Em Injeções Utero Intra-cardíaco Tomate-lectina em embriões de camundongos para calibre fluxo sangüíneo renal

Resumo

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Resumo

A formação e perfusão de desenvolver vasos sanguíneos renais (além de glomérulos) são muito escassos. Como vasculatura desenvolve através de angiogênese (que é o ramificando-se dos grandes vasos) e vasculogenesis (formação de novo navio), técnicas de mapeamento de perfusão, tais como moldes de resina, in vivo de imagens de ultra-som, e micro-dissecção foram limitadas em demonstrar as relações íntimas entre esses dois processos e desenvolvimento de estruturas renais dentro do embrião. Aqui, descrevemos o procedimento de In Utero intra-cardíacas guiada por ultrassom FITC identificados microinjeções lectina de tomate em embriões de camundongos para avaliar a ontogenia da perfusão renal. Lectina de tomate (TL) foi perfundido todo o embrião e os rins colhida. Os tecidos foram co-coradas para várias estruturas renais, incluindo: progenitores néfrons, as estruturas de néfrons, ureteral epitélio e na vasculatura. A partir de vasos de grande calibre E13.5 foram perfundidos, no entanto periféricavasos permaneceram não perfundidada. Por E15.5 e E17.5, vasos periféricos pequenas, bem como glomérulos começou a se tornar perfusão. Esta técnica experimental é fundamental para o estudo do papel da vasculatura e do fluxo sanguíneo durante o desenvolvimento embrionário.

Introdução

Durante o desenvolvimento embrionário, dois processos vasculares discretos, ainda simultâneas ter lugar: a angiogénese, o processo pelo qual um recipiente cresce a partir de um grande vaso, e vasculogénese pré-existente, que é a formação de novo de vasos de células progenitoras endoteliais residenciais ^1,2. Respectivamente, o primeiro é sinónimo de fluxo sanguíneo, enquanto que o último é pensado para ter lugar em grande parte na ausência da mesma.

Simultaneamente à formação de vasos sanguíneos, um processo cíclico e dinâmico da síntese renal de progenitor de células, proliferação, diferenciação e começa a desdobrar no dia embrionário 9,5 (E9.5). Neste ponto, o broto ureteral (UB) invade dorsal em torno mesenchyme metanephric (MM), e continua até o nascimento ^3. Repetido de ramificação da UB em rápida condensação mesênquima metanéfrico tampa começa a formação das unidades funcionais do rim, do nefrónio. Com cada nova geração de UB e nephron, as gerações mais velhas são deslocadas em regiões corticais e medular interno, onde, em seguida, submetidos a uma maturação e diferenciação dentro de ambientes principalmente vascular-densas. Como evidenciado por Dressler et al. ^3, este processo embrionário é precipitado pela sinalização indutiva, tais como a diafonia entre UB e MM, e uma miríade de factores extracelulares ^3-6. Dois fatores extracelulares recentemente investigado dentro do pâncreas e rins incluem o desenvolvimento de tensão de oxigênio e fluxo sanguíneo ^7,8. Este último irá ser discutido em mais detalhe a seguir com relação ao desenvolvimento do rim.

A fim de expor o papel indutor que o fluxo de sangue potencialmente desempenha no nefrónio diferenciação das células progenitoras, bem como em outros processos organogénese métodos precisos e exactos de embrionário mapeamento do fluxo é imperativo.

Métodos alternativos de aferir o fluxo de sangue incluem a prescrição de ulimagiologia trasound e resina molda ^9,10. Conclusivamente, estes modos demonstraram ser inerentemente falta na sua capacidade para desvendar contemporaneamente justaposições temporais e espaciais entre o fluxo de sangue e a diferenciação das células estaminais. Moldes de resina, por exemplo, fornecer um modelo válido de padronização navio dentro de tecidos adultos, no entanto, em vasos imaturos, como com momentos embrionárias, os navios são grosseiramente subdesenvolvido e gotejante. Portanto, resina lança deixar de manter dentro dos minúsculos, muitas vezes poroso, vasos.

