The Hole Board Modificado - Medir Comportamento, Cognição e Interação Social em camundongos e ratos

Resumo

This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.

Resumo

Este protocolo descreve o conselho buraco modificado (MHB), que combina características de uma placa de orifício tradicional e campo aberto e é projetado para medir múltiplas dimensões do comportamento incondicionado em pequenos mamíferos de laboratório (por exemplo, camundongos, ratos, musaranhos e pequenos primatas). Este paradigma é uma alternativa viável para a utilização de uma bateria de testes de comportamento, uma vez que uma ampla gama de perfil comportamental comportamental de um animal pode ser feito com um único ensaio.

O aparelho é constituído por uma caixa, que representa a área "protegida", separado de um compartimento de grupo. A bordo, em que pequenos cilindros são escalonados em três linhas, é colocado no centro da caixa, o que representa a área 'desprotegida' do set-up. As capacidades cognitivas dos animais pode ser medido por iscagem alguns cilindros na placa e medindo a memória de trabalho e de referência. Outro comportamento incondicionada, como activity-related-, ansiedade-related- e comportamento social, pode ser observado usando esse paradigma. Flexibilidade comportamental e a capacidade de se habituar a um ambiente novo, adicionalmente, pode ser observado sujeitando os animais para ensaios múltiplos no MHB, revelando uma visão sobre as capacidades adaptativas dos animais.

Devido ao testar os efeitos de ordem em uma bateria de teste comportamental, os animais naive deve ser utilizada para cada experiência individual. Ao testar múltiplas dimensões comportamentais em um único paradigma e, assim, contornar esse problema, o número de animais experimentais utilizados é reduzido. Além disso, evitando o isolamento social durante o ensaio e sem a necessidade de alimentar privar os animais, o MHB representa um sistema de teste comportamental, induzindo qualquer caso, de muito baixa quantidade de stress.

Introdução

A placa de orifício modificado (MHB) é utilizado para avaliar o comportamento de vários dimensões não condicionado, principalmente em ratos e ratazanas ^1. Uma série de testes amplamente usados ​​medir um único parâmetro de comportamento que não cobre completamente todo o fenótipo de uma dimensão comportamental. A MHB foi desenvolvido com base no conceito de que os roedores podem mostrar seu rico repertório comportamental apenas em um ambiente de teste rica ² e, assim, permite observações etológicas complexos.

O conjunto compreende-se as características da placa de orifício tradicional e o teste de campo aberto, resultando num paradigma complexo que ultrapassa as desvantagens de uma bateria de teste (ou seja, na redução do número de animais utilizados ^1,3,4, contornando o possíveis efeitos da ordem de teste ^5, e reduzir o tempo-efeito e os custos ^6). Em contraste com a maioria dos testes comportamentais (por exemplo, Hånell & Marklund, 2014) ^{7 <}/ Sup>, uma vantagem da MHb é que os animais não precisam de ser privados de alimentos a fim de aumentar a motivação para resolver a tarefa. Além disso, o isolamento social pode ser contornado durante o teste, colocando companheiros de grupo do animal experimental num (group-) compartimento separado do compartimento de teste por uma divisória perfurada transparente, permitindo a visual, auditiva e olfativa contato ^8,9.

A MHB foi (farmacologicamente) validado para ambos os camundongos e ratos ^1,6. A ampla gama de comportamentos podem ser medidos, como o comportamento de evitação, avaliação de risco, excitação, exploração, atividade locomotora, habituação, afinidade social e cognição ^2,8-10. Além disso, o MHB pode ser combinado com um teste de inibição da ingestão de alimentos, bem como teste de reconhecimento de objecto novo ^10,11. Finalmente, o MHB também pode ser utilizado para efectuar experiências de stress sociais testando animais socialmente vencidos ao colocar um indivíduo dominante emo compartimento do grupo ^12,13. Este protocolo para camundongos e ratos dará uma visão geral das múltiplas aplicações do MHB.

