Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

Resumo

O isolamento de neurônios de dopamina individuais ou a área tegmental ventral com imunohistoquímica direta ou indireta é demonstrada usando captura a laser microdissection. São discutidos os parâmetros para o isolamento de tecido a partir de uma lâmina de vidro usando um laser de infravermelhos e a partir de lâminas de membrana usando a combinação de um laser infravermelho e ultravioleta.

Resumo

Captura laser microdissecação (LCM) é usado para isolar uma população de células individuais concentrado ou regiões anatómicas específicas de tecido a partir de secções de tecido sobre uma lâmina de microscópio. Quando combinada com imuno-histoquímica, GCV pode ser usado para isolar células individuais com base em tipos de marcador de proteína específico. Aqui, a técnica de LCM é descrito para a recolha de uma população específica de neurónios dopaminérgicos directamente marcados com tirosina hidroxilase e imuno-histoquímica para o isolamento de neurónios contendo dopamina na região da área tegmental ventral usando imuno-histoquímica indirecta tirosina-hidroxilase numa secção adjacente aos utilizados para LCM. Uma infravermelho (IR) de laser de captura é utilizada tanto para dissecar neurónios individuais, bem como a área tegmental ventral fora sobre lâminas de vidro e uma tampa de LCM para análise. Desidratação completa do tecido com 100% de etanol e xileno é crítica. A combinação do laser de captura de IR e a luz ultravioleta (UV) Cutting laser é usado para isolar os neurônios de dopamina individuais ou a área tegmental ventral quando usar caneta desliza membrana. Um slide membrana PEN tem vantagens significativas sobre uma lâmina de vidro, uma vez que oferece uma maior consistência na captura e recolha de células, é mais rápido recolher grandes quantidades de tecido, é menos dependente de desidratação e resulta na remoção completa do tecido a partir do slide. Embora a remoção de grandes áreas de tecido a partir de uma lâmina de vidro é viável, é consideravelmente mais demorado e muitas vezes deixa um pouco de tecido residual trás. Os dados apresentados aqui demonstram que o RNA de quantidade e qualidade suficiente pode ser obtido usando estes procedimentos para medições quantitativas de PCR. Apesar de RNA e DNA são as moléculas mais comumente isoladas de tecidos e células coletadas com LCM, isolamento e medição de microRNA, proteína e alterações epigenéticas do DNA também podem se beneficiar da resolução anatômica e celular reforçada obtidos utilizando LCM.

Introdução

Todo o tecido é constituído por uma população de células heterozigótica. Isto é particularmente relevante para o tecido cerebral, que consiste em vários neurônios morfológica e / ou neuroquimicamente distintas cercados por vários tipos de células gliais (oligodendrócitos, microglia e astrócitos). Além disso, regiões distintas do cérebro, tais como áreas do córtex ou do tronco cerebral núcleos, têm funções específicas. Portanto, a capacidade para isolar populações de células específicas ou muito pequenas áreas anatómicas distintas, quando combinado com as técnicas de análise (ou seja, Q-PCR, de ARN-microarrays, sequenciação, e proteómica), pode acentuadamente melhorar a compreensão de diversos processos biológicos. LCM é uma tecnologia que fornece a capacidade de isolar áreas anatômicas muito discretos ou células específicas do tecido sobre uma lâmina de microscópio fornecendo uma fonte muito mais homogêneo para uma análise mais aprofundada de várias moléculas, tais como RNA, microRNA, DNA e proteínas.

t "> Desde LCM foi introduzido pela primeira vez, várias abordagens diferentes têm sido utilizados para microdissect células a partir de tecido de ^1-3. As primeiras abordagens incluídos fixação directa de tecido sobre uma lâmina utilizando uma (RI) do laser de infravermelhos e uma película termoplástica e um não- utilizando um método de contacto de raios ultravioleta (UV) de corte a laser para retirar uma célula ou tecido e para um tubo de recolha. Subsequentemente, LCM tem sido utilizado com sucesso numa variedade de tecidos e tipos de células e mostraram ser compatíveis com o isolamento de várias moléculas para análise a jusante incluindo ARN, microRNA, ADN, e proteínas, incluindo a actividade enzimática ^1,4-7. Aqui LCM é demonstrada usando o sistema de LCM um que usa um laser de UV de corte e um laser de captura de IR para o corte em torno de células ou tecidos e ligá-la a um LCM tampa, respectivamente. Este sistema utiliza LCM tanto a captura de laser IV para derreter uma película de plástico sobre uma tampa sobre a célula ou tecido de interesse que atribui as células para a película de plástico e remove-lo a partir de ttecido que com a remoção da tampa (Figura 1). Além disso, em combinação com o laser de IV, um laser de UV está disponível para cut-out tecido ou células de interesse a partir de tecido montadas em lâminas com uma membrana, em seguida, isolado por meio de fixação do tecido para a tampa LCM utilizando o laser de IV (Figura 2). Uma breve descrição destas técnicas é encontrado nas Figuras 1 e 2.

