Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Resumo

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Resumo

Ambos transcrição e regulação pós-transcricional ter um impacto profundo sobre a expressão dos genes. No entanto, comumente adotadas testes de rastreio baseados em células se concentrar em regulação da transcrição, sendo essencialmente por objectivo a identificação de moléculas-alvo do promotor. Como um resultado, os mecanismos de pós-transcrição são em grande parte a descoberto pela expressão de genes de desenvolvimento de drogas específicas. Descrevemos aqui um ensaio de base celular com o objectivo de investigar o papel da "região não traduzida (3 'UTR a 3) na modulação do destino do seu mRNA, e a identificação de compostos capazes de modificar. O ensaio baseia-se no uso de uma construção repórter da luciferase contendo a UTR 3 'de um gene de interesse integrado de forma estável numa linha celular relevante doença. O protocolo é dividido em duas partes, com o foco inicial no rastreio primário destinado à identificação de moléculas que afectam a actividade de luciferase depois de 24 horas de tratamento. A segunda parte do protocolodescreve o contra-rastreio necessário para discriminar compostos que modulam especificamente a actividade da luciferase por meio da UTR 3 '. Em adição ao protocolo detalhado e os resultados representativos, nós fornecemos considerações importantes sobre o desenvolvimento do ensaio e a validação da batida (s) sobre o alvo endógeno. O ensaio do gene repórter baseado em células descrito vai permitir que os cientistas para identificar moléculas que modulam os níveis de proteína através de mecanismos de pós-transcrição dependentes de uma UTR 3 '.

Introdução

Durante um longo período de regulação de transcrição da expressão do gene foi pensada para desempenhar um importante papel, se não exclusiva no controlo da produção de proteína. Um acúmulo de evidências, no entanto, indica que a regulação pós-transcricional contribui tanto quanto, se não mais do que, a regulação da transcrição para determinar a abundância de proteína celular ^1,2. Controle pós-transcricional da expressão do gene é muito mais complexo e elaborado do que se pensava anteriormente. Na verdade, todas as diversas fases de controle pós-transcricional surgiram para ser regulamentada, incluindo processamento de mRNA, localização, volume de negócios, a tradução ^3, bem como o recém-descrita RNA metilação reversível ^4. A partir de um número de processos de regulação pós-transcricional potencialmente afectados, o ensaio descrito a seguir concentra-se sobre aquelas envolvendo "região não traduzida (3 'UTR do mRNA 3). 3 'UTR amplamente afeta destino mRNA, principalmente, via interação específica de ligação RNA-proteins e RNAs não-codificantes para as suas sequências reguladoras e / ou estruturas secundárias ^5. Portanto, pequenas moléculas que alteram essas interações ou interferir com a montante vias de transdução de sinal vai mudar o equilíbrio que regula a abundância de proteínas. Esta abordagem terapêutica é de particular importância para patologias humanas em que existem evidências mostrando que os genes relevantes a doença estão sujeitos a regulação pós-transcricional, o qual representa, assim, um alvo potencial para a intervenção farmacológica. Portanto, os sistemas que permitam a triagem de moduladores níveis de mRNA 'através da interferência com os mecanismos de controle pós-transcricional em um formato de alto rendimento podem se tornar ferramentas valiosas na identificação de potenciais tratamentos novos.

O ensaio do gene repórter baseado em células descrito permite a identificação de compostos capazes de modular destino ARNm através de mecanismos dependentes da sua extremidade 3 'UTR. Consiste em várias diretor componentes (Figura 1) e requer poucos passos preliminares para validar a viabilidade do ensaio. Em primeiro lugar, a construção do repórter é concebido de modo a incluir a UTR 3 'de um gene de interesse. A UTR 3 'é fundido com a extremidade de um gene repórter, tal como luciferase de pirilampo (figura 1). Quaisquer alterações nos mecanismos de controle pós-transcricional exercidas através da inserida UTR 3 'irá alterar a estabilidade e / ou a eficiência da tradução desta transcrição quimérico, resultando em níveis de luciferase variadas. Portanto, mudanças na atividade luciferase servir como medida indireta de regulação pós-transcricional afetada do gene de interesse. O segundo componente do sistema é uma construção repórter de controlo, um plasmídeo de expressão idênticos que expressa o mesmo gene repórter, mas não contém qualquer UTR 3 '. Os dois plasmídeos repórter pode ser concebido no laboratório utilizando protocolos de biologia molecular convencionais ou adquiridos de fontes comerciais.