Para esses obstáculos aparentes, entre outros, optou-se por incorporar in vivo intra-cardíacas embrionárias lectina de tomate (TL) microinjeções em nossas investigações do desenvolvimento renal guiada por ultra-som. Neste procedimento, utilizamos uma sonda de ultra-sons para guiar de forma síncrona uma agulha montada micropipeta cheia com 2,5 ml de solução de LT no ventrículo esquerdo de embriões de ratinho nos pontos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 e tempo. E170,5 é a última idade de desenvolvimento como as agulhas não são fortes o suficiente para penetrar o embrião mais desenvolvido.

As vantagens deste método de microinjecção são abundantes. Microinjeção guiada por ultra-som permite um posicionamento preciso de uma agulha de injeção dentro do ventrículo esquerdo embrionário, expulsão passiva e controlada de solução para o coração pulsante do animal, o mínimo de danos ao coração e tecidos circundantes, e evitar a insuficiência cardíaca súbita e morte do embrião antes da perfusão de corpo inteiro. Com o uso de uma LT com FITC, qualquer vasculatura perfundido irá manter o marcador ao longo da sua membrana apical endotelial. Em combinação com imuno-histoquímica, utilizando PECAM (CD31, plaquetas molécula de adesão das células endoteliais) e vários outros marcadores vasculares, somos capazes de distinguir claramente entre vasos perfundidos e un-perfusão, bem como caracterizar qualquer coloração anormal de tecidos circundantes.

Protocolo

NOTA: The University of Pittsburgh Institutional Animal Care e do Comitê Use aprovado todos os experimentos.

1. Preparação de Instrumentos Ultrasound-microinjeção e embriões

1. Configure palco, montagem, e sonda (Figura 1), bem como os instrumentos cirúrgicos (Figura 2). Local solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) em um banho de 37 ° C de aquecimento. Encha agulha de microinjecção inteiramente com óleo mineral, usando seringa de 1 ml ligada a uma segunda agulha G 25 flexível, através da sua base.
2. Corrigir agulha na rotação do braço de montagem, ea agulha vazia de solução de óleo mineral. Re-encher com 2,5 ml de solução de TL. Certifique-se que não há bolhas de ar no interior da agulha de injeção. Gire agulha braço em direção à parede, longe do palco.
3. Anestesiar a mãe grávida na câmara de anestesia através de infusão contínua de isoflurano. Quando a mãe fica inconsciente, transferir a anestesia para tubo nariz posicionado no caudal lado do palco, e lugar mãe em decúbito dorsal com o focinho no tubo nariz para permitir a continuação de um estado totalmente anestesiado.
4. Membros fita em ângulos de 45 °, ou com as mãos e os pés descansados ​​e posicionado overtop ECG / monitor de temperatura guias. É importante que a barragem grávida é continuamente monitorizado para assegurar que a anestesia é suficiente e que a pomada aplicada no para os olhos para reduzir a secura.
5. Aplique o produto de remoção de pêlos em toda a parte inferior do abdômen da mãe, limpe suavemente com cotonetes secos, e, em seguida, novamente com um 70% de cotonetes saturado de etanol para remover qualquer excesso de produto e cabelo. Certifique-se de limpar a pele abdominal off de todos os pêlos no local da incisão (Figura 3).
6. Realize uma laparotomia na mãe grávida usando uma pinça e tesouras cirúrgicas finas. Tome cuidado para evitar o corte quaisquer vasos grandes ou órgãos viscerais. Faça primeiro, incisão reta de epiderme 1,5-2 cm acima vagina e continuar em direção a cortar costelas para approximatEly 2-3 cm. Expor a membrana subcutânea, localizar a linha alba ("linha branca") (Figura 3), e cortadas paralelamente à incisão inicial, ao longo do comprimento do mesmo, para expor interna órgãos viscerais e sáculo uterinas.