Diversas variações nesta técnica ou são descritos para isolar células específicas, utilizando imuno fluorescência directa e uma técnica de imuno-histoquímica indirecta guiada por que é utilizado para o isolamento de uma região de tecido com base na expressão de uma proteína específica. Especificamente, o isolamento dos neurónios dopaminérgicos da substância negra e isolamento da área tegmental ventral e o subsequente isolamento de ARN a partir de fresco, tecido de cérebro congeladas são mostrados. Como RNA é o mais lábil de moléculas medidos (em comparação com o DNA ou proteínas), reps para ajudar a preservar a integridade de ARN e são incluídos dados mostrados na quantidade e qualidade do ARN obtido.

Protocolo

NOTA: o tecido cerebral de ratos foi utilizado de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e protocolos de estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Universidade Estadual do Mississippi.

1. Preparação de Slides e Tissue

1. Utilize qualquer lâminas Silano-Prep ou naftalato de polietileno (PEN) lâminas de vidro membrana.
2. Para o isolamento de ARN, lâminas de imersão em solução de descontaminação de RNase, lavar 3 vezes com água livre de RNase, em seguida desidratar com uma série graduada de etanol e secar sob vácuo livre de RNase durante 30 min.
3. Cortar secções de tecido com 10 mm de espessura utilizando um criostato e montar nas RNase lâminas gratuitas preparadas. Mantenha as seções congeladas durante o corte para preservar a qualidade RNA.
   NOTA: Certifique-se de que o tecido é de aproximadamente 4 mm de distância das bordas do slide como o GCV não pode remover o tecido que é muito próximo dos bordos da lâmina. Em order para remover o tecido a partir de uma lâmina de membrana PEN, assegurar que o tecido é de 4 mm a partir da esquerda, superior e inferior e 7 mm a partir do lado direito da lâmina que são as dimensões da membrana que não está ligado à corrediça.
4. Para o isolamento de populações de células individuais usando imunohistoquímica direta, tecido seção para tanto os slides de silano-prep ou uma caneta desliza membrana. Para o isolamento de regiões de tecido usando imunohistoquímica indireta técnicas guiadas, montar um conjunto de secções em um slide Silano-prep para imuno-histoquímica e seções alternadas de cada um slide membrana PEN e / ou uma lâmina de silano-prep a ser utilizado para LCM.

2. Preparação do tecido para Capture Laser - Rapid tirosina-hidroxilase Imuno-histoquímica para Captura Laser direta de células imunorreativas

1. Esboço tecido hidrofóbico com uma caneta e deixa-se secar.
2. Fix tecido em acetona-metanol (1: 1) solução a -20 ° C durante 10 min.
   NOTA: Our experiência tem mostrado que a fixação de acetona-metanol resultou em imuno-histoquímica em muito mais consistente do que a acetona ou metanol.
3. Enxaguar corrediça em tampão fosfato salino (PBS) com 1% de Triton (RNase livre).
4. Cobrir as secções com 100-200 ul de PBS com 1% de Triton com anticorpo tirosina hidroxilase diluído 1: 100 com 400 U / ml de RNasin. Incubar por 5-10 min.
5. Brevemente enxaguado duas vezes em PBS e PBS-1% de Triton.
6. Cobrir o tecido, com 100-200 ul de anticorpo de cabra anti-IgG de coelho marcado com Alexa Fluor 488 diluído a 1: 100 em PBS-1% de Triton com 400 U / ml de RNasin e 50 ng / ml de DAPI. Incubar durante 5 min.
7. Lavar duas vezes em PBS, em seguida desidratar 30 s numa série graduada de etanol livre de RNase (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
8. Incubar em duas lavagens de xileno durante 1 minuto, em seguida 5 min.
9. Retirar as lâminas de xileno imediatamente antes da utilização para GCV e deixar secar ao ar.

3. Preparação do tecido para Capture Laser - tirosinaHidroxilase Imuno-histoquímica para Captura Laser indireta de imunoreactivas Regiões

1. Processo de um slide com as seções adjacentes às seções montadas em Silano-prep e / ou PEN lâminas de membrana para imuno-histoquímica.
   NOTA: Os procedimentos usados ​​aqui são semelhantes aos descritos na literatura ^5. Para as imagens de demonstração, a reacção cromogénio diaminobenzidina (DAB) foi usada para visualizar os neurónios tirosina hidroxilase de interesse.
2. Para lâminas utilizadas para LCM, fixar durante 5 min em 100% de acetona a 4 ° C.
3. Desidratar o tecido numa série graduada de etanol livre de RNase (75% -75% -95% -95% -100% a 100%) durante 1 min cada.
4. Incubar em duas lavagens de xileno durante 1 minuto, em seguida 5 min.
5. Retirar as lâminas de xileno imediatamente antes da utilização para GCV e deixar secar ao ar.

4. Usando o Sistema de Captação Microdissection Laser

NOTA: O programa aplicativo LCM tem 10 barras de ferramentas e 2 janelas para controlar aprocedimento microdissection. Ferramenta Bares: 1. microscópio, 2. Captura Laser, 3. Corte a Laser, 4. Estudo, 5. Navegação, 6. Materiais, 7. Captura de Grupos, 8. Microdissection, 9. Font, 10. anotação. Windows: 1. Vivo Vídeo e 2. Roteiro.

