Modelo murino de artéria femoral Injury fio com a implantação de uma droga patch Entrega perivascular

Resumo

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Resumo

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

Introdução

Arterial injury and inflammation caused by angioplasty and stent implantation can induce neointimal hyperplasia that contributes to the thickening of the arterial wall, a process known as restenosis.^1,2 The formation of restenosis is major mode of failure for interventions such as angioplasty and stenting with bare metal stents.³ Due to recent concerns with the inhibition of vascular healing in arteries treated with drug eluting stents, there is also a need to find compounds that can inhibit restenosis while maintaining vascular healing and re-endothelialization.^4-7 In addition, while stents have had success in the coronary vasculature, percutaneous interventions of all types in the peripheral arteries continue to fail at a higher rate due to restenosis.^8-10 Mouse models of surgical interventions allow the use of powerful genetic manipulations that can provide mechanistic insight into the mechanisms underlying the failure of clinical therapies and can provide an initial test bed for compounds to inhibit intimal hyperplasia.

Here, we describe a mouse model of vascular injury that allows the testing of therapeutic compounds to inhibit neointimal hyperplasia and assess whether their effects on re-endothelialization following endothelial denudation. A key challenge in executing vascular injury in mice is the technical skill needed to obtain vascular access and to restore flow to the injured artery following the wire injury. For this reason, simple arterial ligation models have been used to study neointimal hyperplasia in mice that do not require endovascular manipulations but are easier to implement.¹¹ However, this type of surgical model differs substantially from the mechanical and biological aspects of a percutaneous intervention, lacking key aspects including arterial wall stretch, endothelial denudation and luminal blood flow following injury.

We present two methods for obtaining and closing vascular access for wire injury of the femoral artery in mice. The first technique is the conventional method described by several groups previously and uses vascular access through a side branch of the femoral artery.^12-14 This method requires older, larger mice and more surgical skill to implement the endoluminal access through the smaller artery. It also requires the ligation of the muscular branch of the femoral artery following the procedure. The second method we describe uses an arteriotomy in the branch point of the main and side branch and thereby allows for a larger access to the artery for performing wire injury. In this method, the arteriotomy is closed using controlled local cauterization that leaves both branches with blood flow following the procedure. The conventional method is applicable to mice of at least 20 weeks of age while the alternative method can be used in mice of at least 15 weeks of age. In both methods, the wire creates arterial stretch and abrasion leading to injury and endothelial denudation. Following either procedure a perivascular drug delivery patch can be implanted that allows the delivery of compounds to alter the response to injury. The use of the drug delivery patch allows mice to be used as a test bed for new compounds to inhibit restenosis through perivascular therapies.^15,16

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Protocolo

NOTA: Todos os métodos mostrados neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional.

1. Preparação da Tabela cirúrgico

1. Configure a almofada de aquecimento com recirculação de água quente sobre a mesa cirúrgica, sob o microscópio de dissecação. Coloque a placa de base de aço inoxidável para a almofada de aquecimento. Coloque um pano absorvente estéril na placa de base e almofada de aquecimento.
2. Organizar instrumentos cirúrgicos estéreis sobre um pano absorvente estéril adjacente. Reunir duas pinças de ponta fina ângulo, duas pinças anguladas, três pinça hemostática, dois fios retratores, pequenas tesouras cirúrgicas, micro-tesoura, fio uma angioplastia (diâmetro de 0,15 polegadas) e três segmentos de sutura 6.0 seda de 6 polegadas .
3. Dobre a rodada final do fio de angioplastia para coincidir com a curvatura da artéria femoral. Isso tornará mais fácil para avançar o fio durante a cirurgia.

2. Preparação deRato para Cirurgia

1. Anestesiar um rato por inalação contínua de 2,5% de isoflurano. Certifique-se de monitorar o status do animal durante todo o procedimento. Realizar um teste pitada do pé do mouse para confirmar que ele está totalmente anestesiado. Certifique-se de que o animal não se mover quando o teste do beliscão é administrada.
2. Aplique uma pomada lubrificante para os olhos do animal para evitar a dessecação. Fixe o animal em decúbito dorsal para a almofada absorvente usando fita cirúrgica. Continue a administração de 2,5% de isoflurano via nariz cone.
3. Usar um creme depilatório, retire a pele da perna e do abdômen para a mid-line. Lavar a pele com água. Depilação pode ser realizada um dia antes da cirurgia. Note-se que o tratamento com o creme excessiva pode levar a irritação da pele.
4. Imediatamente antes da cirurgia, aplica povidona-iodo na área depilada com um aplicador de ponta de algodão para esterilizar a pele. Lavar a pele depilada com etanol 70% e secocom um cotonete estéril. Repita 3 vezes.
5. Administrar uma dose pré-operatória de 5 mg / kg de carprofeno, por injecção subcutânea.

