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Resumo

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Resumo

A excepcional afinidade, especificidade e selectividade dos anticorpos torná-los vectores extraordinariamente atraentes para radiofármacos PET-alvo tumorais. Devido à sua multi-dia meia vida biológica, os anticorpos devem ser marcados com radionuclídeos emissores de positrões com deterioração física relativamente longas semi-vidas. Tradicionalmente, os isótopos emissores de positrões 124-I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), e 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h) foram utilizados para marcar os anticorpos de imagens de PET. Mais recentemente, no entanto, o campo tem testemunhado um aumento dramático na utilização do emissor de positrões radiometal 89 Zr em agentes de imagem baseados em anticorpos PET. 89 é um radioisótopo de Zr quase ideal para imagiologia por PET com imunoconjugados, uma vez que possui uma metade física -vida (T 1/2 = 78,4 h), que é compatível com a farmacocinética in vivo de anticorpos e emite um relativamente baixo enopósitrons rgy que produz imagens de alta resolução. Além disso, os anticorpos podem ser directamente marcado com 89 Zr utilizando o quelante de desferrioxamina derivado de sideróforos (DFO). Neste protocolo, o antigénio da membrana alvo J591 anticorpo específico da próstata irá ser usado como um sistema modelo para ilustrar (1) a bioconjugação do quelante bifuncional DFO-isotiocianato de um anticorpo, (2) o radioss�tese e purificação de um 89 ZR DFO-mAb radioimunoconjugado, e (3) a imagem in vivo de PET com 89 um de Zr-DFO-mAb radioimunoconjugado em um modelo murino de cancro.

Introdução

Devido à sua notável sensibilidade, afinidade e selectividade, os anticorpos têm sido considerados promissores vectores para a entrega de radioisótopos a células cancerosas. No entanto, a sua aplicação em tomografia por emissão de pósitrons (PET) tem sido dificultada pela falta de um radioisótopo emissor de positrões adequado para a sua rotulagem. 1-3 Uma das considerações mais importantes no projeto de radioimunoconjugados está combinando a decadência física meia- vida do radioisótopo para os farmacocinética in vivo do anticorpo. Mais especificamente, os anticorpos têm muitas vezes, de vários dias biológicos meia-vida relativamente longa e, portanto, devem ser rotulados com radioisótopos com meia-vida física comparáveis. Para aplicações de imagem PET, os anticorpos têm sido tradicionalmente radiolabeled com 64 Cu (t 1/2 = 12,7 horas), 86 Y (t 1/2 = 14,7 horas), ou 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 No entanto, cada um dosesses radioisótopos possui limitações significativas que dificultam a sua adequação para a imagem latente clínica. Enquanto radioimunoconjugados marcados com 86 Y e 64 Cu provaram promissora em investigações pré-clínicas, ambos os isótopos possuem meias-vidas físicas que são demasiado curto para ser eficaz para imagiologia em humanos. 124 I, em contraste, possui uma meia-vida física quase ideal para imagiologia com anticorpos, mas é caro e tem características de degradação que levam à sub-óptimos relativamente baixa resolução de imagens clínicas. Além disso, 124 radioimunoconjugados marcado-I podem estar sujeitos a desalogenação in vivo, um processo que pode diminuir índices de atividade tumoral-a-fundo. 6,7