1. Abra a porta, selecionando a guia "Porta Aberta" na barra de ferramentas de Materiais no software do sistema LCM.
2. Carregar slides sobre os três lugares disponíveis. Para esta demonstração, coloque uma lâmina com tirosina hidroxilase imunohistoquímica visualizado com DAB, um slide Silano-prep e um slide membrana PEN cada marcado para o rápido tirosina fluorescente imunohistoquímica hidroxilase. Em um experimento típico, usar seções fixas ou acetona não marcado com um slide de referência marcado para tirosina hidroxilase usando DAB ou slides diretamente marcadas com tirosina hidroxilase fluorescente para captura de laser.
3. Coloque as tampas LCM no slot disponível.
   NOTA: tampas de macro e HS LCM estão disponíveis para uso. O tipo de tampa LCM usar depende sobre o número de células ou quantidade de tecido a ser recolhido. Lâminas de macro são listados para coletar até vários milhares de células, enquanto as tampas SH pode coletar várias centenas. Os slides Macro permitir mais coleta de tecido, mas exigem 50 ul de tampão de lise. O tampão SH, quando utilizada com os adaptadores, requer apenas 10 ul de tampão de lise, que permite uma maior recuperação de ARN proporcional.
4. Feche a porta.
5. Carregue a lâmina para activar a janela mapa de estradas que proporciona uma vista de trabalho de todo o escorrega, este permite a selecção da região de interesse (Figura 3). Veja o Mapa do Caminho na janela de vídeo ao vivo para navegar para a área de interesse.
6. Na barra de ferramentas Materiais, identificar os slides membrana PEN marcando a caixa acima do slot slide. Para suprir propriedades cap, clique direito sobre as tampas na barra de ferramentas materiais e selecione "Propriedades de abastecimento da PAC". Marque as caixas que indicam a posição das tampas e selecione Macro ou SH caps.
7. Selecione a aba "fluorescência" na barra de ferramentas do microscópio para ligar a lâmpada fluorescente e permitir que a lâmpada fluorescente para se aquecer. Use os filtros azuis e UV para visualizar a Alex Fluor 488 e DAPI, respectivamente. Use o "Ajuste Camera" guia para aumentar a sensibilidade da imagem, a fim de ver as células marcadas com fluorescência.
8. Na barra de ferramentas Materiais, clique direito em um boné e movê-lo para o slide de interesse. Clique duas vezes em um local no Roteiro para selecionar a região que aparece na janela de vídeo ao vivo. Mova a cápsula em torno do slide ao selecionar uma área no Mapa Road (clique duas vezes à esquerda) e, em seguida, clique direito e selecionando "Colocar a tampa na região central."
9. Antes de usar o laser captura IR, mirar e ajustá-lo para a força. Coloque a tampa em uma região do slide longe de tecido. Na barra de ferramentas Laser Capture, selecione "Ativar". Ajustar a potência (3-100 mW), pulso (100-1000000 μ; S) e # Batida do laser. Disparar o laser de IV, quando a tampa está sobre uma parte da lâmina, sem tecido e verificar para ver se o laser derrete suficientemente a membrana tampão LCM.
   NOTA: Isso é chamado de molhamento que está derretendo a membrana de polímero sobre a tampa para que ele contacta a lâmina de vidro. Humedecimento suficiente é visível como um anel escuro fundido com o diapositivo com o centro do anel claro (Ver Figura 4 para exemplos de fusão suficiente e insuficiente). Se molhamento não é suficiente, ajustar a potência e pulso, e fogo teste novamente até que isso seja alcançado. Além disso, vários fogos do laser também pode ser utilizado.
10. Quando a intensidade do laser IR é ajustado, clique com botão direito e selecione "Captura de laser é aqui" para apontar o laser.
    Nota: Esta etapa informa ao computador onde o laser captura IR visa o tecido. Este passo de apontar o laser é crítica e precisa ser repetido cada vez que a tampa é movida ou o objectivo é alterada.

Captura 5. Laser Microdissection de Pessoa dopamina Neurônios off de Slides silano-prep

1. Mover para a região de interesse para capturar as células.
   NOTA: O exemplo de isolar os neurônios de dopamina é mostrado aqui.
2. Para capturar células individuais fora de um slide Silano-prep, selecione a guia "LCM", em seguida, no ícone "ponto único" na barra de ferramentas Microdissection.
3. Na barra de ferramentas do microscópio, use a guia "Shutter" para alternar entre fluorescência e campo claro com filtros fluorescentes guias para escolher os filtros adequados e usar as guias objetivos para alterar a ampliação. Uma vez que as células de interesse são visíveis na janela de vídeo ao vivo, ajustar o tamanho da zona usada para marcar as células de interesse para o tamanho aproximado das células. Faça isso clicando na guia Local na barra de ferramentas Laser Captura em seguida, clicando em um dos lados de uma célula corada, e clicando no lado oposto.
   NOTA: Este calcula odiâmetro do local e mostra o valor.
4. Marque as células de interesse, clicando sobre eles enquanto o ícone "ponto único" é selecionado. Fazê-lo para colocar um marcador local em cada célula. Aqui, o filtro azul e a objectiva 10X são utilizados para visualizar os neurónios de dopamina. Reteste e visam a laser IR na tampa onde não há tecido abaixo dela como descrito nos passos 4,9 e 4,10.
5. Uma vez que as células são marcadas, selecione a opção "Go - corte e captura" guia na barra de ferramentas Microdissection eo laser IR vai automaticamente acionar células de todo marcados selecionados. Além disso, se necessário, acionar o laser IR manualmente em qualquer ponto de interesse (Figura 5D).
6. Mova a cápsula de distância da seção e em uma região aberta do slide para verificar se as células foram capturados no tampão LCM. Certifique-se de que as células de interesse são removidos da corrediça (Figura 5B, E) e fixada na tampa LCM (Figura 5C, F). Th de documentosé processo clicando na aba "Capturar imagem" na barra de ferramenta microscópio.
7. Quando terminar a recolha de tecidos, retire a tampa com o botão direito sobre a tampa e selecione "Mover para" depois "Descarregar".