3. Isolamento da Artéria Femoral

1. Com uma tesoura pequena cirurgia, fazer uma incisão curva na pele sobre a artéria femoral. Sem rodeios dissecar e proteger os tecidos circundantes com afastadores fixadores retrator magnética para localizar a artéria femoral. Umedeça os tecidos periodicamente, utilizando solução salina para irrigação Aplicar soro fisiológico usando um aplicador de algodão estéril.
2. Isolar a artéria femoral com a pinça. Separe cuidadosamente o nervo do feixe vascular usando uma pinça de ponta fina. Evite punção da veia, e não danificar o nervo. Empurre o nervo longe do pacote para evitar estimulá-lo.
3. Suavemente separar a veia femoral a partir da artéria femoral, localizando a bifurcação femoral. A região da bifurcação é especialmente difícil para dissecar.
4. Posterior à bifurcação, um laço de sutura de seda 6.0 sob a artéria femoral e seguro com uma pinça hemostática. Esta sutura proximal será utilizada para restringir o fluxo de sangue na artéria.
   NOTA: Há uma ligeira variação nos laços ao executar o método de ligação em relação ao método de cauterização (veja a Figura 1 e Figura 2).
5. Distalmente à bifurcação, malha 6,0 sutura de seda por baixo da artéria femoral e seguro com uma pinça hemostática. Este distais auxiliares de sutura no posicionamento da artéria.
6. Loop duas suturas sob o ramo muscular da artéria femoral, pré-amarrá-los e prenda com uma pinça hemostática. Lembre-se de umedecer os tecidos com solução salina. Se a realização do método cautério de lesão fio, apenas uma sutura em loop é necessário no ramo muscular.

4. Desempenho da artéria femoral Injury Fio

1. Restringir o fluxo de sangue na artéria femoral, puxando o fio de sutura proximal. Ligeiramente puxar o Hemost distala pinça hemostática e garantir a filial para expor o local para a arteriotomy. Ligadura do ramo muscular amarrando a sutura em torno dele.
   NOTA: Levantar a artéria para cima vai mais eficaz restringir o fluxo de sangue do que puxar horizontalmente sozinho.
2. Sever do pequeno ramo com cautério entre as duas suturas. Usando micro-tesoura, realizar uma arteriotomy no ramo lateral da bifurcação. Use uma pinça balanceada com um rolo de fita cirúrgica para estabilizar os micro-tesoura.
3. Confirmar a presença do arteriotomy usando uma pinça de ponta fina. Levante cuidadosamente a abertura do arteriotomy com a pinça. Introduzir a extremidade arredondada do fio no arteriotomy usando uma pinça. Para facilitar o avanço do arame, adicionar uma ou duas gotas de lidocaína à região, utilizando uma seringa.
4. Quando o fio atinge o fio de sutura proximal, libertar o fio de sutura e ajustá-lo de modo que ele não pode impedir o avanço do fio. Insira o fio até que ela não pode avançar ainda mais. A ponta do the fio deve parar na região do ligamento inguinal.
5. Permitir que o fio de permanecer na artéria femoral para um minuto. Após um minuto, retrair e avançar o fio em um movimento de corte de dez vezes para ferir e desnudar o endotélio da artéria femoral. Para uma lesão de menor gravidade, diminuir o número de vezes que o fio é puxado para dentro e para fora da artéria ou deixar o fio na artéria para apenas 1 min.
6. Recolha o fio lentamente. Quando a rodada final do fio passou a sutura proximal, restringir o fluxo na artéria puxando o fio de sutura proximal. Recolha o fio completamente.

5. ligando o Poder Muscular

1. Aperte a sutura restante no ramo muscular. Isto irá prevenir o sangramento do arteriotomy. Retorno de fluxo para o ramo muscular, e confirme que o sangue não está vazando a partir dele. Corte as extremidades das suturas no ramo muscular.

6. Método Alternativo: Localizada Cauzação da arteriotomia

NOTA: pode ser tomado Uma abordagem alternativa para evitar a ligadura do ramo muscular e permitir o acesso vascular através da artéria femoral principal maior.

