir de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) e deixados a aclimatar durante uma semana antes da utilização. Até a cirurgia, os animais foram alojados em uma instalação de barreira livre de patógenos e desde ração autoclavada e filtrada libdium ad água. Cada gaiola do rato foi fornecido com um ar dedicado e água, e quartos foram mantidos em um ciclo de dia-noite de 12 h. Após a recuperação da cirurgia, os ratos foram mantidos em gaiolas com tops filtrados, desde autoclavado libidum anúncio de comida, e desde que a água filtrada a partir de uma garrafa de água.

1. Preparação de Instrumentos

1. Faça 6 afastadores pele usando clipes de papel e pinos. Torção endireitou clipes de papel nas hastes de papel pinos, lbeiral de um fio de aço resistente cinco centímetros em uma extremidade e fazer uma única 0,5 centímetro "L" em forma de gancho na extremidade do fio.
2. Faça cerca de 15 x 15 centímetros campos cirúrgicos quadrados usando filme plástico. Prepare um molho por mouse. Coloque uma torre de papel entre cada envoltório.
3. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, juntamente com uma pilha de telhas de 12 x 12 polegadas de cortiça, gazes, e cotonetes.

2. Preparação do rato

1. Induzir a anestesia com isoflurano a 2%. Pesar animal.
2. Em uma área dedicada preparação cirúrgica raspar tórax esquerdo e pescoço com barbeador elétrico.
3. Aplicar uma gota de lágrima artificial do unguento para os olhos do rato.
4. Descontaminar pescoço e tórax esquerdo com clorexidina e álcool isopropílico. Repita mais duas vezes.

Intubation 3. Rato Oro-traqueal e ventilação mecânica

1. Ter um lugar não-estéril técnico cirúrgico o supino do mouse na área cirúrgica pré-aquecido.
2. Confirme profundidade da anestesia, documentando a falta de uma resposta a pata pitada.
3. Depois de lavar as mãos e vestindo traje cirúrgico, máscara e chapéu, don luvas cirúrgicas estéreis.
4. Depois de drapeados e utilizando uma técnica asséptica, fazer uma incisão vertical um centímetro sobre o mid-neck anterior para expor a laringe. Levemente retrair os músculos da cinta com curvas, serrilhadas 10 centímetros forceps e expor a laringe e traquéia, espalhando os músculos da cinta com a ponta de uma tesoura reta.
5. Oralmente inserir um 22 G de ponta romba angiocateter em meados da década de traquéia (Figura 1A) e visualmente confirmar a colocação (Figura 1B). Manter a anestesia e ventilar usando 1-3% de isoflurano através roedor ventilador (225 mL por acidente vascular cerebral; 200 AVC por min). Empregar um limite de pressão de 15 cm H ₂ O.

4. Rato Pneumonectomia

1. Coloque o mouse em decúbito lateral direito, com frente para as costas do ratoo operador (lateral-se à esquerda). Usar um filme plástico auto-selante como um campo estéril. Corte através da cortina, usar tesoura curva sem corte para fazer um 2 cm de comprimento corte paralelo às costelas no ^4º e ^5º espaço intercostal. Insira a ponta curvada tesoura sem corte e dissecar a pele longe das costelas subjacentes e músculos intercostais.
2. Retirar a pele com quatro afastadores para expor um quadrado de 1,5 x 1,5 centímetros janela cirúrgica (Figura 2A). Prenda os retratores à placa de cortiça.
3. Dissecar até costelas usando uma pinça curva, e usar uma ponta da pinça curvas para entrar na cavidade torácica.
4. Usando as micro-tesoura com ponta romba, utilizar a lâmina inferior para entrar na cavidade torácica. Faça um 0,5 centímetros incisão entre as costelas e repita na direção oposta.
5. Usando os dois afastadores restantes, abrir o tórax no eixo ântero-posterior e o seguro dos retratores para a placa de cortiça (Figura 2B).
6. Usando pinças curvas de ponta romba na mão esquerda, o pulmão esquerdo agarrar e deslocar a parte superior do pulmão esquerdo lateralmente e inferiormente através da toracotomia até a artéria pulmonar esquerda e brônquios são exposto (Figura 3A, B).
7. Segurando o titânio microclipe vascular aplicador carregado na mão direita com o corpo do aplicador na palma e ponta curvada apontando para fora a partir da palma (Figura 3C), deslize a ponta do aplicador para o tórax ao longo da curvatura da face posterior da esquerda pulmão e prender o brônquio esquerdo e artéria pulmonar (Figura 3D).
8. Retire o aplicador, mas manter o pulmão esquerdo retraído. Segure as contundentes micro-tesoura de ponta com a mão direita e cortar o brônquio e distal da artéria pulmonar ao clipe e remover pulmão esquerdo (Figura 3E).
9. Retire os afastadores de costela.
10. Use a pinça sem corte curvas para beliscar até 1 cm de pele inferior ao incisiem, mas acima do nível do diafragma e inserir um angiocateter de 24 L através da pele e para dentro da cavidade torácica esquerda (Figura 4A, B).
11. Use 5-0 prolene sutura para colocar dois pontos separados em torno da ^4ª e 5 ^ª costelas para fechar a cavidade torácica.
12. Remover os afastadores de pele. Usar dois conjuntos de pinças para aproximar a pele ao longo do comprimento da incisão e cola a pele fechada.
13. Conecte-se a 3 ml seringa luer-lock ao angiocateter e remover o ar residual através da aplicação de sucção suave e retirada do angiocateter.
14. Cole a incisão no pescoço fechada com dois conjuntos de fórceps, como antes.