Captura 6. Laser de Pessoa dopamina Neurônios off de PEN Membrane Slides

1. Para capturar células individuais fora do PEN lâminas membrana utilizando ambos os IR e UV lasers, selecione "Cortar e Captura" guia na barra de ferramentas Microdissection. Selecione a aba "ponto único" para marcar as células de interesse. Use o botão "linha de corte" para delinear cada célula. Certifique-se de testar o laser IR como descrito no passo 4.9 e 4.10 e testar o laser UV para determinar a intensidade mínima necessária para cortar pensei que o PEN membrana e tecido (Figura 4 e 5)
2. Selecione a opção "Capture and Cut" guia na barra de ferramentas Microdissection. Ao coletar células individuais usando esta técnica, serCertifique-se de disparar o laser IR primeiro, seguido pelo laser UV como esses pequenos pedaços podem ser perdidos se eles são cortados antes de ser colada no cap LCM.
   NOTA: Este processo também pode ser feito manualmente por disparar o laser de IR em um ponto de interesse e as células individualmente delineado com o laser UV.
3. Depois de recolher as células de interesse, mover a tampa LCM como descrito acima no passo 5.7 para determinar se as células foram removidas e fixada na tampa (Figura 6).
4. Quando terminar a recolha de tecidos, retire a tampa com o botão direito sobre a tampa e selecionando "Mover para" depois "Descarregar".

7. Captura área tegmental ventral de Slides Silano-prep

1. Para identificar a região de interesse, use o slide processados ​​para imuno-histoquímica.
   NOTA: Para esta demonstração a área tegmental ventral é isolado (Figura 7A).
2. Coloque uma tampa LCM e testar os lasers como no passos 4.9 e 4.10.
   NOTA: Tipicamente, uma tampa de LCM macro é utilizado, mas um tampão SH pode também ser utilizado (Ver Figura 8).
3. Para isolar a região de tecido (ou seja, a área tegmental ventral) a partir do slide Silano-prep, selecione a guia "LCM" na barra de ferramentas Microdissection, em seguida, selecione a guia "polígono-exterior". Faça o contorno da região de interesse na janela de vídeo ao vivo. Dependendo do tamanho da área para a coleta, o contorno da região de interesse com pequeno aumento (2X Objetivo). Para a coleta, no entanto, o instrumento usa o objetivo 10X assim ajustar e visam a laser IR no âmbito do objectivo 10X antes da captura.
4. Selecione a opção "Go - captura e corte" guia na barra de ferramentas Microdissection.
   NOTA: O computador irá disparar automaticamente o laser IR ao longo de toda a área selecionada (Figura 7F, I). Se a membrana LCM não foi suficientemente derreteu toda a área, o laser pode ser demitido homemdualmente ou todo o processo repetido.
5. Mova o cap LCM fora do tecido para determinar o quão bem o tecido foi coletada.
   NOTA: Uma passagem utilizando este método normalmente deixa algum tecido para trás no slide (Veja Figure7G). Se isto ocorrer, a selecção e repetir capturar passo acima. A repetição deste passo pode aumentar a quantidade de tecido recolhida (Figura 7J).
6. Quando terminar a recolha de tecidos, descarregar a tampa com o botão direito sobre a tampa e selecionando "Mover para" depois "Descarregar".

8. Captura área tegmental ventral do PEN Membrane Slides

1. Utilizar a corrediça processados ​​para imuno-histoquímica, como um guia para a selecção da região de interesse a partir do tecido na lâmina da membrana PEN como acima.
2. Selecione a opção "Cortar e Captura" guia na barra de ferramentas Microdissection. Selecione a aba "Cortar Line" e delinear a região de interesse usando o immunohistochemistry marcado slide como um guia.
   Nota: O programa irá adicionar automaticamente pontos para o laser IR para prender o tecido para a tampa. Use o botão "ponto único" para adicionar pontos adicionais para proteger melhor o tecido para a tampa.
3. No âmbito do objectivo, fogo teste 10X e visam a laser IR e UV, como descrito em 4.9 e 4.10. Teste que o laser UV pode penetrar a membrana sobre a lâmina, e que esta redução corresponde à localização no ecrã do computador. Utilize uma força de laser de UV que é apenas suficiente para cortar a membrana e o tecido, mas não danifica o tecido (Figura 5).
4. Selecione a opção "Go - captura e corte" guia na barra de ferramentas Microdissection.
   NOTA: O computador irá disparar automaticamente o laser IR em todos os pontos marcados dentro do tecido para anexá-lo para a tampa, em seguida, disparar o laser UV para cortar o slide PEN membrana e tecido (Figura 7C). Pontos derretidos IR adicionais podem ser necessárias para fixar adequadamente o tisprocessar para a tampa LCM, que também pode ser adicionado manualmente.
5. Mover a tampa LCM fora do tecido para determinar se o tecido foi removido da secção (Figura 7C) e fixada na tampa (Figura 7C).
6. Quando terminar a recolha de tecidos, para remover a tampa, clique direito sobre a tampa e selecione "Mover para" depois "Descarregar".

