Dissecção e montagem de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupais Discos Eye

Resumo

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Resumo

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia¹. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar². Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells³. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase^4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Introdução

Os campos de biologia do desenvolvimento e celular têm sido grandemente impactada pelo organismo modelo: Drosophila melanogaster. Dentro desse modelo, os estudos sobre o disco olho têm contribuído uma grande quantidade de conhecimento a respeito de sinalização, biologia celular e outras áreas. O terceiro disco instar larval olho ultimamente tem sido estudado extensivamente e é um modelo poderoso de utilizar, uma vez que dá um instantâneo de uma série de períodos de desenvolvimento, cada um com suas moléculas e processos de sinalização único, como o sulco morfogenético progride através do disco olho ^8. No entanto, existe uma necessidade para expandir ainda mais a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento na fase de pupa de desenvolvimento. Embora tenha havido estudos sobre o disco olho pupal ^07/03, o nosso conhecimento não se aproxima a amplitude do trabalho que tem sido realizado no disco terceiro instar olho. Isto é devido, em parte, à maior dificuldade em dissecar o disco olho pupa. Portanto, uma apresentação dométodo adequado de dissecção poderia expandir a pesquisa nesta área.

Enquanto há estágios no âmbito do desenvolvimento do disco olho pupa que são facilmente dissecados, particularmente em torno do período de meados de pupa, outros períodos de tempo são muito mais desafiador para dissecar. Este protocolo representa um método para dissecar discos de pupa de olho que pode ser universalmente utilizados para todos os prazos de desenvolvimento de pupa. Este protocolo pode ser utilizado como uma alternativa para um outro protocolo ⁹ que mostra um método mais fácil e mais rápido para dissecar discos oculares a partir dos pontos de tempo midpupal. Este protocolo foi originalmente filmado e desenvolvido para a formação de estudantes de graduação avançados na UCLA Research Consortium Graduação em Genômica Funcional (URCFG) ^10,11 na técnica de dissecção olho pupa. Muitos estudantes de graduação foram capazes de utilizar este vídeo e método para aprender esta técnica desafiadora.

Protocolo

Este procedimento é um procedimento de dois dias.

Dia 1 (2 horas + tempo dissecando)