2. Extracção de Embriões

1. Utilize aplicadores com ponta de algodão de 6 polegadas de manobrar mãe e embriões. Com cuidado, empurre (sem forçar) na pele com aplicador para manipular primeiro embrião de abertura da incisão. Após a extracção do primeiro sáculo embrião, cuidadosa e lentamente puxe o restante do corno uterino, através e para o exterior da matriz. Evite puxar intestino ou outros órgãos através da incisão nesta fase.
2. Quantificar embriões e coloque delicadamente corno uterino esquerdo de volta para a mãe. Em seguida, começar a colocar o corno uterino direito de volta para a mãe começando com o mais saccule embrião da vagina no chifre e se movendo para baixo. Continue até apenas dois embriões permanecem expostos (Fifigura 4). Por último, os embriões de posição em uma coluna acima e paralelo à incisão linha, sendo consciente para não cortar a circulação uterina.
3. Coloque blocos de argila e posição entre os braços e corpo, bem como pernas e cauda. Certifique-se de que as superfícies de argila são cerca de nível com incisão laparotomia. Molhe a placa de Petri fenestradas com 37 ° C PBS.
4. Segure estendem fórceps com a mão direita e fenestrated placa de Petri com a mão esquerda (fenestration paralelo aos embriões) e trazer fechado forceps ~ 5 cm através fenestration, a partir do topo da placa de Petri. Abertas forceps completamente sem rasgar malha fenestration.
5. Manobra mãos acima de embriões e foco vista sobre as duas sáculos embrião. Sem (ou levemente) tocando sáculos com entrosamento fenestration ou fórceps, deslize-os através de fenda e definir uma placa de Petri sobre abdômen da mãe. Com uma pinça ainda estendida, manipular malha fenestrado para encaixá-lo em ambos os lados e na base de cada embrião (Figura 5 ) e puxe uma pinça de abertura de fenda.
6. Em seguida, coloque borracha azul contendo parede em uma placa de Petri, sem beliscar ou ferir embriões (Figura 6). Certifique-se de blocos de argila estão firmemente equilíbrio placa de Petri, embrião, e da parede contendo borracha. Por fim, preencher placa de Petri com 37 ° C PBS até que os embriões são completamente submerso (Figura 6), enquanto que o controle de vazamentos na malha fenestrado.

3. Injeção Procedimento

1. Lower fase de injeção com a mãe e os embriões para baixo, usando botão de ajuste de nível Z (Figura 1) e, em seguida, gire a agulha de injeção e braço montar e alinhar diretamente com sonda de ultra-som, com agulha ½ cm à esquerda e sob a ponta da sonda (Figura 7) . Empurre a agulha do braço (não agulha) 45 ° de distância da sonda. Tenha cuidado para não bater a ponta da agulha com a sonda de prato ou ultra-som.
2. Levante fase de injeção de volta à altura original, com ultra-som probe diretamente acima embriões Probe deve ser ligeiramente submersa e dentro de 3-4 mm do tecido embrionário. Use X & Y botões de ajuste de fase (Figura 8) para alterar a posição do embrião / mãe / estágio para localizar sistematicamente a embrionário do coração batendo.
3. Diretamente Centro de tela ultra-som observar um marcador alvo centro preto desenhado (*). Localize ventrículo esquerdo (preferível) ou átrio usando os X & Y botões de ajuste de fase (Figura 8) e, em seguida, aumentar ou diminuir o palco, usando o botão giratório no palco para posicionar-alvo injeção precisamente sobre o marcador de centro preto na tela do ultra-som.
4. Use X botão de ajuste de fase para mover embrião para a direita, fora da tela do ultra-som. Reposicionar agulha microinjeção e braço de volta no lugar, ½ cm de distância e 90 ° para a sonda de ultra-som (Figura 7).
5. Usando montar microinjeção botões de ajuste (Figura 9C-G), agulha de posição com a ponta claramente aligned com o marcador de centro. Ajuste o ângulo de injeção (usando botões na Figura 9C e EG), e X, Y, Z e vetores de micro-agulha para garantir a ponta da agulha está focada no plano correto. Retrair agulha microinjeção usando apenas o botão de "injeção" (Figura 9F), cuidado para não ajustar outras dimensões.
6. Mais uma vez, usando apenas o X de ajuste fino movimento botão fase de embrião de volta sob a sonda, com destino exatamente sobre o ponto central na tela do ultra-som. Certifique-se de que o ventrículo esquerdo é agora exactamente no mesmo X, Y, Z e plano.
7. Em seguida, com apenas o botão de "injecção" no micro-injecção de montagem, perfurar lentamente embrião com a agulha de microinjecção e gradualmente trazer ponta para o ventrículo esquerdo. Injectar o total de 2,5 ml de solução TL no ventrículo esquerdo ou até que os vazios sinais sonoros de alerta, ao considerar "vazia" e tocando "encher" uma vez (Figuras 2A e B). Neste momentoinjecção de observar uma sombra que emana a partir da ponta da agulha, a qual é o TL entrar para dentro da câmara cardíaca (Figura 10). Em sentido inverso, retrair rapidamente agulha microinjeção girando o botão de "injeção" (Figura 9F) sobre a microinjeção de montagem quando a injeção é completa.
8. Continue na próxima embrião e repetir este procedimento para embriões remanescentes após esta série de etapas e, finalmente, colocar os embriões finais de volta para o abdômen da barragem. Alterne anestesia para a caixa de câmara e mover suavemente mãe aqui para 15 min de tempo da última injecção.