1. A partir de 4.1, para restringir o fluxo na artéria femoral em puxando o fio de sutura proximal. Puxar o fio de sutura distal e segurar fio de sutura ligeiramente o ramo muscular para expor o local para a arteriotomia (Figura 1 e Figura 2).
2. Usando micro-tesoura, realizar uma arteriotomy no ponto ramo da artéria femoral eo ramo muscular. Se a incisão é feita na parte lateral da artéria, pode ser mais fácil para cauterizar. Use uma pinça balanceada com um rolo de fita cirúrgica para estabilizar os micro-tesoura.
3. Para testar o sucesso da cauterização, para restaurar o fluxo da artéria femoral, soltando a sutura proximal. Se o sangramento ocorre a partir do arteriotomy, repita o cautério. Se o cautério for bem sucedida, o fluxo de sangue será rearmazenado distal à arteriotomia.
4. Introduzir o fio e executar a lesão fio conforme descrito no capítulo 4.
5. Continuar a restringir o fluxo de sangue na artéria femoral. Aqueça uma cauterização de ponta fina, pelo menos, 6 centímetros de distância do mouse. Como o cautério arrefece, aplicar uma camada fina lado da arteriotomia para fechar a incisão.
6. Para testar o sucesso da cauterização, para restaurar o fluxo da artéria femoral, soltando a sutura proximal. Se o sangramento ocorre a partir do arteriotomy, repita o cautério. Se a cauterização é bem sucedido, o fluxo de sangue vai ser restaurada distal à arteriotomia. Retire o proximal temporária e laços distais.

7. Implantação de perivascular Drogas patch Entrega

1. Criar um remendo perivascular droga pode ser criado como descrito em estudos anteriores ¹¹ ou utilizando métodos semelhantes. Blunt os cantos da região a barreira do patch entrega da droga usando uma tesoura esterilizada
2. Coloque o pat entrega da drogach para a artéria femoral feridos com o lado de libertação de droga voltado para a artéria. Se necessário, utilize uma pinça para melhorar a posição do patch.

8. Wound Encerramento e Recuperação

1. Fechar a ferida com uma sutura interrompida simples consistindo de nós quadrados. Uma sutura descontínua prolonga o fechamento da ferida em caso de o animal tenta remover o fio de sutura.
2. Desligue a anestesia e retirar o animal do set up. Permitir que o animal possa recuperar na almofada de aquecimento.
3. Continue a acompanhar a recuperação do mouse. Verifique o local da incisão a cada dia para garantir que permanece fechado. Para o tratamento de dor pós-cirúrgica, administrar uma injecção subcutânea de 5 mg / kg de carprofeno cada 12 horas após a cirurgia e, em seguida, a cada 12 h durante 2 dias. Se a dor continua para além dos primeiros dois dias, consulte um veterinário para obter instruções sobre mais medicação para dor.

9. Artérias colheita femoral para Histologia

1. Aos 28 dias pós-cirurgia, realizar o dióxido de carbono a eutanásia no mouse.
   NOTA: O caudal adequado de dióxido de carbono deve deslocar 10-30% da câmara por minuto e irá variar dependendo do tamanho da câmara usada. Corte do diafragma e punção cardíaca deve ser realizada como um método secundário de eutanásia.
2. Fixe o mouse na posição em decúbito dorsal com fita cirúrgica. Faça uma incisão sobre a artéria femoral, onde a incisão cirúrgica inicial foi feito.
3. Para tanto a artéria feridos ea artéria ileso da perna contralateral, sem rodeios dissecar e garantir tecidos circundantes com afastadores e fixadores retrator magnéticos para localizar a artéria femoral. Umedeça os tecidos periodicamente, utilizando solução salina para a irrigação. Aplicar soro fisiológico usando um aplicador de algodão estéril. Tome cuidado para não danificar a artéria.
4. Após a artéria femoral foi isolada a partir do local da arteriotomia original para a aorta abdominal, amarrar um segmento de fio de seda perto do local original do arteriotomy. Esta sutura vai ajudar a identificar a extremidade mais distai da artéria femoral e facilitar a manipulação da amostra.
5. Usando a tesoura micro-dissecação para extirpar a artéria femoral. Faça uma incisão distal à sutura. Adicione outro incisão na extremidade oposta da artéria femoral, ao lado da aorta abdominal.
6. Transferir a artéria excisada para uma placa de Petri de vidro contendo solução salina. Dissecção da artéria mais para remover o excesso de tecido conjuntivo ou de gordura. Remova cuidadosamente o sangue do lúmen por lavagem com soro fisiológico.
7. Transfira a artéria de um frasco de formol a 10% tamponado. Armazenar o frasco a 4 ° C com agitação suave durante 48 horas.
8. Transferir a artéria fixada a 70% de etanol, para armazenar até ser processado para histologia.
9. Incorporar a artéria em blocos de parafina e secção dos blocos para a coloração.
10. Execute coloração histoquímica e immunochemical para avaliar a extensão da lesão e da íntima hyperplasia.
    NOTA: Para obter os resultados representativos, usamos Hematoxilina e Eosina para visualizar os núcleos e morfologia geral ou Pentachrome mancha de um Movat visualizar a lamelas elásticas e outros componentes arteriais.

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Resultados

Após lesão fio, hiperplasia neointimal desenvolve ao longo do tempo e normalmente é examinado após 14 a 28 dias. As técnicas descritas neste trabalho levam à geração robusta de hiperplasia da íntima em camundongos como mostra os resultados histológicos na Figura 3. Uma artéria femoral ileso irá demonstrar lamelas elásticas intactas e uma espessura normal e circunferência. Uma artéria femoral ferido irá mostrar hiperplasia da íntima, degradada lamelas elásticas e demonstrar reendoteliza...

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Discussão

We have presented a method for performing vascular injury in mice and delivery therapeutic compounds to the injured region through a perivascular cuff. The ligation method for femoral and carotid arteries has been described in conventional methods papers and characterized extensively^11-14,19-23 and we present an alternative method for achieving the same vascular injury that is less technically demanding procedure that can often be used in younger mice. One of the chief advantages of the using a mouse wire inju...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight spring wire, 0.15” diameter	Cook	G02426
High Temperature cautery	Bovie Medical Corp.	HIT1
High-temperature fine tip for cautery	Bovie Medical Corp.	H101
Micro-scissors	Fine Science Tools	15000-13	For performance of arteriotomy
Angled fine-tipped forceps	Fine Science Tools	11251-35	For blunt dissection of vascular bundle
Angled forceps	Roboz	RS-5069	For clearing tissues
Surgical scissors	Roboz	RS-5840	For cutting skin
Retractor	Fine Science Tools	18200-10
Retractor wire	Fine Science Tools	18200-05	Attached to retractor
Base plate	Fine Science Tools	18200-03	For use with retractor
Magnetic retractor fixator	Fine Science Tools	18200-01
Needle Holder	Roboz	RS-7822
Hemostatic forceps	Biomedical Research Instruments, Inc.	34-1000
Dissecting microscope	Meiji Techno	EMZ-5TR
Microscope light source	Meiji Techno	FT191
Warm water recirculator	Gaymar	TP-500	For maintaining mouse body temperature
Reusable heating pad	Gaymar	TP-R 22G	For maintaining mouse body temperature
Lidocaine	Various
4.0 Vicryl suture with half circle needle	Ethicon	J494G	For post-surgical wound closure
Sterile cotton-tipped applicators	Puritan	25-806-2WC	For application of depilatory cream and absorbing fluids
Depilatory cream	Nair
Isoflurane	Various
Betadine	Various
70% ethanol	Various
6.0 braided silk suture	Teleflex Medical	4-S	For isolation of femoral artery during surgery
0.9% sodium chloride	Various		For irrigating tissues
Gel eye lubricant	Various
Glass Petri dish	Pyrex	3160-60	For femoral artery harvest
10% buffered formalin	Various		For fixation of femoral artery
70% ethanol	Various		For fixation of femoral artery
Bouin's fluid	Electron Microscopy Sciences		For Movat's Pentachrome staining
Alcian blue, 1%	Electron Microscopy Sciences	26385-01	For Movat's Pentachrome staining
Alkaline alcohol	Electron Microscopy Sciences	26385-02	For Movat's Pentachrome staining
Orcein, 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26385-03	For Movat's Pentachrome staining
Hematoxylin alcoholic, 5%	Electron Microscopy Sciences	26385-04	For Movat's Pentachrome staining
Ferric chloride, 10%	Electron Microscopy Sciences	26385-05	For Movat's Pentachrome staining
Lugol's Iodine	Electron Microscopy Sciences	26385-06	For Movat's Pentachrome staining
Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution	Electron Microscopy Sciences	26385-07	For Movat's Pentachrome staining
Acetic acid, 0.5%	Electron Microscopy Sciences	Various	For Movat's Pentachrome staining
Phosphotungstic acid, 5%	Electron Microscopy Sciences	26385-09	For Movat's Pentachrome staining
Alcoholic saffron, 6%	Electron Microscopy Sciences	26385-10	For Movat's Pentachrome staining