O esforço para encontrar um radioisótopo emissor de pósitrons para suplantar 64 Cu, 86 Y, e 124 I em radioimunoconjugados tem alimentado a recente onda de pesquisa em 89 anticorpos Zr-marcados. 8-12 Tele razão para o advento de Zr 89 é bastante simples: o metal radioactivo possui propriedades físicas, químicas e quase ideal para o uso em diagnóstico PET radioimunoconjugados 13 89 Zr é produzido através da 89 Y (p, n) 89 Zr reacção num ciclotrão utilizando um. comercialmente disponível e de 100% natural abundante alvo Y 89. 14,15 O metal radioactivo tem um rendimento de 23% de positrões, decai com uma meia-vida de 78,4 horas, e emite positrões com a energia relativamente baixa de 395,5 keV (Figura 1). 13,16,17 É importante notar que 89 Zr também emite uma energia alta, 909 keV γ-raios com 99% de eficiência. Enquanto esta emissão não interfere activamente com as emitidas 511 fótons keV, requer consideração extra no que diz respeito ao transporte, manuseio, e dosimetria. Apesar dessa ressalva, estas características de degradação em última análise, significa que 89 Zr não só tem um h mais favorávelalf-vida para a imagem latente com anticorpos do que 86 Y e 64 Cu, mas também pode produzir imagens de alta resolução de 124 I, que emite pósitrons com energias superiores de 687 e 975 keV, bem como um número de fótons com energias dentro de 100-150 keV de os fotões criado-positrão 511 keV. 13 Além disso, 89 Zr também é mais seguro de manusear, menos caros de produzir, e residualizes nos tumores de forma mais eficaz do que a sua contrapartida com iodo radioactivo. 18,19 Uma limitação potencial de 89 Zr é que ela não possui um isotop�ogo terapêutico, por exemplo, 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapia). Isso impede a construção de agentes de imagem quimicamente idênticos, substitutos que podem ser utilizados como batedores de dosimetria para os seus homólogos terapêuticas. Dito isso, as investigações sugerem que 89 anticorpos Zr-rotulados têm potencial como substitutos de imagem para 90 Y- e 177 imunocon Lu-marcados.20,21

De um ponto de vista químico, tal como um metal do Grupo IV, 89 Zr existe como um catião 4 em solução aquosa. Ion O Zr 4+ é altamente carregada, relativamente grande (raio efetivo = 0,84 Å), e pode ser classificado como um cátion "hard". Como tal, ele exibe uma preferência para os ligandos de rolamento até oito doadores de oxigénio, rígidos aniónicos. Facilmente o quelante mais comum usado em 89 radioimunoconjugados Zr-rotulados é desferrioxamine (DFO), um quelante acíclico derivados de siderophore tendo três grupos hidroxamato. O ligando de forma estável coordena o catião Zr 4+ rapidamente e de forma limpa à temperatura ambiente a níveis de pH biologicamente relevantes, e o complexo de Zr-DFO resultante permanece estável ao longo de vários dias em soro fisiológico, soro do sangue, e sangue total. 22 Estudos computacionais sugerem fortemente DFO que forma um complexo com hexacoordinate Zr 4+, em que o centro metálico está coordenado a três neutral e três dadores de oxigénio aniónicos do ligando, bem como dois ligandos de água exógenos (Figura 2). 23,24 O comportamento in vivo dos radioimunoconjugados empregando a conjugação de andaime 89 Zr-DFO tem sido geralmente excelente. No entanto, em alguns casos, a imagiologia e estudos de biodistribuição agudas revelaram níveis elevados de actividade nos ossos dos ratinhos injectados com 89 anticorpos marcados, Zr dados que sugerem que o osteophilic 89 Zr 4+ catião é libertado do quelante in vivo e, subsequentemente, mineraliza no osso. 25 Recentemente, uma série de investigações sobre o desenvolvimento de novos 89 Zr 4+ quelantes particularmente ligandos doadores de oxigénio, com oito têm aparecido na literatura. 24,26,27 No entanto, no presente, o DFO é o quelante mais amplamente empregado em 89 radioimunoconjugados Zr marcado por uma larga margem. Uma variedade de diferentesbioconjugação estratégias têm sido utilizadas para fixar o DFO aos anticorpos, incluindo clique química bioorthogonal, a reacção da tiol-reactivo DFO constrói com cisteínas em que o anticorpo, e a reacção de activado DFO-éster tendo constrói com lisinas do anticorpo. 4,28- 30 facilmente a estratégia mais comum, no entanto, tem sido a utilização de um derivado de isotiocianato de rolamento de DFO, o DFO-NCS (Figura 2). 22 Este quelante bifuncional disponível comercialmente de forma robusta e fiável, forma ligações covalentes estáveis ​​com as lisinas de tioureia da anticorpo (Figura 3).