5. Rato Sham Pneumonectomia

1. Exponha o pulmão esquerdo como observado no protocolo "Rato Pneumonectomia". Levantar a caixa torácica com uma pinça sem corte curvas para permitir que o ar na cavidade torácica esquerda (Figura 5A, B).
2. Coloque um G angiocateter 24 para o tho esquerdaRacic cavidade como acima tomando cuidado para não ferir o pulmão esquerdo.
3. Usando 5-0 prolene sutura e tomando cuidado para não perfurar o pulmão (Figura 5C), coloque dois pedaços de material de sutura na ^3ª / ^4ª e ^5ª / 6 interspaces ^th costela (Figura 5D). Coloque os dois pedaços de material de sutura antes de amarrar para diminuir os riscos de hérnia de pulmão esquerdo. Amarre o material de sutura para fazer dois pontos separados (Figura 5E).
4. Cole a pele sobre a incisão torácica, remover o ar residual com o angiocateter e cole a incisão no pescoço, como acima.

6. Resuscitation, Analgesia, e Recovery

1. Desligue o isoflurano, e administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina e 0,5 ml de solução salina normal subcutaneamente.
2. Quando respirações espontâneas retomar, remova o tubo endotraqueal.
3. Observe rato até que seja novamente ambulatorial. Andando normalmente resumes vários minutos após a remoção do tubo endotraqueal.
4. Posicione o mouse em um 27 ° C incubadora (umidificado, 25% de oxigênio) para recuperar O / N.
   NOTA: Nós colocamos vários pellets de ração umedecida com água no chão da gaiola para as primeiras 24 horas após a cirurgia.
5. Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via intraperitoneal duas vezes por dia durante três dias após a cirurgia. Tome cuidado para não abrir o local da cirurgia ao manusear animais.

7. Rato Monitoring

1. Pesar camundongos em 1, 3, 5, e 7 dias após a cirurgia.

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Resultados

. Um lote de PNX e operação simulada rato pesos é fornecido na Figura 6 Em nossas mãos, a sobrevivência é constantemente 95-100% para ambos PNX e sham pneumonectomy. ¹⁴ Para obter descrições de como o pulmão direito re-cresce neste modelo e o curso do tempo esperado, nos referimos ao leitor manuscritos de Gibney ¹⁵ et al. E Wang et al.

Várias armadilhas comuns devem ser evitados para realizar com êxito os procedimentos sham ...

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Discussão

Nós fornecemos a descrição mais detalhada dos procedimentos PNX PNX rato e rato sham reportados à data. Fizemos o leitor ciente de várias das armadilhas comuns que os investigadores de aprendizagem do procedimento comumente encontrar, e nós descrevemos várias técnicas desenvolvidas por nosso laboratório para mitigar contra essas armadilhas. Outros laboratórios que utilizam este modelo pode ter desenvolvido outras modificações na técnica ou utilizar diferentes instrumentos. Ao avaliar as diferenças de técn...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 inch Vascular clip applicator	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon small titanium red clip	Teleflex Medical (WECK)	1201
Narrow pattern 12 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Curved serrated 10 cm Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
Castroviejo needle holder	Fine Science Tools	12565-14
Straight 9 cm Strabismus scissors (blunt tip)	Fine Science Tools	14075-09
Straight 8.5 cm hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Straight, blunt tip Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-12
Skin glue	Gluture	32046
22 G Angiocatheter
24 G Angiocatheter
3 ml Luer lock syringe
4 Short retractors
2 Long retractors
5-0 Prolene on curved cutting needle	Ethicon	8698G
0.5 ml Syringe on 27 G needle
Normal saline
Buprenorphine
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 inch Cork board stack	Office Depot
70% Ethanol
Betadine
Mouse ventilator	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Type 845
Isoflurane vaporizer	OHMEDA	Excel 210 SE
Artificial tear ointment	Puralube	NDC: 17033-211-38