1. Pupal Disco Eye Dissection

1. Selecione uma pupa para dissecção.
   NOTA: A idade da pupa a ser dissecado será determinado pelas necessidades experimentais. No entanto, se examinar a morfologia das células, isto é frequentemente realizado a 42 horas após a formação pupário (APF) a 25 ° C, que é a idade do pupas mostrado no vídeo. Colete pupas branco (considerado APF 0 hr) com um pincel molhado e organizá-los em ordem cronológica (com base no tempo de coleta) em um novo frasco alimentos mosca mantida a 25 ° C. Dissecar as pupas idade nesta mesma ordem cronológica para manter as diferenças de tempo entre pupas o mais próximo possível.
2. Transferir a pupa em uma gota de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4, ver materiais para receita) em uma placa de dissecação de silicone.
3. Segurar o início do processo de pupa com uma pinça e perfuram e abrir o lower porção do processo de pupa com um par de pinças cortantes. Remover a pupa do caso no furo recentemente formado.
4. Faça um corte diagonal com uma tesoura, meados de tórax, na pupa. Retirar os detritos ou transferir a cabeça pupa para uma nova gota de PBS. Limpe com o tubo ventilador pipeta (ver materiais e Figura 1 para detalhes) e adicione PBS adicional conforme necessário. Certifique-se de evitar a desidratação.
5. Aperto firmemente a parte superior da cabeça cutícula pupal com um par de fórceps. Usando a ponta do tubo de sopro, empurre o caso de pupa para extrudir o cérebro e outros tecidos, incluindo os discos oculares, para fora do processo de pupas. Certifique-se de evitar pegar qualquer tecido dentro da cutícula.
6. Usando o tubo de sopro preenchido com PBS, sopre suavemente o tecido de gordura corporal e outros detritos fora do caso cabeça para separar e identificar claramente os discos do cérebro e dos olhos.
   NOTA: Manter o cérebro ligado ao caso cabeça pupa vai permitir ao pesquisador a usar o que elecaso anúncio como uma "alavanca" para a manipulação futuro do tecido sem danificar os discos de olho ou cérebro. No entanto, é comum para desalojar os discos do cérebro e do olho a partir da cabeça e caso este não é prejudicial para o processo global e os resultados. É muitas vezes leva várias tentativas de sopro e empurrando para extrair com sucesso os discos do olho e cérebro a partir de dentro da caixa da cabeça de pupas e de modo a que eles estão claramente separados do tecido circundante. O mais limpo e mais uma separada pode obter os discos de olho a partir do tecido circundante irá ajudar a evitar tecido estranho de fixação para os discos de olho.
7. Após a dissecção, imediatamente transferir o tecido para a 3 bem prato de vidro no gelo com 0,5 ml de solução de correcção (ver materiais). Flutuador do tecido sobre a superfície da solução de correcção para a poucos minutos (tipicamente o tempo que leva para dissecar o próximo conjunto de discos oculares).
   NOTA: Se este não é o primeiro disco de olho a ser dissecada nesta rodada de dissecação, completely submergir o disco anterior do olho para a solução Fix. Se a execução de procedimentos de coloração especiais (por exemplo, espécies reativas de oxigênio, lisossomos, etc.) isso deve ser feito antes da fixação. A fim de fazer isso, armazenar os discos oculares dissecados em PBS gelado antes de continuar com o protocolo de coloração apropriada.
8. Após dissecção e submersão de todos os discos do olho sendo dissecado, mova a 3 bem prato de vidro para um roqueiro e rock em temperatura ambiente por 30 min.

2. Immunostaining

1. Remova cuidadosamente a solução Fix e adicionar 0,5 ml de PBS com 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBT, ver materiais) e lavar o tecido em uma cadeira de balanço para 10 min. Repetir esta etapa mais três vezes, para um total de quatro lavagens (10 minutos cada).
   NOTA: a remoção cuidadosa da solução do poço pode ser realizada sob um microscópio de dissecação para evitar danos ou perda de tecido. A solução pode ser aspirado cuidadosamente com uma pipeta; preferimos uma multa-tipped, pipeta de transferência descartável que tem tido a abertura achatada para reduzir a possibilidade de aspirar tecido.
2. No final da quarta lavagem, remover a lavagem e adicionar 0,5 ml de solução de bloqueio (ver materiais) para o poço e incubar durante 30 min.
   NOTA: Este prazo pode ser estendido de acordo com suas necessidades.
3. No final do tempo de bloqueio 30 min, pipeta 10 ul de solução de anticorpo primário (diluído em solução de Bloco) para um número adequado de poços de uma placa de micropoços.
   NOTA: Um poço de uma placa de micropoços irá acomodar cerca de 4 pares de discos oculares associadas ao caso de pupa ou 8 pares isolados de cérebros com discos oculares anexas. Os anticorpos primários utilizados no presente protocolo para os dados são representativos de anti-fosfotirosina (diluição 1: 500) e anti-Cut (diluição 1: 200).
4. Transferir o tecido dissecados para os poços de placas de micropoços cheias com a solução de anticorpo primário a partir do 3 bem prato de vidro.
5. Lugara microplaca numa toalha de papel humedecido (para evitar a desidratação) em uma caixa vazia pipeta de ponta (ou outro recipiente similar) e armazenar a 4 ° C durante a noite.

