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Resumo

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Resumo

A detecção precoce é uma chave para o sucesso do tratamento da maioria das doenças, e é especialmente indispensável para o diagnóstico e tratamento de vários tipos de cancro. As técnicas mais comuns utilizados são métodos de imagem, como a ressonância magnética (MRI), Positron Emission Topografia (PET), e Topografia Computadorizada (CT) e são ideais para a compreensão da estrutura física da doença, mas só pode ser realizada uma vez a cada quatro a seis semanas, devido à utilização de agentes de imagiologia e de custo global. Com isto em mente, o desenvolvimento de "point of care" técnicas, como biossensores, que avaliam o estágio da doença e / ou a eficácia do tratamento no consultório do médico e fazê-lo em tempo hábil, iria revolucionar os protocolos de tratamento. 1 Como um meio para explorar biossensores ferroceno base para a detecção de moléculas biologicamente relevantes 2, foram desenvolvidos métodos para produzir conjugados de bio-ferroceno-biotina aqui descritos. Este relatório vai se concentrar em um sistema-biotina-ferrocene cisteína que pode ser imobilizada em uma superfície de ouro.

Introdução

Biossensores são pequenos dispositivos que utilizam a tecnologia de reconhecimento biomolecular como a plataforma para análise seletiva e são utilizados para a sua especificidade, velocidade e baixo custo. Os biossensores eletroquímicos para a detecção de biomoléculas estão na vanguarda deste campo, devido à sua simplicidade, custo-benefício, e alta sensibilidade. 1,3 A anatomia geral destes sensores é um eletrodo equipado com uma molécula de reconhecimento específico para o marcador biológico de interesse . A ligação do marcador por molécula de reconhecimento resulta de uma alteração local do potencial ou da corrente que pode ser detectada por uma simples medição. Até à data, a porção reconhecimento pode variar de enzimas, anticorpos, 4-8 9-12 células inteiras, 13-16, 17-20 receptores peptídeos 21-23 e 24 e de DNA em grande parte com foco em moléculas maiores, biológicos. 25-28 Research esforços nessa arena têm se concentrado principalmente na imunossensores where uma imunoglobulina é imobilizada com um núcleo activo redox (tais como ferroceno) e utilizados para detectar um anticorpo de interesse. Estes estudos foram excluídos aplicações clínicas devido à baixa precisão e tempo de consumo decorrentes das complicações decorrentes do uso de antígeno / anticorpos. 1,3 crescente atenção centrou-se na detecção de moléculas pequenas (menos de 1 kg / mol) de biomédica , alimentos e interesse ambiental, além de segurança nacional. 29 Os exemplos mais conhecidos de dispositivos biossensores são monitores de glicose de auto-teste, que têm tela impressa eletrodos enzimáticos acoplados a um metro amperometric bolso. Estes sistemas utilizam tipicamente um método coulométrico onde a quantidade total de carga gerada pela reacção de oxidação da glicose é medida ao longo de um período de tempo. Dispositivos mobiliários deve ser portátil, robusto e de mão de fazer uso fácil para a população em geral.

Tag Redox como ferrocene são necessry para proporcionar a detecção eletroquímica de biomarcadores ou pequenas moléculas em solução como a maioria dos biomarcadores não são intrinsecamente eletroquimicamente ativa. 30-38 Ferroceno é uma molécula organometallic que é um padrão-ouro para eletroquímica, o que o torna uma excelente opção para a integração em biossensores eletroquímicos. Espécies ativas redox à base Ferroceno já acumulou considerável atenção devido ao seu pequeno tamanho, boa estabilidade, acesso sintético conveniente, modificação química fácil, lipofilicidade relativa, e facilidade de ajuste redox. 3,30-42 Pequenas moléculas baseado no núcleo ferrocene tem sido amplamente utilizado como detectores de íons metálicos e pequenas moléculas. 32-38,43 Sistemas dirigidas a espécies maiores, como biomoléculas têm utilizado a ligação de anticorpos grandes ou imunoglobulinas para derivados do ferroceno que foram incorporados em uma superfície eletroquímica. 1,3,39 , 44 Em cada caso, o potencial de corrente e intensity do par redox Fe III / Fe II foi alterado por acoplamento molecular, produzindo, assim, um novo identificador espectroscópica indicando a presença da molécula de analito. Esta mudança surge a partir da sobreposição extensiva que ocorre entre o sistema-pi dos anéis ciclopentadienilo e os de ferro orbitais d. Se o sistema pi é modificado, ou seja, derivado ou reagir, em seguida, a interacção orbital, por sua vez, a mudança. Isto irá afectar o núcleo Fe e pode ser observada como uma mudança no potencial do par Fe III / Fe II. 40,45,46 Estas propriedades tornam um tal sistema atractivo para uso como um agente de quantificação em um imunoensaio electroquímico ou biossensor.