9. Isolamento de ARN

1. Para recolher o ARN a partir das células capturadas ou tecido, incubar a membrana tampão LCM de ARN em tampão de lise durante 30 min a 37 ° C.
   NOTA: Para tampão SH, um adaptador que permite que está disponível para a utilização de apenas 10 ul de tampão de lise na tampa e prende-se um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. As tampas de macro exigir 50 ul de tampão de lise e se liga directamente a um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
2. Após incubação, o tampão de lise girar para baixo para dentro do tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
3. Para garantir uma lise completa de todas as células otecido r, peel off da membrana cap LCM da tampa e colocar no tampão de lise.
4. Para testar a integridade do RNA, RNA uso isolado do restante tecido na lâmina depois LCM para medir a integridade de ARN.
   NOTA: Devido ao ARN amostra limitada obtida com LCM, normalmente não é prático para testar a integridade de ARN no LCM de ARN isolado, no entanto, o ARN a partir do tecido restante proporciona um bom indicador de qualquer degradação de ARN devido à fixação, imuno-histoquímica e de tempo durante o procedimento LCM.

Resultados

A micrografia nas Figuras 6 e 7 demonstram as capacidades de isolamento de neurónios dopaminérgicos individuais. A resolução anatómica corrente é de cerca de 5-10 mm como o menor tamanho de ponto que pode ser produzido de forma consistente no LCM tampões para isolar uma célula. A única limitação para o isolamento de tipos de células específicos é a capacidade de visualizar as células. Embora LCM é capaz de isolar neurónios de dopamina individuais, a contaminação de partes de células não marcadas adjacentes ocorre mais provavelmente. Portanto, a amostra final é uma coleção concentrada de neurônios de dopamina, e não uma população pura de neurônios de dopamina. Esta tecnologia é também capaz de isolar as pequenas áreas de tecido, tais como os núcleos discretos ou regiões no interior do cérebro como mostrado com o isolamento da área tegmental ventral. Publicações anteriores demonstraram este uso no tecido cerebral, bem como para isolar o tecido patológico do tecido normal ^5,11.

Porque o uso mais comum de células e tecidos isolados usando LCM é a análise de ARN, os procedimentos apresentados foram optimizado para preservar a integridade de ARN. A fim de determinar a qualidade do RNA que permaneceu LCM seguinte, o ARN foi isolado, utilizando colunas de giro à base de sílica, a partir de tecido sobre as lâminas seguintes LCM, ou após o procedimento de tirosina hidroxilase rápida fluorescente histoquímica ou fixação em acetona. Qualidade do RNA foi medido e comparado com valores para o ARN de todo disponível comercialmente de ARN de cérebro (Figura 9). Qualidade de ARN foi reduzida nas amostras de ARN de tecido utilizados para LCM com integridade inferior após imuno-histoquímica (RIN não disponível), seguido pela fixação acetona (RIN 2,6) em comparação com o ARN do cérebro inteiro (RIN 8.2) tal como pode ser visto por uma redução relativa na altura do pico do rRNA S28 em comparação com o pico S18. No entanto, o ARN mantido a 18S e 28S, bandas e a expressão do gene pode ser medida utilizando Q-PCR.

Para medir a quantidade de RNA obtido a partir de neurónios adquiridas através de LCM, neurónios de dopamina (50, 100 e 200 neurónios de dopamina) foram isolados a partir da área tegmental ventral fora das lâminas Silano-prep. O RNA foi isolado usando colunas de giro à base de sílica e a quantidade de ARN foi medida. Com base na curva padrão gerada, um total de 17,3, 24,8 e 50,9 pg pg / ul foi isolado a partir de 50, 100 e 200 neurónios de dopamina, respectivamente (Figura 10A). Para medir a quantidade de RNA com Q-PCR, numa gama de concentrações de ARN de cérebro inteiro e ARN dos neurónios de dopamina foram transcritas inversa e o gene β-actina foi medida usando Q-PCR como descrito anteriormente ^5. Com base nestas medições, uma concentração de 3,55, 6,82 e 20,58 pg / ul foi calculada a partir de 50, 100 e 200 neurónios de dopamina, respectivamente (Figura 10B).