Ao longo dos últimos anos, uma grande variedade de 89 radioimunoconjugados Zr-DFO-rotulados foram relatados na literatura. Investigações pré-clínicas têm sido especialmente abundante, com anticorpos que vão desde o mais conhecido cetuximab, bevacizumab, e trastuzumab para anticorpos mais esotéricas, como o de segmentação CD105 TRC105 e fPSA-targeting 5A10. 30-36 Mais recentemente, um pequeno número de ensaios clínicos de fase precoce utilizando 89 anticorpos Zr-DFO-rotulados têm surgido na literatura. Ensaios Especificamente, os grupos na Holanda publicaram que empregam 89 Zr-DFO-IACM U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, e 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Além disso, uma série de outros estudos clínicos com 89 radioimunoconjugados Zr-marcadas estão em andamento, incluindo as investigações aqui no Memorial Sloan Kettering Cancer Center, usando o PSMA-alvo 89 Zr-DFO-J591 para geração de imagens de câncer de próstata e 89 Zr-DFO-trastuzumab-alvo HER2 para geração de imagens de câncer de mama. 23, 30 Além disso, enquanto que os anticorpos radiomarcados permanecem as mais comuns 89 Zr-radiofármacos marcados, o metal radioactivo tem sido cada vez mais utilizado com outros vectores, incluindo péptidos, proteínas e 38-43 nanomateriais.

A modularidade deste 89 Zr-DFO metodologia rotulagem é uma enorme vantagem. O repertório de anticorpos de segmentação de biomarcadores é cada vez maior, e o interesse em realizar em imagem PET vivo usando essas construções está crescendo em ritmo acelerado. Como resultado, acreditamos que o desenvolvimento de práticas mais padronizados e protocolos poderia beneficiar o campo. Um excelente protocolo experimental escrito para DFO-NCS conjugação e 89 Zr radiolabeling já foi publicada por Vosjan, et al. 22 Consideramos que a demonstração visual proporcionado por este trabalho poderia ajudar ainda mais os investigadores novos para estas técnicas. No protocolo a mão, o antigénio da membrana alvo J591 anticorpo específico da próstata irá ser usado como um sistema modelo para ilustrar (1) a bioconjugação do quelante bifuncional DFO-isotiocianato de um anticorpo, (2) o radioss�tese e a purificação do 89 Zr-DFO-mAb radioimunoconjugado,e (3) in vivo imagiologia de PET com 89 um de Zr-DFO-mAb radioimunoconjugado em um modelo murino de cancro. 23,44,45

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Protocolo

Todas as experiências com animais in vivo descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Conjugação de DFO-NCS J591

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de 2-5 mg / ml de J591 em 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (pH 7,4) ou em tampão HEPES 0,5 M (pH 7,4).
  2. Dissolve-se o DFO-NCS em DMSO seco a uma concentração entre 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml). Sonicar ou vórtice a solução cuidadosamente, a fim de facilitar a dissolução completa.
  3. Ajustar o pH da solução para 8,8-9,0 J591 pela adição de pequenas alíquotas (<10 ul) de 0,1 M de Na 2 CO 3.
  4. Uma vez que a solução de anticorpo é o pH correcto, adicionar um volume da solução de DFO-NCS correspondente a 3-4 vezes o excesso molar do agente quelante bifuncional.
    1. Para exameplo, adicionar 4-5 mL de uma solução 10 mM (7,6 mg / ml) Solução de DFO-NCS (40,4 nmol DFO-NCS) a 1 mL de uma solução 2 mg / anticorpo J591 (13,3 nmol J591). A quantidade de DMSO na mistura final de reacção aquosa não deverá exceder 2% v / v.
  5. Incubar a reacção durante 30 min a 37 ° C num bloco de aquecimento a agitação a 350 rpm.
  6. Depois de 1 hora a 37 ° C, purificar o imunoconjugado resultante utilizando uma coluna de exclusão de tamanho descartável dessalinização pré-embalados com um peso molecular de 50.000 de corte usando tampão HEPES 0,5 M (pH 7,4) como o eluente. Este passo irá produzir uma solução do construto J591-DFO completado 2 ml.
  7. Medir a concentração da J591-DFO construir num espectrofotómetro de UV-Vis.
  8. Se uma concentração mais elevada da construção é desejado, concentra-se a solução J591-DFO usando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte.
  9. Guardar a solução do imunoconjugado J591-DFO concluída a -20 ° C no escuro.
    NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento.