De modo a produzir sistemas de ferroceno contendo capacidades específicas para biossensores é óptima para modificar um anel de Cp com a bio-receptor específico para uma molécula alvo e utilizar o outro anel de Cp como uma amarra molecular para a leitura electroquímica ou electrode (Figura 1). Síntese destes derivados do ferroceno assimétricos é desafiado por reações colaterais e a formação de espécies diméricas e poliméricas formadas sobre intermolecular cross-linking. 47 No entanto, o acoplamento química produzindo uma ligação amida é o caminho mais direto para fornecer derivados simples de ferrocene envolvendo componentes biológicos tais como péptidos e seus metabolitos. Portanto, as técnicas de fase sólida primeiro desenvolvidos na década de 1950 por Merrifield de síntese de péptidos podem ser aplicados a compostos organometálicos contendo ferroceno. Através da utilização da molécula de ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico ortogonalmente substituído, um sistema de ferroceno, que pode incluir uma porção do receptor (biotina), leitura electroquímica (ferroceno), e o componente de imobilização-ligante (cisteína) possui Foram construídas aqui detalhado. A síntese deste bio-conjugado é discutido bem como prova para a imobilização sobre uma superfície de ouro. Este trabalho represenst a primeira apresentação de um sistema composto de biotina, ferroceno e um aminoácido para a imobilização sobre uma superfície de ouro.

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Protocolo

1. Síntese de biotina-Fc-cisteína (1)

  1. Métodos em fase sólida para produzir resina-1 ligado.
    1. Coloque biotina resina carregada (250 mg, 0,145 mmol) para uma seringa de vidro sinterizado e inchar a resina através da elaboração de dimetilformamida (5 mL) e agitando a seringa num agitador de laboratório durante 20 min. Expelir a solução e repetir dimetilformamida inchaço mais uma vez.
    2. Remover o grupo protector Fmoc por adição de 4-6 ml de 20% de piperidina em dimetilformamida para a seringa, seguido por 10-15 min de agitação. Repetir o processo de desprotecção com mais de 4-6 ml de piperidina. Lava-se a resina com uma sequência de 3x dimetilformamida, 3x dimetilformamida: metanol (1: 1), metanol 3x: diclorometano (1: 1), diclorometano 3x, ~ 5 ml cada. Fazer um teste de ninidrina (+) sobre uma pequena amostra (~ 10) dos grânulos para confirmar a desprotecção bem sucedida pela presença de azul após aquecimento.
    3. Misturar uma solução contendo ácido 1'-Fmoc-amino-ferroceno-1-carboxílico(203,3 mg, 0,4350 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (58,8 mg, 0,413 mmol), carbodiimida de diisopropilo (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropil etil amina (0,0757 ml, 0,435 mmol), e uma mistura 4: 1 de diclorometano e dimetilformamida. Desenhe esta dentro da seringa de frita e agitar suavemente num agitador de laboratório durante 6 horas. Em seguida expelir a solução a partir da seringa e lavagem conforme descrito anteriormente.
    4. Realizar o teste da ninidrina (-), tal como descrito acima para confirmar acoplamento. O teste de ninidrina ainda podem ser úteis na confirmação de acoplamento apesar de a cor laranja do cordão de derivados de a fixação da porção contendo ferro.
    5. Em seguida, remover o grupo Fmoc através da adição de 20% de piperidina em dimetilformamida e lavado como descrito acima. O teste de ninidrina (+) deve ser utilizado para confirmar a remoção do Fmoc.
    6. Prepara-se uma solução composta por Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (58,8 mg, 0,4125 mmol), carbodiimida de diisopropilo (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropiletilamina (0,0757 mL, 0,4350 mmol), e uma mistura 4: 1 de diclorometano e dimetilformamida. Adicione este cocktail acoplamento cisteína a seringa frita e agitar suavemente durante 6 horas. Lavar utilizando o protocolo descrito anteriormente.
    7. Confirmar acoplamento utilizando o teste de ninidrina (-), seguida por remoção do componente de Fmoc com 20% de piperidina e lavagem. Verifique se o terminal de acesso gratuito amina usando o teste de ninidrina (+).
  2. A clivagem de um a partir da resina.
    1. Adicione uma solução de TFA (9,45 ml), água (0,25 ml), 1,2-etanoditiol (0,25 ml), e silano de triisopropilo (0,1 ml), adicioná-lo à seringa e agitar suavemente durante 4 h.
    2. Recolher a solução vermelha-castanha resultante num tubo de Eppendorf e evapora-se o TFA lentamente com uma corrente de ar.
    3. Adicionar éter dietílico frio (~ 15 ml) para o tubo de Eppendorf para precipitar 1, que irá formar uma ligeira agitação. Isolar o produto por meio de centrifugação (1 g, 5 min). Then ciclos repetidos de lavagens de éter etílico (~ 60 ml total) e centrífuga para obter 1 como um sólido vermelho / marrom.