Protocolo

NOTA: Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal do University Medical Center Utrecht e da Universidade de Utrecht, na Holanda. Além disso, as experiências com animais seguiu os princípios de cuidados com animais de laboratório e consulte as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Mamíferos em Neurociências e Comportamento Research. ²⁵

1. Experimental Set-up

NOTA: O aparelho de MHB padrão é constituída por uma caixa cinzenta experimental PVC (100 x 50 x 50 cm) separado de um compartimento adicional (50 x 50 x 50 cm) em que os companheiros de grupo do animal experimental pode ser colocada durante o período de teste por um transparente, perfurado partição ^1. Se a presença de companheiros de grupo é indesejado ou se os animais alojados individualmente são testados, substitua a partição transparente por uma divisória feita de PVC cinza (Figura 1;. Ver também Ohl et al (2001) ^1). O MHB (with medidas diferentes) utilizados para testes cognitivos é descrito no ponto 5 do protocolo.

1. Colocar a placa (60 x 20 x 0,5 cm, feito de PVC cinzento) no meio da caixa.
   NOTA: A placa pode conter 20 cilindros (ᴓ 1,5 cm) ¹⁴ cambaleou em duas linhas ou 23 cilindros (ᴓ três centímetros) ⁸ escalonados em três linhas.
2. Divida a área em torno da placa por linhas pretas em 10 retângulos (20 x 15 cm) e 2 quadrados (20 x 20 cm).
3. Posicione a luz do estágio acima da placa para criar um contraste maior na intensidade da luz entre a placa (o que representa uma área desprotegida comparável com o centro de um campo aberto ou o compartimento de luz de um teste de transição claro-escuro) e da caixa (área protegida) a fim de aumentar o carácter aversivo de ^4,8 a placa.
4. Casa os animais sob uma hr 12 inverteu ciclo dia-noite (por exemplo, as luzes apagadas às 7:00 e luzes acesas às 07:00).
   NOTA: No entanto, o MHB também podeser usado sob o cronograma de luz convencional (veja a discussão sobre os potenciais deficiências) ^1,6.
5. Realize o teste de comportamento na fase mais ativa dos animais (por exemplo, 10:00 - 14:00) ^4,15.
6. Manter um período de habituação de 2 semanas após a chegada dos animais nas instalações. Durante este período têm a mesma pessoa que executa a experiência comportamental manipulação dos animais quatro vezes por semana, e incluem todos os procedimentos de manuseamento de ser realizadas durante o teste real. Manipulação dos animais exclusivamente durante o tempo do dia em que os animais serão expostos ao teste mais tarde.
7. Grave os experimentos para armazenamento de dados em vídeo e, a fim de otimizar os resultados e reduzir a variabilidade inter observador, praticar o placar comportamental por meio de uma gravação de vídeo de experiências anteriores ^2. Certifique-se de padronizar todas as ações e procedimentos executados pelo observador.

2. Behavioral Testing - sem a presença de companheiros de grupo

1. Realizar teste comportamental na sala os animais são alojados em regularmente (para evitar possíveis efeitos de transporte para um local de teste) e instalar todo o equipamento de teste antes da chegada dos animais nas instalações (para os animais habituar à presença do equipamento).
2. Escolher-se o animal pela base da cauda, ​​a partir da sua gaiola e colocá-lo directamente no MHB.
3. Colocar cada animal no aparelho no mesmo canto virado para a parede (como indicado na Figura 1).
4. Permitir que o animal para explorar livremente o MHB por um período de tempo (geralmente 5 min ^1,6,16-18).
5. Já um observador experiente vivo marcar os parâmetros comportamentais, utilizando software de pontuação comportamental. Use os parâmetros listados na Tabela 1.
   Atenção: alguns parâmetros comportamentais (por exemplo, auto-estradas e comportamento exploratório) pode ser marcado automaticamente como por exemplo, Discutido por Henry et al. (2010) ¹⁹ após o ajuste necessário do MHB.
6. Limpe o equipamento com água da torneira e uma toalha de papel depois de cada julgamento, a fim de evitar um viés baseado em pistas olfactivas.
   Nota: Os efeitos de testes de ordem possíveis quando testando animais socialmente alojados deve ser mantido em mente ^17,20.

