Medições de alta precisão de zinco isotópicas Aplicadas à mouse Órgãos

Resumo

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Resumo

Nós apresentamos um procedimento para medir com alta precisão as taxas de isótopos de zinco em órgãos do mouse. O zinco é composto por 5 isótopos estáveis ^​​(64 Zn, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn ^68, Zn e Zn ^70), que são naturalmente fraccionados entre órgãos do mouse. Nós primeiro mostrar como dissolver os diferentes órgãos, a fim de libertar os átomos de Zn; este passo é realizado por uma mistura de HNO ₃ e H ₂ O _2. Em seguida, purificar os átomos de zinco a partir de todos os outros elementos, em particular de interferências isobáricas (por exemplo, NI), por cromatografia de troca aniônica em um diluído HBr / HNO meio _3. Estas duas primeiras etapas são realizadas em um laboratório limpo usando produtos químicos de alta pureza. Finalmente, as proporções de isótopos são medidos utilizando um multi-colector espectrómetro de massa acoplado indutivamente de plasma, em baixa resolução. As amostras são injectados usando uma câmara de pulverização e o fraccionamento isotópica induzida pelo espectrómetro de massa é o corrected, comparando o rácio das amostras para o rácio de um padrão (técnica de escalonamento padrão). Este procedimento típico completo produz uma razão isotópica com uma reprodutibilidade 50 ppm (2 sd).

Introdução

A medição de alta precisão (melhor do que 100 ppm / unidade de massa atômica) de zinco composição dos isótopos estáveis ​​só foi possível por cerca de 15 anos, graças ao desenvolvimento de multi-coletor de código-fonte plasma massa-espectrómetros e desde então tem sido aplicado principalmente em Terra e ciências planetárias. Os aplicativos para a área médica são novos e têm um forte potencial como biomarcadores para doenças que modificam o metabolismo de zinco (por exemplo, a doença de Alzheimer). Este artigo relata um método para medir com alta precisão as proporções de isótopos estáveis ​​naturais de zinco em vários órgãos do mouse. O mesmo seria aplicável a amostras humanas. O método consiste na dissolução dos órgãos, a purificação química de zinco a partir do resto dos átomos, e, em seguida, a análise da proporção isótopo num espectrómetro de massa.

A qualidade de Zn medições isotópicas está dependente da qualidade da purificação química (pureza de Zn, baixo amostra em brancoared para a quantidade de Zn presente na amostra, maior rendimento de produtos químicos do processo) e no controlo da polarização instrumental. O elevado grau de pureza da fracção de Zn final é necessária para remover ambas as interferências isobáricas e não-interferência isobárica que criam um efeito de matriz. Nuclides isobáricas criar interferências diretas (por exemplo, ⁶⁴ Ni). Interferências não-isobáricas gerar o chamado efeito de "matriz" e alterar a precisão analítica das medições, alterando o estado de ionização por comparação com o padrão de zinco puro a que as amostras são comparados com ^um. Um baixo em branco (<10 ng) indica que não existe contaminação das amostras por Zn externo que distorceria a composição isotópica medido. Como isótopos de Zn pode ser fraccionado durante a cromatografia de permuta iónica ^2, o conjunto de todos os átomos de Zn assegura que não ocorre fraccionamento isotópica, o que implica que o processo químico deve ter um rendimento total. Finalmente, a correção do fracionamento isotópico instrumental durante a medição espectrometria de massa é feita através do método de "bracketing padrão".

Portanto, as principais dificuldades para a obtenção de medições precisas está controlando a contaminação externa (ou seja, baixo em branco), produzindo uma purificação química rendimento total que é limpo de quaisquer outros átomos ou moléculas, e corrigir o fracionamento isotópico instrumental na massa espectrômetro. Neste artigo vamos descrever o nosso protocolo analítico para separar Zn dos órgãos do rato, bem como as medidas de espectrometria de massa.