2. Radiomarcação J591-DFO com 89 Zr

ATENÇÃO: Esta etapa do protocolo envolve a manipulação e manipulação de radioatividade. Antes de executar estas etapas ou realizar qualquer outro trabalho com pesquisadores de radioactividade deve consultar com Radiação Departamento de Segurança da sua instituição de origem. Devem ser tomadas todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

NOTA: No interesse do bom radioquímica nota de manutenção, a quantidade de radioactividade na amostra deverá ser medida utilizando um calibrador de dose e registrados antes e depois de Passos 2,2-2,13 no protocolo abaixo. Isso vai ajudar com a determinação exata da yields radioquímica e atividades específicas.

  1. Prepara-se uma solução de 0,5-2,0 mg de J591-DFO em 200 ul de tampão HEPES 0,5 M, pH 7,5.
  2. Pipetar um volume da 89 Zr 4+ solução estoque (normalmente fornecidos em 1,0 M de ácido oxálico) correspondente a 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) em 2 ml de um tubo de plástico de microcentrífuga com tampa de rosca. Ajuste o volume desta solução para um total de 300 l com ácido oxálico 1,0 M.
  3. Ajustar o pH da solução de 89 Zr 4+ para 6,8-7,5 usando 1,0 M de Na 2 CO 3. Começar pela adição de 250 ul de 1,0 M de Na 2 CO 3 a 89 Zr 4+ solução e subsequentemente adicionar menor (<10 ul) de alíquotas de base para se atingir o pH desejado.
  4. Adicionar a quantidade desejada de solução de pH ajustado 89 Zr 4+ à solução J591-DFO preparado no passo 2.1.
  5. Verifique o pH da mistura de reacção radiolabeling para garantir que ele esteja dentro do intervalo desejado de 6,8-7,5.
  6. Incubar a reacção de marcação radioactiva durante 60 min a RT num bloco de aquecimento a agitação a 350 rpm.
  7. Após 60 min de incubação, medir a radiolabeling rendimento da reacção usando rádio-TLC.
    1. Para este fim, manchar 1 uCi de a mistura de reacção sobre uma TLC de radiomarcação tira impregnada em sílica. Permitir que a alíquota para secar, executar o TLC utilizando um eluente de 50 mM de DTPA (pH 5,5) e a tira de análise de TLC utilizando um scanner de rádio-TLC. 89 Zr 4+ ligado ao construto J591-DFO aparece na origem (R f <0,1), enquanto que 89 livres Zr 4+ catiões serão quelado com DTPA e elui-se com a frente do solvente (Rf> 0,9).
    2. Calcula-se o rendimento da reacção de marcação radioactiva, integrando o radiocromatograma, dividindo a área sob a curva de Rf de 0,0-0,1 pela área total sob a curva, e multiplicando por 100.
  8. Se o rendimento de radiomarcação é suficiente (tipicamente uma actividade específica teórica de> 2 mCi / mg), temperar a reacção com 5 mL de DTPA 50 mM, pH 5,5.
  9. Purifica-se o imunoconjugado resultante using um tamanho descartável coluna pré-embalada com uma exclusão de dessalinização de 50.000 de peso molecular de corte usando um eluente de 0,9% ou soro fisiológico estéril com 5 mg / ml de ácido gentísico ou 0,25 M de acetato de sódio (pH 5,5) com 5 mg / ml de ácido gentisico . Este passo irá produzir uma solução de completado o radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 2 ml.
  10. Após a purificação, a verificar a pureza radioquímica do 89 Zr-DFO-J591 usando radio-TLC como descrito no passo 2.7.
  11. Calcula-se o rendimento global de radiomarcação da reacção dividindo-se a quantidade de actividade inicialmente adicionados à solução de anticorpo por a quantidade de radioactividade isolado purificado com o radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591.
  12. Calcula-se a actividade específica final, dividindo a quantidade de actividade isolado purificado com a 89 Zr-DFO-J591 radioimunoconjugado pela massa inicial de DFO-J591 na reacção de marcação radioactiva.
  13. Se uma concentração mais elevada é desejada, concentrar the 89 solução de Zr-DFO-J591 usando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte.
    NOTA: O ácido gentisico utilizado no passo de purificação final é um rádio-protector utilizado para minimizar a degradação do anticorpo devido à radiólise 46 Enquanto o armazenamento do radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 durante até 48 horas a 4 ° C. é possível, não é recomendável. Se o radioimunoconjugado é para ser armazenada, usar 0,25 M de acetato de sódio (pH 5,5) com 5 mg / ml de ácido gentisico como o tampão de armazenamento, a fim de minimizar o risco de radiólise mediada por hipoclorito. 47