3. Behavioral Testing - na presença do Grupo Mates

1. No caso do grupo habitação, medir a interacção com o animal experimental e seus companheiros de gaiola, durante o teste.
   1. Coloque os companheiros de grupo no compartimento do grupo antes do teste do animal experimental para permitir a habituação (principalmente 10-30 min ^1,12).
      Nota: Os testes sob condições de estresse social é possível através da colocação de uma gaiola-mate dominante no compartimento do grupo ao testar uma socialmente derrotado indivíduo ^13.
   2. Colocar o animal experimental no compartimento de teste e permitir libertarly explorar a MHB como descrito na seção 2.
      Nota: Os efeitos de testes de ordem possíveis quando testando animais socialmente alojados deve ser mantido em mente ^17,20.
   3. Já um observador experiente vivo marcar os parâmetros comportamentais, utilizando software de pontuação comportamental. Use os parâmetros listados na Tabela 1.
   4. Limpe o equipamento com água da torneira e uma toalha de papel depois de cada julgamento, a fim de evitar um viés baseado em pistas olfactivas.

4. Novel Objeto Recognition and Food Intake Inibição

1. Familiarizar os animais com um objeto (por exemplo, um dado ou uma pelota de alimentos) em sua gaiola em casa dois dias antes do experimento.
2. Colocar o objecto familiarizados no aparelho 2 cm de distância a partir de um objecto novo (por exemplo, um parafuso ou comida não familiar) no canto transversalmente a partir do ponto de partida.
3. Medir o tempo que o animal leva a abordar o romance e familiar objeto / alimentos. Use os parâmetros em Tabela 1.
4. Limpe o equipamento com água da torneira e uma toalha de papel depois de cada julgamento, a fim de evitar um viés baseado em pistas olfactivas.

5. testes cognitivos

1. Inserir uma placa menor (35 x 22 x 1 cm) com 10 cilindros no meio da caixa (Figura 1) para o ensaio de ratos ^3,22. Reduzir o tamanho de caixa de 50 x 50 cm, para testar ratinhos ²¹ através da inserção de uma partição feita de PVC cinzento.
2. Perfumar todos os cilindros com um sabor animais são atraídos para (por exemplo, a baunilha) e isca todos com uma recompensa (por exemplo, um pedaço de amêndoa, uma recompensa altamente palatável para camundongos e ratos) debaixo de uma grade de modo que os animais não pode removê-lo.
3. Cilindros Cue (muitas vezes três), com um anel de cor (contrastando com o PVC cinza) e isca-los com uma recompensa removível (por exemplo, 0,05 g pedaço de amêndoa).
4. Familiarizar os animais com a recompensa diária nos dois dias antes do experimento emsua gaiola, oferecendo-o com uma pinça e certificando-se de que os animais comem.
5. Já um observador experiente vivo marcar os parâmetros comportamentais, utilizando software de pontuação comportamental. Medir os parâmetros listados na Tabela 2, para além dos parâmetros comportamentais mencionados na secção 2 (Tabela 1) com a excepção de os parâmetros relacionados com a inibição objeto reconhecimento ou ingestão de alimentos.
6. Fase 1: Com cada animal, executar quatro ensaios por dia com um intervalo inter-ensaio constante (por exemplo, 30-60 minutos) até que uma constante de tempo para concluir um ensaio for atingido (isto é, quando todos os três pedaços de amêndoas foram recolhidos).
7. Fase 2: Cue e isca três cilindros diferentes e colocar os animais na configuração para quatro ensaios para testar a capacidade de aprendizagem de reversão.
8. Limpe o equipamento com água da torneira e uma toalha de papel depois de cada julgamento, a fim de evitar um viés baseado em pistas olfactivas.