Para demonstrar como o isolamento de neurônios de dopamina se compara ao isolamento de toda a várea tegmental entral com LCM, genes específicos de neurónios de dopamina (Nurr1, tirosina hidroxilase, e transportador de dopamina) foram medidos com Q-PCR nestes dois tipos diferentes de amostras e comparado com a expressão de β-actina (Figura 11). Uma vez que os valores de C _T mais baixos são gerados com uma concentração mais elevada do gene de interesse, uma diminuição no ôc _t indica um aumento da expressão dos genes de neurónios de dopamina em relação ao β-actina. Isto demonstra como o isolamento de neurónios dopaminérgicos individuais concentra-se a expressão de genes específicos de neurónios de dopamina. Nas amostras ventral tegmental área, genes específicos de neurónios de dopamina são diluídos como para outras células (neurónios não-dopaminérgicos e células da glia) também serão recolhidos que expressam β-actina, mas não expressam genes de neurónios dopaminérgicos.

Figura 1. captura a laser usando o laser infravermelho (IR) de captura. A pequena tampa LCM plástico tem uma membrana na parte inferior que está colocada na parte superior de tecido montada sobre uma lâmina de vidro (Passo 1). Quando o tecido ou célula de interesse é identificado, um laser de captura RI é disparado através da tampa de LCM para derreter uma ondulação pequena na membrana para o tecido / célula subjacente (Passo 2). Quando a tampa é removida LCM, o tecido é removido da lâmina de microscópio e permanece presa à tampa de LCM.

Figura 2. captura a laser usando o infravermelho (IR) e a captura de laser ultravioleta (UV) de corte a laser. A fim de obter maiores áreas de tecido ou facilitar a recuperação de células utilizando o laser de UV, o tecido está montado sobre uma corrediça com uma membrana ligado para o slide ao longo do canto externo (slides membrana PEN). O tampão é colocado no LCM tele tecido e a captura de laser IV é usado para fundir o tampão membrana e fixar o tecido na tampa LCM (Passo 1 e 2). O laser de UV de corte é então usada para cortar através da membrana corrediça e tecido (Passo 3 e 4), de modo que, quando a tampa é removida do tecido é removido a partir do slide e permanece na tampa LCM (Passo 5).

Figura 3. O Laser Captura Microdissection Sistema Road Map. Esta captura Sistema Microdissection Laser tem espaço para 3 slides de uma vez. Quando as lâminas são carregadas no microscópio, baixa ampliação Roteiro imagens para cada slide são gerados. Selecionando uma área de imagem roteiro sobre move a janela de imagens ao vivo para aquela região. Para fins de demonstração, mesencéfalo rato foi seccionada em seção de 10 mm em 3 lâminas. A primeira lâmina foi marcado para tirosina-hidroxilase immunoreactivity utilizando diaminobenzidina como um cromogénio (A). As secções foram montadas em lâminas tanto Silano-prep (B) ou lâminas de membrana PEN (C). Ambas as lâminas foram marcados utilizando o rápido fluorescente imuno-histoquímica da tirosina hidroxilase. Setas em (C) indicam a fixação da membrana PEN à lâmina de vidro. Nenhum tecido fora dessa fronteira podem ser coletadas com LCM.

Figura 4. Usando o laser de captura RI. A captura de laser IV é usado para fundir o tampão membrana LCM para prender o tecido para a tampa LCM e removê-lo do resto do tecido. O laser de captura RI deve ser pelo força suficiente para fundir a membrana tampão LCM suficientemente para contactar com o tecido e lâmina de vidro subjacente. A imagem em cima demonstra quando o laser era insuficiente para derreter a membranapara o slide (deixou dois pontos). Quando a membrana derretido toca a lâmina de vidro, um contorno preto grosso pode ser observado (spot direita). A intensidade do laser pode ser ajustado mudando a alimentação (3-100 mW), pulso (100-1,000,000 ms) e # Batida do laser. Além disso, repetiu disparo do laser IV no mesmo local também pode derreter ainda mais a membrana. O objectivo do laser IV necessita de ser ajustado a qualquer momento a tampa de LCM é movido ou quando o objectivo for alterado. Barra de escala = 100 pm.