2. Caracterização e Análise de 1

  1. Confirmar que a identidade corresponder a conectividade e composição mostrada na Figura 2, usando 1 H (16 varrimentos) e 13 C RMN (512 scans) em metanol deuterado (300 ul) e análise de ESI-MS.
    Espere os seguintes resultados:
    1 H RMN Espectro (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) e espectro de 13 C RMN (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH2), 28,300 (CH2), 35,474 (CH2), 38,698 (CH2), 39,241 (CH2), 39,717 (CH2), 55,340 / 55,538 (Cp-anel), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O).
    ESI-MS (m / z): Encontrado: 639,00 [1 + Na] +, teórico: 639,1 [1 + Na] + e HR-MS (m / z): Encontrado: 617,2049 [1 + H] +, Teórico: 617.1622 [1 + H] +.
  2. Realizar HPLC, análise elementar para confirmar a composição de um isolado.
    Realizar cromatogramas de HPLC utilizando uma coluna de fase reversa C8 com MeOH a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min. Nota: tempos de retenção de HPLC foram: 3,198-4,674 min.

3. Imobilização de 1 sobre uma superfície de ouro

  1. Cut polímero apoiado lâminas de ouro em quadrados de ~ 0,25 em 2.
  2. Encher um copo de 50 ml com uma solução de água Dl de 1 (~ 1 mM).
  3. Adicionar a lâmina de ouro para o copo e cubra com um vidro de relógio. Tudoow da lâmina de vidro a incubar O / N à temperatura ambiente sem agitação.
  4. Remover o slide de ouro a partir da solução e permitir que ela seca ao ar.
  5. Obter imagens de microscopia eletrônica de varredura, utilizando um microscópio eletrônico de varredura (ou equivalente) para observar imobilizada 1.

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Resultados

A forma ligada resina de 1 é mostrada na Figura 2. A ligação covalente do componente ferroceno dá origem a uma coloração laranja para as pérolas de resina que é persistente com lavagem contínua e indicativo de um complexo de ferro contendo imobilizada em oposição a absorção de ferro pela PEG componente da esfera de resina. A forma livre da resina-1 é idêntica em cor para as pérolas de resina. A seguir à remoção do composto a partir da resina-esferas, ...

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Discussão

A síntese de derivados de ferroceno assimétricas é um desafio em solução. Por exemplo, as tentativas para produzir uma solução em resultou em baixos rendimentos do produto desejado (menos de 20%). Do mesmo modo, reacções que utilizam ácido carboxílico 1'-amino-ferroceno (sans Fmoc) e biotina ligada resina resultou em um produto insolúvel consistente com o produto polimerizado relatado por Baristic et al. e produto mínima. 47 Isto é ainda mais complicada pel...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

KG foi apoiada pela concessão P-1760 RA Fundação Welch, TCU Andrews Instituto de Matemática e Ciências da Educação (para KG), TCU pesquisa e criatividade Atividade Grant (a KG) e TCU SERC Grant (a JHS).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Biotin Novatag ResinNovaBiochem8550510001
TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted SyringeFisherNC9299151
piperidineAcrosP/3520/PB05
ninhydrin testSigma-Aldrich60017-1ea
1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acidOmm ScientificSpecial Order
N,N′-DiisopropylcarbodiimideSigma-AldrichD125407-5G
Fmoc-Cys(Trt)-OHNovabiochem8520080025
trifluoroacetic acidSigma-AldrichT5408
1,2-ethanedithiolSigma-Aldrich2930
triisopropyl silaneSigma-Aldrich233781
Eppendorf tubes (20 ml)any source
methanolany sourcedry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
dichloromethaneany sourcedry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
dimethylformamideany sourcedry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage
centrifugeany source

Referências

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