Resultados

A grande quantidade de parâmetros que podem ser medidos no MHB fazer esta configuração especialmente adequado para medir várias dimensões comportamentais. Um exemplo é a identificação de adaptação comportamental a um ambiente novo por exposição repetida ao teste. . Salomons et al (2010) estudaram a habituação de duas linhagens puras de camundongos (BALB / cJ e 129P3 / J) para a MHB sob duas condições diferentes de luz (luz vermelha: o contraste entre a caixa e alimentação: 45 lux vs. luz branca: contraste entre a caixa e alimentação: 115 lux (ver também seção de protocolo 1.3)) ^4. Ratinhos balc / cJ mostram uma diminuição (habituating) a latência até à primeira entrada do bordo (ver Tabela 1) em condições de luz vermelha, como mostrado na Figura 2A. Em contraste, os ratos 129P3 / J não mostram sinais de habituação sobre ensaios. A figura 2B mostra o experimento em condições de luz branca. Camundongos BALB / cJ mostrar novamente uma latência decrescente para a primeira entrada placa sobre ensaios ainda que a umnimals mostram um padrão de habituação mais lenta em comparação com a condição de luz vermelha. Camundongos 129P3 / J não só mostrar novamente prejudicada habituação, mas também uma tendência de sensibilização sob a condição de luz branca. Da mesma forma, em um estudo realizado por Salomons (2012) 129P2 / OlaHsd ratos mostraram uma flexibilidade comportamental prejudicada em resposta a novidade em comparação com camundongos BALB / cOlaHsd ^23. A diferença na capacidade de habituação torna-se assim aparente entre duas linhagens puras de ratos quando testado no MHB ^4.

A versão cognitiva do MHB pode por exemplo ser utilizado para medir alterações cognitivas em ratinhos. Van der Kooij et al. (2010) usou este set-up para medir o funcionamento cognitivo de camundongos C57BL / 6J com leve isquemia-hipoxia cerebral (45 min de hipóxia; HI-45), HI grave (75 min de hipóxia; HI-75) e sham- camundongos de controle ^9. A capacidade para completar os ensaios (isto é, encontrar os furos iscados dentro de 5 min) é mostrado na Figura 3A. O número de erros de memória de curto prazo (revisita a um buraco com isca), erros de memória de longo prazo (visitas a um buraco não iscas) e erros de omissão (nenhuma visita a um buraco com isca) são apresentados na Figura 3B-D respectivamente.

A fim de confirmar que o grupo HI-45 não teve nenhum comprometimento cognitivo, este grupo foi testado contra os falsos-controles em uma tarefa de reversão. Os três orifícios iscados foram nomeados para três cilindros diferentes e os animais foram testados para 4 ensaios. O efeito de reversão se torna evidente quando se compara a última prova da primeira fase com o primeiro ensaio da fase de reversão. A duração para completar os quatro ensaios de inversão dá uma indicação sobre o desempenho global. A Figura 4 mostra o tempo de latência para concluir o ensaio para os dois grupos e um claro efeito global do tratamento é evidente. Isto significa que, na tarefa de reversão de fato há um prejuízo na flexibilidade cognitiva (re-learning) no grupo HI-45, que será veio detectável utilizando a MHB ^9.

Figura 1. Visão esquemática do conselho buraco modificado. (A) O set-up consiste em um compartimento de teste (box) com no meio da (não protegido) bordo indicado com linhas em ziguezague e compartimento do grupo. = Novela objeto, = Objeto familiar, = Ponto de partida. (B) Visão esquemática da versão cognitiva do conselho buraco modificado para ratos. (C) Vista lateral de um cilindro, como utilizado na versão cognitiva do conselho buraco modificado. Um pedaço de amêndoa é colocada por baixo da grelha de todos os cilindros.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. A luz vermelha ou condições de luz branca. (A) de latência até a primeira entrada bordo (média + SEM) de BALB / cJ e camundongos 123P3 / J medida em condições de luz vermelha (caixa 0-5 lux e tábua de 45 lux). A ANOVA de medidas repetidas com ajuste Huyn-Feldt revelou uma cepa (P = 0,025), o julgamento (P <0,001) e ensaio de interacção x tensão (P <0,001) efeito a análise post hoc:. Entre as linhagens: * = P <0,0026, entre dois ensaios consecutivos: $ = P <0,0026 (BALB / cJ) (B) A latência da primeira entrada bordo (média + SEM) sob condições de luz branca (caixa 0-5 lux e tábua de 120 lux).. A ANOVA de medidas repetidas com ajuste Huyn-Feldt revelou uma cepa (P = 0,031), o julgamento (P <0,001) e interação x tensão julgamento (P <0,001) effe. ct análises post-hoc: entre as linhagens: * = P <0,0026, entre dois ensaios consecutivos: $ = P <0,0026 (BALB / cJ) e T = P <0,0026 (123P3 / J). Esta figura foi modificada a partir de 2010 ⁴ Salomons et al.. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. teste cognitivo na MHB (fase 1). Todos os números mostram a média + SEM. (A) A latência para concluir o julgamento (SEC) dos ratos de controle sham, HI-45 e HI-75. (B) Número de erros de omissão, visitas furo (C) Não iscados e (D) revisita para furos de iscas. * = P <0,05, ** = P <0,01, *** = P <0,001 vs sham HI-75, # = P <0,05, ## = P <0,01, ### = P <0,001HI-45 vs. HI-75. Este valor foi modificado a partir do Van der Kooij et ^al., 2010 ^9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Reversão tarefa de aprendizagem (fase 2). Latência para concluir um julgamento (sec) na tarefa de aprendizado reverso (média + SEM). Efeitos de julgamento: # = P <0,05, ## = P <0,01 (tarefa primeira reversão julgamento vs. julgamento anterior). O efeito do tratamento: * = P <0,05, ** = P <0,01 (HI-45 vs. sham). Este valor foi modificado a partir al. Van der Kooij et de 2010 ^9.

Sistema	Atividade	Parâmetro medido
Avoeu danço	Entrada Board	Frequência, latência (s), duração (%) e a duração média (s) sobre o bordo
Avaliação de risco	Atende esticada	Frequência e latência (s) de esticados posturas corporais (incluindo membros posteriores)
Excitação	Grooming	Frequência, a latência (s), duração (%) e duração média (s) auto-limpeza
	Defecação	Frequência e latência (s) de boli produzido
	Micção	Frequência e latência (s) de micções
Dirigido exploração	Visitas Buraco	Frequência e latência (s) de visitas do cilindro
	Novel exploração objeto	Frequência, a latência (s), duração (%) e duração média (s) explorar a novela objeto
Exploração sem direção	Elevando o caixa	Frequência e latência (s) de levantamentos na caixa (patas dianteiras não tocar na parede)
	Placa Empinar	Frequência e latência (s) de levantamentos no conselho
	Exploração Buraco	Frequência e latência (s) de explorações de cilindro
Memória	Familiar exploração objeto	Frequência, a latência (s), duração (%) e duração média (s) explorar a objeto familiar
Afinidade social	A interação do grupo	Frequência, latência (s), duração (%) e a duração média (s) que interage com o compartimento do grupo
Atividade locomotora	Cruzamento de linha	Frequência e latência (s) de cruzamentos de linha

Tabela 1: Lista de parâmetros comportamentais

Sistema de memória	Parâmetro	Descrição
A memória de longo prazo	Escolha errada	Visita ao cilindro não-iscas; nariz abaixo da borda
Erro de omissão	Omissão de um cilindro com isca	Nenhuma visita a um cilindro com isca
A memória de curto prazo	Escolha repetida	Revisitar a cilindro de iscas; nariz abaixo da borda
O desempenho geral	O tempo total de ensaio	Tempo até que todos os cilindros iscas foram visitados