A extração é feita usando uma baixa quantidade de ácidos diluídos (HBr / _HNO3 media) em micro-colunas (0,5 ul e 0,1 ul) de resina de troca aniônica. Tem um rendimento total e as medições tem uma reprodutibilidade externa melhor do que 50 ppm em relação a ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ Zn. Outra vantagem da metanfetaminaOD é que ele é muito rápido. O método é, portanto, muito bem adaptado para ciências médicas, em que é necessário analisar um grande número de amostras em comparação com geosciences, onde estes foram desenvolvidos métodos analíticos.

Protocolo

NOTA: Os procedimentos que envolvem animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) na Université Paris Diderot.

1. Preparação de Materiais

1. Sub-ferver 1 L de destilar os ácidos (HNO _3, HBr) a fim de purificá-los a partir de impureza.
2. Limpe os copos e adaptador de ponta em um quente (~ 100 ° C) HNO ₃ banho de ácido concentrado durante pelo menos dois dias.
3. Lave as pontas de pipeta em um resfriado 3 N HNO ₃ banho por vários dias e enxaguar individualmente três vezes com água deionizada.

Preparação 2. Amostra

1. Anestesiar os ratos por injecção intraperitoneal de cetamina e xilazina. Avaliar anestesia pelo método toe pitada.
2. Recolhe-se o sangue por punção cardíaca, uma na presença de heparina em tubos de 1,5 ml.
3. Separa-se o plasma a partir de células de sangue por centrifugação (10 min, 1500 xg) e transferir o plasma para o polipropileno cfrascos ryogenic usando dicas de polipropileno.
4. Remover o sangue restante a partir de órgãos de corte da veia hepática e injectando DPBS através do coração. Avaliar a morte do mouse por deslocamento cervical.
5. Colher os órgãos com instrumentos de aço inoxidável estéreis, libertá-los de gordura em torno se houver, e snap-congelá-los em frascos de polipropileno criogênicas.

3. Chemical Purificação

1. Em primeiro lugar, dissolve-se as amostras com uma mistura de ~ 1 ml de concentrado (30%) de H ₂ O ₂ e ~ 1 ml de concentrado (~ 15 M) _HNO3. Será que todos estes passos dentro de um exaustor.
   1. Coloque todo o órgão de interesse em uma proveta de 15 ml Teflon. Em seguida, adicione o H ₂ O ₂ / HNO ₃ a ⁵ o copo. Manter o vaso aberto durante alguns minutos, a fim de evitar salpicos, devido à reacção de oxidação da matéria orgânica e a libertação de CO _2.
   2. Finalmente, colocar o copo sobre uma placa quente a about 100 ° C durante um par de horas ou até que a solução é perfeitamente claro.
2. Abrir o recipiente e secar a solução sobre uma placa quente a cerca de 100 ° C.
3. Uma vez que a amostra é seca, adicionar 1 ml de HBr 1,5 N para as amostras; fechar a proveta e deixou-se dissolver numa placa quente a 100 ° C durante um par de horas.
4. Enquanto isso prepare os 500 colunas ul.
   1. Adicionar 500 mL de resina malha AG1X8 200-400 para a coluna e colocá-lo na prateleira coluna com uma taça de lixo abaixo dela. Lavou-se a resina alternando: 5 ml de 18,2 mohms ⋅ cm de água, 5 ml de 0,5 N HNO _3, 5 ml de água, 5 ml de 0,5 N HNO _3, e, em seguida, 5 ml de água. Condiciona-se a resina com 5 ml de HBr 1,5 N.
5. Retirar os copos da chapa quente e colocá-los em um banho de ultra-som para cerca de 30 min, e em seguida, deixar as taças esfriar a temperatura ambiente.
6. Uma vez que o recipiente é arrefecido e a resina é lavada, abrir o recipiente. Coloque o adaptador de ponta para tele seringa, adicione uma ponta de pipeta; Pipete a 1 ml de amostra e carregá-lo sobre a resina (muito lentamente a fim de não agitar a resina).
7. Uma vez todo o líquido passa através da coluna, adicionam-se 5 ml de HBr 1,5 N.
8. Uma vez que os 5 ml de HBr 1,5 N passar através da coluna, substituir o recipiente de lixo, com uma proveta de 15 ml limpo.
9. Adicionar 5 ml de 0,5 N HNO ₃ 2,5 ml de cada vez. Nesta fase, o Zn é eluído a partir da resina.
10. Uma vez 5 ml de HNO ₃ passa através da coluna, retirar o copo e colocá-lo sobre uma placa quente a 100 ° C até seca.
11. Retirar a coluna do suporte da coluna; lixo a resina (usar uma nova resina para cada amostra).
12. Uma vez que a amostra é seca, repetir o protocolo com o mesmo volume de ácidos sobre uma coluna mais pequena (100 ul) e, em seguida, colocá-la numa placa quente até seca. A amostra está agora pronto para espectrometria de massa.