Figura 5. Usando o corte a laser de UV. O corte a laser de UV é usada para cortar através da membrana do PEN e do tecido. Antes de usar a intensidade mínima necessária para cortar a membrana e o tecido tem de ser determinar uma vez que o laser UV pode danificar o tecido. Acima, os três pontos (setas) de diferentes intensidades de laser UV são mostradas com o tamanho do ponto esquerdo suficiente para 10 mm seções, o ponto médio para seções mais espessas e no ponto certo demonstrando a intensidade do laser UV que é muito alta. Scale bar = 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. isolamento directo de neurónios imunorreactivos a tirosina hidroxilase usando o laser de IV. Neurónios de dopamina estão apresentados após uma marcação fluorescente rápido para tirosina hidroxilase (A). Quando o laser é disparado IR derretendo a membrana tampão LCM sobre estes neurónios (D), a remoção da tampa de pega estas células fora da lâmina (B, E). Estes neurónios podem então ser visualizado como fixada na tampa LCM (C, F). Barra de escala = 250 pm.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. isolamento directo de neurónios imunorreactivos a tirosina hidroxilase do PEN lâminas de membrana utilizando os IR e UV lasers. Tirosina hidroxilase neurónios marcados são mostrados acima (A). Esses neurónios podem ser fixada na tampa LCM utilizando o laser de IV e cortado a partir do slide membrana PEN utilizando o laser de UV (B). Scale bar = 250 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Indirecto isolamento da área tegmental ventral usando tirosina immunoreactivity hidroxilase. A localização dos neurônios de dopamina na área tegmental ventral foi visualizado em uma seção utilizando técnicas de imuno-histoquímica padrão (A e E). Esta secção marcada imunohistoquímica foi usado como um modelo para localizar a área tegmental ventral em secções adjacentes não corados (B e F). Utilizando o laser de UV, a área tegmental ventral foi fixada na tampa LCM com o laser de IV e cortados a partir da lâmina com o laser de UV (C e D) e é mostrada ligada a uma tampa HS LCM (D). A região ventral tegmental isolado a partir de silano-prep lâminas utilizando apenas o laser IV também é mostrada ligada a uma tampa de Macro (FK). Note-se que era necessário mais do que uma tentativa de coletar a maior parte do tecido a partir desta região (Compare G e J). Barra de escala = 500 pm.pload / 52336 / "target =" _ 52336fig8large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9. qualidade de ARN. Electroferogramas representativos e as imagens associadas gel de todo disponível comercialmente de ARN de cérebro (A) e o RNA isolado a partir de secções de fixação depois de acetona e LCM (B) ou imuno-histoquímica rápida fluorescente tirosina hidroxilase e LCM (C). Embora a qualidade do ARN foi reduzida nas secções processadas para imuno-histoquímica, em relação ao ARN do cérebro inteiro, os electroferogramas demonstrar ARN praticamente intacta com base na presença dos picos de ARNr S18 e S28. Concentração de RNA do cérebro inteiro foi 6,487 pg / l com um RIN de 8,2. A concentração de RNA acetona tecido fixado foi 5.036 pg / mL com um RIN de 2,6. ARN obtido após imuno-histoquímica h ad uma concentração de 4.474 pg / mL e RIN não estava disponível.

Figura 10. quantidade de ARN. Para determinar a quantidade de ARN em neurónios obtidos com GCV, uma curva padrão de concentrações de RNA foi produzida utilizando uma fluorospectrometer e Q-PCR. Para as medições fluorospectrometer (A), o gráfico mostra a grande gama de valores mais elevados de RNA e o pequeno gráfico mostra a sensibilidade deste ensaio para 10 pg / mL. As concentrações de ARN obtidos a partir de 50, 100 e 200 neurónios de dopamina foi de 17,3, 24,8 e 50,9 pg / mL, respectivamente. Usando Q-PCR para medir quantidades de ARN (B), as concentrações de ARN obtido a partir de 50, 100 e 200 neurónios de dopamina foi 3,55, 6,82 e 20,58 pg / mL, respectivamente.

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Figura 11. Concentração de genes específicos de neurónios de dopamina com o isolamento de neurónios dopaminérgicos individuais. A diferença em C _t (ôc _t) entre os genes específicos de neurónios de dopamina (Nurr1, tirosina hidroxilase, e transportador de dopamina) e β-actina em amostras de neurónios dopaminérgicos na área tegmental ventral isolado com LCM como comparado com a expressão na dissecção de toda a região ventral tegmental são mostrados. Uma vez que os valores de C _T mais baixos são gerados com uma concentração mais elevada do gene de interesse, uma diminuição no ôc _t indica um aumento da expressão dos genes de neurónios de dopamina em relação ao β-actina como outras células (neurónios não-dopaminérgicos e células da glia) vai ser recolhidos nas amostras da área tegmental ventral que expressam β-actina, mas não expressam genes de neurônios de dopamina.

Discussão

LCM é uma técnica poderosa para a dissecção de populações discretas de células ou regiões de tecido a partir de secções de tecido sobre uma lâmina de microscópio e o subsequente isolamento de ARN, microARN, DNA e proteínas. O uso de LCM em combinação com análise usando tecnologias de alta capacidade, tais como microarray, próxima geração de sequenciação de ARN, análise de ADN e epigenética proteómica está a tornar-se mais e mais comum como a sensibilidade destas técnicas e melhora a quantidade de material de partida necessário é reduzido ^8-12. Com LCM, uma resolução melhor anatómica é alcançado para uma amostra, e a compreensão das medidas a jusante destas amostras é grandemente aumentada. Uma advertência com LCM é que ela fornece uma amostra concentrada das células de interesse, mas não necessariamente uma população pura de células. Os limites da precisão significa que haverá alguma contaminação a partir do tecido adjacente. No entanto, esta técnica não concentrar as células de interessepara minimizar os efeitos associados com o tecido circundante e células e maximizar os efeitos experimentais sobre as células de interesse.

Direto contra indireta Imunohistoquímica

Uma vez que GCV é actualmente utilizados principalmente para o isolamento e medição de ARN, ARN de manter intacta é um critério muito importante. Manter a integridade do RNA é a principal razão por trás do uso de imunohistoquímica indireta para orientar dissecção dos tecidos que remove a necessidade de manchar o tecido diretamente o que pode degradar o RNA (Figura 10). Quando a questão experimental, no entanto, requer o isolamento de uma população específica de células, tais como os neurónios de dopamina, imuno fluorescência directa é necessária. Utilizando um protocolo de marcação imuno-histoquímica rápida pode minimizar a degradação de ARN no decurso do processo. Os tempos de incubação curtos são, devido à utilização de concentrações elevadas de anti primário e secundáriocorpos, as concentrações que estão em torno de 10-20 vezes maior do que o que é necessário para imunohistoquímica convencional com a 2 h de incubação. Se, no entanto, são necessários tempos de incubação mais longos, Brown e Smith usado buffers elevados de sal para inibir a degradação do RNA e RNA obter boa qualidade com tempos de incubação longo (até 20 h) ^13. Esta abordagem também pode ser usada se existe tempo substancial necessária entre a rotulagem do tecido e obter acesso a um sistema de LCM.