Tabela 2: Lista de parâmetros cognitivos

Discussão

O paradigma MHB pode ser usado para medir as dimensões múltiplas do comportamento não-condicionado. O protocolo pode ser ligeiramente alterada dependendo do objectivo da experiência. Neste protocolo, discutir as definições, os tempos e as medições normalmente usado em nosso laboratório. No entanto, pequenos desvios para as medições do aparelho têm sido utilizados no passado, e também a quantidade de cilindros sobre o bordo pode variar ^{de 3.} Muitas vezes, estudos empregar um tempo de teste de 5 min por julgamento, mas outras vezes teste pode também ser apropriada, ou seja, terminando o teste assim como um teste cognitivo foi concluída com sucesso ou em estender o tempo de teste se os animais são extremamente ansiosas ou deficiência física. O tempo do dia de testes foi escolhida para estar sob condição de luz vermelha desde roedores são animais noturnos e são mais ativos na fase escura cedo. Roedel et al. (2006) revela os efeitos de luz ou ensaios fase escura sobre o desempenho comportamental e cognitivoem ratos DBA no MHB ^16. Outros estudos realizaram experiências MHB sob condições de luz branca ^1,6, no entanto, deve notar-se que o ensaio sob condições de luz branca pode induzir a inibição do comportamento e perturbação cognitiva (como mostrado em ratinhos DBA) ^16.

As Tabelas 1 e 2 contêm uma grande quantidade de parâmetros comportamentais a ser medido. Durante a análise de dados isto pode levar a alguns parâmetros que indicam um aumento significativo de, por exemplo, 'a placa de latência primeira entrada », mas não em outros parâmetros do mesmo sistema de motivação (neste caso," Prevenção "). Em alguns casos, isso pode levar a resultados inconclusivos. Guilloux et al. (2011) introduziu escores z comportamentais integrados à fenotipagem comportamental em ratos ^24. Com o uso de escores z comportamentais integrados os vários parâmetros podem ser combinados para um single-score z descrevendo uma motivatio especialsistema nal. Os escores z subsequentes podem por sua vez ser mais facilmente comparados através de testes comportamentais e experimentos.

Além das características descritas deste paradigma, uma utilização mais profunda tornou-se evidente no estudo de Salomons et al. (2012). A habituação à novidade de duas linhagens de camundongos (balc / cJ e 129P3 / J) na MHB foi comparado, apresentando uma diferença de flexibilidade comportamental indicando um perfil comportamental não-adaptativo dos ratos 129P3 / J ^4, espelhando prejudicada capacidades de adaptação e, provavelmente, até mesmo ansiedade patológica.

Concluindo, o MHB permite a medição de múltiplas dimensões comportamentais em um único experimento. Através da combinação de características de uma placa tradicional buraco e teste de campo aberto, comportamento incondicionada, a interação social, cognição e capacidades de adaptação, ou seja, o bem-estar pode ser investigado. Este teste pode por exemplo, ser utilizada para avaliar alterações comportamentais devidos ao pharmacological- e / oumanipulações genéticas, reprodução seletiva e capacidades adaptativas. Em comparação com a bateria de testes clássicos, o número de animais necessários é claramente reduzida e esforço experimentado pelos animais durante o teste é extremamente baixo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cognitive mHB apparatus			The box for cognitive testing is 50x50 cm by inserting a partition made of grey PVC in the standard mHB. A smaller board (35x22x1 cm) with 10 cylinders is placed in the middle of the box. All cylinders are scented with a flavor animals are attracted to (e.g. vanilla) and all are baited with a reward (e.g. a piece of almond) beneath a grid so the animals cannot remove it. Cylinders (often three) are cued with a colored ring (contrasting with the grey PVC) and are baited with a removable reward (e.g. 0.05 g piece of almond).
Vanilla flavor			Vanilla flavor dissolved in water (0.02%)
Camera			Camera that generates sufficient quality output to rescore the behavior from video.
Stage light			A theather light that allows to adjust the light intensity and the dimensions of the surface that is lit.
Behavioral scoring software			Behavioral scoring software.