3. Imagem In Vivo de PET com 89 Zr-DFO-J591

CUIDADO: Como no Protocolo Secção 2, este passo do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Todos possibdevem ser tomadas medidas le minimizar a exposição a radiações ionizantes.

  1. Em camundongos nus atímicos masculinos, implante subcutâneo 5 x 10 células cancerosas da próstata 6 LNCaP e permitir que estes a crescer a um 100-150 mm 3 heterólogo (3-4 semanas após a inoculação). 44
  2. Dilui-se o radioimunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 a uma concentração de 1,0 mCi / ml em 0,9% de solução salina estéril.
  3. Injectar 200 ul de solução a 89 Zr-DFO-J591 (200 uCi; 7,4 MBq). Na veia lateral da cauda dos ratinhos portadores do xenoenxerto 48
  4. No ponto de tempo de imagem desejada (por exemplo, 12, 24, 48, 72, 96, ou 120 horas pós-injecção), anestesiar a um rato com isoflurano a 2%: mistura de gás oxigénio.
  5. Posicione o mouse em cima da cama do pequeno scanner de PET animal, e manter a anestesia durante a varredura usando um isoflurano 1%: mistura de gás oxigênio. Antes de colocar o animal na mesa do scanner, verifique anestesia utilizando o método toe-pitada e applpomada oftálmica y aos olhos do mouse para evitar o ressecamento durante a anestesia. 49
  6. Adquirir os dados de PET para o mouse através de uma verificação estática com um mínimo de 40 milhões de eventos coincidentes, utilizando uma janela de energia de 350-700 keV e uma janela de tempo coincidência de 6 ns. 50
  7. Depois de concluir a aquisição da imagem, não deixe o mouse autônoma e não colocá-lo em uma gaiola com outros ratos até que recuperou a consciência.

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Resultados

O primeiro passo deste protocolo a conjugação de DFO-NCS para o anticorpo é tipicamente muito robusto e fiável. Geralmente, a purificada, imunoconjugado modificado por quelante pode ser obtido em> 90% de rendimento, e utilizando 3 equivalentes molares de DFO-NCS inicial na reacção de conjugação vai proporcionar um graus de rotulagem do quelante de aproximadamente 1,0-1,5 DFO / mAb. Os 89 Zr radiomarca�o e etapas de purificação do processo são igualmente simples. Nas concentrações descrita...

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Discussão

Enquanto a construção, radioimunoconjugados radiolabeling e imagiologia de 89 Zr-DFO-labled geralmente é um procedimento bastante simples, é importante manter algumas considerações-chave em mente durante cada etapa do processo. Por exemplo, talvez a causa mais provável para preocupação durante o passo de conjugação do procedimento é a agregação do anticorpo durante a reacção de conjugação. Este problema é mais frequentemente um produto de mistura pobre da reacção de conjugação após a a...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Prof. Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, e Dr. Serge Lyaschenko para achou conversas.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
p-SCN-Bn-DFOMacrocyclicsB-705Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalateVarious, including Perkin-ElmerCaution: Radioactive material
PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17-0851-01 Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeUFC805024Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC PaperAgilent TechnologiesSGI0001Cut into strips 0.5 cm wide

Referências

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