Dia 2 (+ 4 h de tempo de montagem)

6. Transferir o tecido a partir da placa de micropoços para uma nova 3 bem prato de vidro com 0,3% de PBT (≈0.5 ml) e lava-se o tecido durante 10 minutos no agitador. Repetir esta etapa mais três vezes, para um total de quatro lavagens (10 minutos cada)
7. Remover a última lavagem e adicionar 0,5 ml de solução de Bloco para o poço. Bloquear por 30 min.
   NOTA: Este prazo pode ser estendido de acordo com suas necessidades.
8. Remover a solução de bloqueio e adicionar 0,5 ml da solução de anticorpo secundário (feita a partir de anticorpos marcados com fluorescência adequados para o seu anticorpo primário e do comprimento de onda fluorescente, diluída em solução de Bloco) para o poço e proteger o prato 3 bem vidro da luz com uma cobertura ou de alumínio despistar e incubar durante pelo menos 2 horas a salatemperatura.
   NOTA: Todas as etapas subseqüentes devem ser igualmente protegidas da exposição à luz. Esta incubação pode ser estendido a noite a 4 ° C, em uma configuração semelhante à incubação do anticorpo primário, mas também pode ser realizada em um prato de vidro de 3 bem coberto com filme de laboratório, ou uma placa de micropoços se a conservação de anticorpo for desejado.
9. No final da incubação do anticorpo, remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 0,5 ml de 0,3% para o PBT e lava-se bem no agitador durante 10 min. Repetir esta etapa para um total de quatro lavagens (10 minutos cada).
   NOTA: Se a coloração DAPI é desejado, antes de iniciar a primeira lavagem, adicionar 0,5 ml de solução de estoque de DAPI (ver materiais) aos 500 ul de PBT que serão usados ​​para a primeira lavagem (1: 1000 de diluição).

3. Montagem

1. No final da última lavagem, montar os discos de antenas / olho sobre uma lâmina, usando 70% de glicerol ou PBS como um meio para remover a lgain e outros tecidos não desejados em uma associação de um lado da lâmina.
2. Mova cuidadosamente o tecido utilizando pressão hidrostática entre a pinça, ou muito suavemente com a ponta de uma pinça, e alinhar os discos de olho em uma coluna em direção ao centro da lâmina.
3. Remova todo o glicerol externa ou PBS de todo o tecido (o uso da ação de drenagem de um laboratório wipe ou a pinça trabalhar para isso).
4. Colocar uma pequena quantidade (≈10 uL) de meio de montagem ao longo de um lado da coluna disco olho e colocar uma lamela sobre o tecido, de modo a espalhar o meio de montagem para os discos oculares.
5. Deixe corrediça sente durante 1 a 2 minutos para permitir que o tecido / meio de montagem para espalhar-se completamente.
6. Limpe qualquer meio de montagem extra fora em torno das bordas da lamínula e selá-lo com unhas polonês claro.
7. Capturar imagens fluorescentes dos discos olho usando microscopia confocal.

Resultados

Como um exemplo da utilização deste protocolo, que ilustra os resultados midpupal (42 horas APF a 25 ° C) discos oculares imunocoradas com anticorpos diferentes são apresentadas na Figura 2. Ao utilizar um anticorpo dirigido contra os resíduos fosfotirosina, a membrana das células podem ser observado (Figura 2A). Isto pode ser usado para identificar o arranjo regular de células ommatidial no olho de pupa seguindo os processos de padronização finais que ocorrem antes da fase de midpupal. Uma out...

Discussão

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs¹², which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers¹³ so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)			80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100	Promega	H5142	Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT			1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves.
Fix Solution			(≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serum	Rockland antibodies & assays	B304	Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution			10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solution	Life Technologies	D3571	For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting Medium	Vector Labs	H-1000	Mounting medium
Glycerol	Sigma	G5516	For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixer	VWR	82007-202	Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Krayden	NC9897184	Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dish			Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dish	Corning	7220-85	The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitray	Nunc	438733
Sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade	Ted Pella	1346
100 mm Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine Tip	Samco Scientific	231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00001