4. espectroscopia de massa de Medição

1. Analisar o compo isotópica Znsição num espectrómetro de massa de plasma indutivamente acoplado-colector multi (MC-ICP-MS).
   1. Com os parâmetros de máquina resumidos na Tabela 1.
2. Posicione os copos de Faraday para coletar a massa (m / z) de ⁶² Ni, ⁶³ Cu, Zn ^{64, 65} Cu, Zn ^{66, 67} Zn e ⁶⁸ Zn.
3. Preparar uma solução contendo 500 ppb Zn em 0,1 M _HNO3 para análise isotópica.
4. Analisar a solução de 500 ppb de Zn usando uma câmara de pulverização combinada com 100 ul / min nebulizador de teflon. Para cada amostra, medir 30 scans (1 bloco de 30 ciclos), em que o tempo de integração de cada digitalização é 8,389 sec.
5. Corrija o fundo subtraindo o zero intensidades sobre-pico a partir de uma solução em branco (o M _HNO3 0,1 solução usada para re-dissolver as amostras).
6. Controlo e à possível interferência isobárica ⁶⁴ Ni correto medindo a intensidade do pico de ⁶² Ni.Suponha que a taxa de ^{62 64} Ni / Ni é ​​natural (0,2548), este valor correto a partir do viés de massa instrumental, e depois remover o Ni ⁶⁴ na massa 64 como:
   ⁶⁴ Zn _reais = ⁶⁴ Zn _medido - ⁶⁴ = ⁶⁴ Ni Zn _medido - ⁽⁶⁴ Ni / ⁶² Ni) _naturais x ⁶² Ni _medido.
7. Corrigir a polarização massa instrumental por escalonamento cada uma das amostras com uma solução de 500 ppb padrão da norma JMC Lyon Zn (ou outro padrão disponíveis, tais como IMMR-3702). Realizar o escalonamento padrão dividindo a relação de ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ Zn de amostra pelo valor médio da relação de ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ Zn de os dois padrões medidos antes e depois da amostra de menos de 1 e multiplicado por 1.000 (ver equação 1). Precisão externo típico no padrão JMC Lyon Zn é de 0,05 permil / amu (2 desvio padrão, 2 sd).

Resultados

Em 1,5 N HBr, as principais espécies de zinco (ZnBr3-) forma complexos muito fortes com a resina de troca aniônica, enquanto a maioria dos outros elementos não interagem com a resina. O zinco é, então, recuperado, alterando a forma diluída de HNO _3, mudando a especiação de Zn para o Zn2 ⁺ que é libertado a partir da resina de ^6,7.

As taxas de isótopos são tipicamente expressos em partes por mil desvios relativos a um padrão:

Discussão

A reprodutibilidade das medidas é avaliada através de análises replicadas das mesmas amostras realizadas durante as diferentes sessões de análise. Por exemplo ^6, que foram replicados da mesma rocha terrestre 7 vezes e obtivemos os resultados reportados na Tabela 2.

Como esperado a partir da teoria de fracionamento isotópico ¹⁰ e tal como medido em qualquer material sistema solar até agora (por exemplo, meteorito ^11-13, plantas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon beakers	Savillex	200-015-12
In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon