Laboratório de Fisiologia Demonstração: Taxa de filtração glomerular em um Rat

Resumo

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Resumo

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

Introdução

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

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Protocolo

Antes de qualquer procedimento animal, o cuidado com os animais e uso comitê institucional (IACUC) deve aprovar o protocolo. Este protocolo foi aprovado pela Michigan State University IACUC.

1. Preparação de pré-laboratório de solução de FITC-inulina

1. Aqueça 20 ml de solução salina a 70 ° C e agita-se lentamente em 100 mg de FITC-inulina (5 mg / ml de FITC-inulina) de inulina é até que todo dissolvido.
2. Solução arrefecer até à TA e adicionar 800 mg de albumina de soro de bovino (40 mg / ml de BSA, em pó liofilizada, essencialmente livre globulina, baixa endotoxina, ≥98% de pureza por electroforese em gel de agarose).
3. Filtra-se a solução de inulina-BSA com papel de filtro (grau 1). Coloque a solução filtrada em uma seringa de 20 ml com um filtro de seringa com ponta (0,2 um) e cobrir com folha de a proteger da luz.

2. Anestesia e Cirurgia

1. Coloque o rato em uma câmara de indução preenchido com 5% de isoflurano para induzir a anestesia. Grave bodpeso y (250-350 g) e colocar o rato numa plataforma cirúrgica aquecido concebido para manter 37 ° C a temperatura do corpo durante todo o experimento. Segurar cuidadosamente o rato para a plataforma com fita de laboratório sobre as patas. Manter a anestesia com 1-2% de isoflurano com classe médica 100% O ₂ a taxa de fluxo de ar de 0,8-1,0 L / min.
2. Inserir um cateter cônico (OD ponta intravascular, 2.7F) na artéria femoral para pressão arterial e monitoramento da freqüência cardíaca, e coleta de sangue.
3. Inserir um cateter (PE-50) na veia femoral para infusão de inulina. Prenda o cateter ao tecido com 5-O trançado de seda de sutura cirúrgica ⁶ circundante.
4. Fixe o cateter arterial a um transdutor de pressão calibre de tensão. Pressão arterial e freqüência cardíaca registro usando o software de aquisição de dados e exibição em uma tela de computador em tempo real. Esta técnica é demonstrado em detalhe em vídeo ^6.
5. Expor a bexiga através de uma incisão suprapúbica. Corte um pequenoorifício na ponta da bexiga e da inserção de uma cânula (PE-190) com uma ponta de calor queimado no interior da bexiga para a recolha de urina. Fixe a cânula para a bexiga com uma sutura em bolsa.

3. urina e coleta de sangue

1. Colocar a seringa de FITC-inulina em uma bomba de seringa com velocidade de fluxo definido de 1 ml / h por 100 g de peso corporal (3 ml / h durante um rato pesando 300 g). Fixe a seringa para o cateter na veia femoral. Iniciar a infusão de inulina e permitir um período de equilíbrio de 1-2 horas. Manter seringa coberto de uma camada para proteger da luz.
2. Determinar se o ritmo de fluxo de urina é estável e adequado para a análise de amostras (20 ul / min) através da recolha de uma amostra de urina de uma pré-pesados ​​para um frasco de recolha período de 10 min. Determinar o volume de urina por gravimetria com uma balança digital. Um volume de urina suficiente durante um período de recolha de 10 min é de 0,2 ml. Continuar a recolher amostras de urina até duas coleções consecutivos indicam uma taxa de fluxo de urina de 20 l / mou mais.
3. Amostras pré-droga
   1. Recolher uma amostra de urina durante um período de 20 min. Recolher uma amostra de sangue (0,5 ml) a partir do cateter arterial, no ponto médio do período de recolha de urina. Tenha o cuidado de limpar completamente o cateter arterial de solução salina antes de coletar uma amostra de sangue em um frasco contendo uma coleção U heparina. Use frascos de coleta com marcações de volume para facilitar a recolha de 0,5 ml de sangue arterial.
   2. Lave o catéter arterial com heparina-solução salina (20 U / mL) para limpar o cateter de sangue (aprox. 0,1 mL). O comprimento do cateter arterial deve ser tão curto quanto possível, para limitar o volume de solução salina de heparina-necessária para descarregar.
      Nota: as amostras de sangue diluído produzir cálculos imprecisos de TFG e excreção fracionada de Na e K.
   3. Aguarde 10 minutos e repita a cobrança de uma segunda urina Pré-drogas e amostra de sangue.
4. Após a coleta de duas amostras de pré-droga, administrar um diurético drug, a furosemida (10 mg / kg), através do cateter arterial. Lave o cateter arterial com solução salina heparinizada para limpar o cateter de drogas. Ter o cuidado de evitar a injecção de ar através do cateter arterial. Anote o tempo da injeção de furosemida.
5. As amostras post-droga: Em cada um dos três pontos de tempo a seguir, recolher uma amostra de urina durante um período de recolha de 10 min, e uma amostra de sangue (0,5 ml) no ponto médio do período de recolha de urina.
   1. Para Sample Post-Drogas 1 - coletar cinco minutos após a furosemida.
   2. Para Post-Drogas Amostra 2 - recolher dez minutos após a furosemida.
   3. Para Sample Post-Drogas 3 - recolher quinze minutos após a furosemida.
6. Depois de todas as amostras foram coletadas, eutanásia do rato em conformidade com os procedimentos institucionais por toracotomia e remoção do coração. Remova ambos os rins. Decapsulate (remover a membrana que envolve) e apagar os rins para remover o excesso de sangue. Pesar os rins.