Escolha de lâminas - membrana PEN, Silano-prep e lâminas de vidro não revestidos

O uso de lâminas de vidro não revestidos para LCM foram relatados ^14. No nosso laboratório, lâminas de silano-prep foram encontrados para ser uma escolha óptima, este revestimento como suficientemente atribui o tecido para a corrediça para imuno-histoquímica, sem perda de tecido, mas ainda permite a ligação do tecido para as tampas de LCM e remoção a partir do slide . Lâminas de vidro não revestidos têmmostrou alguma perda de tecido com o procedimento imuno-histoquímica. Se imunohistoquímica indireta é usada, no entanto, a retenção de tecido torna-se menos de um problema. Com a desidratação adequada, as células que capturam ou tecido fora de lâminas Silano-Prep não foi um problema. Cada uma das várias abordagens para os neurônios de isolamento ou regiões cerebrais descritas neste documento tem vantagens e desvantagens. Para o isolamento dos neurónios dopaminérgicos individuais, a utilização de lâminas de silano-prep tem a vantagem de melhor óptica e é menos dispendioso do que as lâminas de membrana de PEN. A desvantagem é que, por vezes, a captura de células pode ser difícil, se não é a desidratação insuficiente (ver abaixo) e algum tecido pode ser deixada sobre a lâmina. A vantagem de as lâminas de PEN membranas é que o uso da combinação do laser e ultravioleta do laser de IV assegura que os neurónios de dopamina irá ser recolhido. Se você não retirar as células de uma caneta desliza membrana quase nunca ocorre, uma vez que é menos dependente da desidratação do que as lâminas de vidro. Um vantagem adicional é que o laser de UV pode ser usada para aproximar mais estreitamente a forma dos neurónios de interesse, em comparação com um círculo para a captura de neurónios fora de lâminas de vidro com o laser de IV. Para o isolamento de regiões de tecido, as lâminas de membrana PEN são muito superiores e justificar o custo adicional. Esta abordagem resulta em remoção completa de todo o tecido cortado sobre a membrana, é muito mais rápido do que a captura de uma grande área de tecido usando o laser IV sozinho e secções de tecido mais grossos podem ser recolhidos. Usando apenas o laser IR requer que a membrana de tampa de LCM é completamente derretido sobre a área de tecido inteiro. Além disso, a recolha incompleta do tecido é típica e geralmente requer várias tentativas. Embora isto demora mais do que o isolamento de tecido a partir do slide membrana PEN, se o tecido já é disponível numa lâmina de vidro ou um laser UV não está disponível, isto é uma opção viável, a maior parte do tecido pode ser recolhida (Figura 8J).

ove_content "> As etapas críticas

As incubações etanol a 100% são um dos passos mais importantes. A fim de recolher células a partir de lâminas de Silano-prep é necessária a desidratação completa do tecido. Portanto, qualquer água não for removido, o qual está associado principalmente com a incubação de etanol a 100%, irá impactar a capacidade de pegar células a partir das lâminas. A fim de resolver este problema, mudar frequentemente as soluções de etanol 100% como a absorção de água a partir do ar ou transferência de etapas de lavagem anteriores podem afetar a desidratação. Além disso, peneiras moleculares são usados ​​para absorver toda a água contaminação. O sistema LCM deve ser idealmente localizado em uma pequena sala com um desumidificador para manter as condições de baixa umidade.

Bons secções do crióstato são críticos para o LCM adequada. Secções precisa ser plana com pregas no tecido minimizada. Dobras no tecido irão aumentar a distância entre a tampa LCM e evitar que ele entre em contacto com ttecido ele. Em seguida, ele torna-se difícil de fundir suficientemente o tampão membrana sobre o tecido. Para lâminas de vidro, tipicamente espessura de corte deve ter entre 6 e 12 mm. Seções mais espessas podem ser capturadas com os slides de membrana caneta.

LCM oferece uma capacidade técnica para fazer dissecações muito precisas de tecidos e células a partir de lâminas de microscópio. Isso aumenta significativamente a resolução de uma análise mais aprofundada, em comparação com a dissecção macroscópica de peças de tecido. Embora, LCM pode ser tempo e mão de obra intensiva, que não requer treinamento extensivo ou especialização e, quando combinada com outras tecnologias de alta capacidade, pode aumentar consideravelmente a compreensão de um processo biológico quando as células discretas ou regiões anatômicas são usados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System	Life Technologies, Grand Island, NY	Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0211
CapSure HS LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0213
PEN Membrane slides	Life Technologies, Grand Island, NY	s4651
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Molecular Sieve	EDM Millipore, Billerica, MA	MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2939AA
Stratagene MX 3005P	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer	Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen	Life Technologies, Grand Island, NY	R11490
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780