4. A colheita Embriões e Análise

1. Sacrifique barragem via luxação cervical. Expandir a incisão laparotomia para remover facilmente cornos uterinos da mãe. Mantenha os embriões dentro sac uterina. Coloque embriões em refrigerados PBS.
2. Dissecar embriões de sac uterino (se o tecido coleta necessária para genotipagem) e coloque todo o embrião in 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite, em seguida, em 30% de sacarose durante a noite, congelar no cryostat corte médio. Em seguida, corte o cryosection e colocá-lo em lâminas para análise imuno-histoquímica. Opcionalmente, usar tecidos para todo o monte por desidratação em 100% de metanol, subsequente à fixação, em PFA a 4%.
3. Para a análise imuno-histoquímica colocar os criosecções em PBS para remover o OCT. Em seguida, bloquear as secções com 10% de soro de burro normal, durante 30 min. Em seguida, adicionar PECAM anticorpo primário a diluição 1: 100 durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lavar as lâminas em PBT 3 vezes durante 10 minutos cada e adicionar burro anti-rato secundária 594 e incubar durante 1 h à TA.
   NOTA: Esta é uma técnica altamente exigente que requer a otimização e coordenação de ultra-som e microinjecção. Há uma curva de aprendizado muito íngreme relacionados a essa técnica e requer de quatro a seis semanas de injeções mentor antes de a pessoa se torna proficiente.

Resultados

Formação vascular precede fluxo no desenvolvimento do rim

A maioria do tecido embrionário (incluindo o rim) contem uma vasculatura densa (ambos não perfundidada e perfundidos), mesmo em pontos de tempo iniciais embrionárias. Para melhor calibre e analisar o fluxo de sangue dentro do rim desenvolvimento utilizamos um método de In Utero microinjeções intracardíacos embrionárias. Com o uso de um ultra-som de alta-resolução para identificar o coração embrionário E11.5 E17.5 atrav?...

Discussão

Anestesia Microinjection e prazo

Com relação à anestesia da mãe, que é essencial para manter constante o fluxo de ar (2-3 l / min) e em baixo PSI. O fluxo do sedativo deve ser mantida a cerca de 1,75-2 l / min. Ao mesmo tempo, os prazos em que as injeções ocorrem devem ser cuidadosamente monitorizados e controlados para com cada ninhada. Para cada ninhada a técnica de injecção deve ser mantido sob 45 min. A importância deste limite de tempo é fundamental para a experiência, uma ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10