4. Análise Amostra

1. Meça todos os volumes de amostras de urina por gravimetria com uma balança digital, e pesos recordes.
2. Amostras de sangue total de centrifugação, utilizando uma centrífuga de bancada (1800 x g) para separar o plasma. Transferir as amostras de plasma para pequenos frascos rotulados.
3. Analisar as concentrações de sódio e potássio em amostras de urina e plasma com um analisador de sódio / potássio.
4. Medição de FITC-inulina no plasma e urina
   1. Dilui-se a urina de pré-droga (de 1: 200 a 1: 400), e na urina pós-fármaco (1:10) com tampão HEPES (500 mM, pH 7,4).
   2. Adicionar 40 ul de padrão ou de amostra ul e 60 de tampão HEPES numa placa de 96 cavidades (uma amostra por cavidade) e deixa-se misturar durante 10 min enquanto se coberto com folha de alumínio.
   3. Gerar uma curva padrão para FITC-inulina, relativamente às concentrações de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figura 1). Determinar a fluorescência de FITC-inulina em amostras e padrões usando um leitor de microplacas com excitação e comprimentos de onda de emissão de 485 e 538 nm, respectivamente.
   4. Encaixe os valores fluorescentes para os padrões de uma análise de regressão função logística de 4 paramter. Os parâmetros da função de regressão são usados ​​para calcular a concentração de FITC-inulina em amostras de plasma e de urina (Tabela 1).

5. Pós-laboratório Análise de Resultados: Cálculos

1. Calcular Urina Taxa de Fluxo (UV; ml / min): [volume de urina recolhida (ml)] ÷ [tempo da recolha (min)]
2. Calcular Taxa de Filtração Glomerular (GFR; ml / min): [a concentração de inulina urina (ug / ml) x UV (ml / min)] ÷ [inulina conc plasma. (Ug / ml)]
3. Calcular filtrada Carga de sódio (pmol / min): concentração de sódio no plasma (nmol / ml) x TFG (ml / min)
4. Calcular excreção de sódio Classificação (U _Na V; umol / min): concentração de sódio na urina (pmol / ml) x UV (ml / min)
5. Calcule Fractional excreção de sódio (FE Na;%): [L _Na V (pmol / min)] ÷ [Carga de sódio filtrado (pmol / min)] x 100
6. Calcular carga filtrada potássio (pmol / min): a concentração de potássio no plasma (nmol / ml) x TFG (ml / min)
7. Calcular excreção de potássio Classificação (L _K V; umol / min): concentração de potássio da urina (pmol / ml) x UV (ml / min)
8. Calcule Fractional excreção de potássio (K FE;%): [U _K V (mmol / min)] ÷ [Load potássio filtrado (mmol / min)] x 100

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Resultados

O diurético usado no laboratório demonstração foi furosemida que muito rapidamente inibe a reabsorção de Na e K filtrada pelo rim, resultando em aumento de Na, K, e a excreção de água dentro de minutos após a administração da droga. Por seu mecanismo primário, furosemida deve ter efeitos mínimos sobre a TFG e da carga filtrada de Na e K, mas vai aumentar o fluxo de urina, e fração de excreção de Na e K.

Os resultados representativos da Tabela 3 mostram que,...

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Discussão

Um marcador apropriado para a medição de GFR deve atender quatro critérios: ser livremente filtrada no glomérulo, ser independente para proteínas do plasma, e nem ser absorvido nem secretada no néfron. A inulina é um polímero de frutose, que satisfaz estes critérios. Como resultado, a depuração renal da inulina é considerada o padrão ouro para medir GFR ^7. A técnica demonstrada representa a abordagem tradicional da determinação da eliminação renal de inulina utilizando recolhas de urina cron...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420