A selecção de uma linha celular apropriada é essencial para a construção de ensaio. Qual linha celular é o modelo ideal depende de inúmeros fatores que vão desde a necessidade clínica, como semelhança máxima de patologia para questões apenas práticos como características disponibilidade, transfectabilidade, e de crescimento. É importante notar que antes de proceder se deve certificar-se de que a fusão da UTR 3 'para o gene repórter tem um efeito esperado sobre o nível de transcrição quimérico. A ausência de diferença significativa no sinal da luciferase a partir do 3 'UTR de suporte e controlo repórter construções transfectadas transientemente em células seleccionadas que indicaria que a UTR 3' não é funcional neste modelo celular, o que levou para a pesquisa de outros alternativos. Para o formato de alto rendimento, os UTR 3 'de suporte de controlo e de luciferase construções repórter deve ser integrado de forma estável na linha de células seleccionada. Usando um integrado de forma estável ao longo transfectadas transitoriamenteA linha celular é preferível por várias razões. Isso vai ampliar a escolha de um modelo de celular, incluindo linhas de células difíceis de transfecção, diminuir a variabilidade dos dados decorrentes de oscilações de eficiência de transfecção, diminuir os custos. Além disso, após a transfecção as células transientes são frequentemente muito sobrecarregada com um plasmídeo de ADN que conduz à saturação do sistema. Nestas configurações de um novo aumento na expressão repórter pode ser um desafio, resultando em diminuição da sensibilidade em relação a compostos upregulating potenciais.

Finalmente, quando todos os componentes do ensaio são criados, é fundamental antes de se mudar para o formato de alto rendimento para determinar a viabilidade do ensaio, ou seja, se a atividade luciferase pode ser de fato para cima e para baixo-regulado especificamente através da inserido 3 ' UTR. Os melhores controlos seria pequenas moléculas relatados para modular a estabilidade do mRNA ou traductibilidade através da UTR 3 'de interesse. Se tendo estes énão é possível, são aceitos controles substitutos imitando o efeito desejado. Estes poderiam ser miARNs ou proteínas de ligação a ARN conhecidos para exercer os seus efeitos através de ligação a UTR 3 'de interesse. Avaliação de tais controlos antes da despistagem primária não só indica a funcionalidade do ensaio desenvolvido, mas também permite uma estimativa da sua gama dinâmica, sensibilidade e desempenho no formato de alto rendimento.

Usando o protocolo descrito nós analisamos uma biblioteca de 2.000 composto ^6. Neuroblastoma, o tumor sólido extracraniano mais comum da infância, foi usada como modelo biológico e a 3 'UTR do oncogene MYCN, cuja amplificação prediz fortemente resultado adverso de neuroblastoma, como um gene alvo ^7. A Figura 2 descreve o esquema experimental. A triagem foi dividida em três corridas com o tamanho do lote de 27 placas teladas em uma corrida. O lote de 27 placas incluído biblioteca Coleção Spectrumplacas n.1-n.8 + n.25 (primeira corrida), n.9-n.16 + n.25 (segunda corrida) e n.16-n.24 + n.25 (terceira pista), cada placa exibido em triplicado. Assim, uma placa de biblioteca (n.25) foi testada em todas as três corridas possibilitando comparação inter-run. O protocolo a seguir descreve uma única corrida de 9 placas de biblioteca testados em triplicado.

Protocolo

NOTA: A taxa de transferência de tais sistemas de ensaio depende do equipamento de laboratório HTS disponível. Este protocolo é facilitada por um Tecan Freedom EVO 200 robô, que executa o manuseamento de líquidos em formato de 96 poços. A miniaturização para o formato de 384 poços é também possível. O sistema robótico de manuseamento de líquidos está posicionada sob uma câmara de fluxo laminar, a fim de manter as condições assépticas durante todos os passos experimentais. Se não automatização da movimentação de líquido está disponível, o protocolo pode ser facilmente adaptado para o formato de baixa taxa de transferência.

Rastreio primário

1. Dia 1: Preparar e celulares das sementes

NOTA: Semear as células para se obter 80% de confluência no tempo do ensaio de actividade de luciferase, ou seja, 48 horas após a sementeira.

1. Ressuspender as células de neuroblastoma tratadas com tripsina CHP134-mycn3UTR a uma concentração de 2 x 10 ⁵ células / ml em RPMI contendo 10% de FBS e 1% de L-glutamina. Por 27 placas preparar pelo menos 250 ml de suspensão de células tendo em conta a manipulação de líquidos, bebedouros volumes mortos e passos repetidos pipetagem. Despeje a suspensão de células em reservatório estéril e colocá-lo sobre a mesa do robô.
2. Coloque 9 brancas de fundo plano placas de 96 poços com código de barras e uma caixa de 200 ul pontas de pipetas estéreis sobre a mesa do robô. Misture a suspensão de células por pipetagem antes de cada etapa de dispensação para evitar células sedimentação por gravidade. Dispensar 75 uL de células para cada poço de placas de 9 para obter uma densidade final de 1,5 x 10 ⁴ culas por po.
3. Cobrir as placas com as tampas e deixá-los fora da incubadora durante 30 minutos para permitir que as células sedimentar para o fundo do poço. Isso irá minimizar os efeitos de borda.
4. Repita os passos 1.2 e 1.3, duas vezes, a fim de preparar um número total de 27 placas.
5. Colocar as placas a 37 ° C e 5% de CO ₂ e incuba-se durante 24 horas.

2. Dia 2: tratar as células com compostos Biblioteca

ntent "> NOTA: A biblioteca de moléculas pequenas Colecção Espectro consiste em 2000 compostos dispostos em 8 fileiras e 10 colunas em 25 placas de 96 poços a uma concentração de 10 mM em DMSO As cavidades sobre os primeiros e últimos colunas são deixados vazios para os controlos. ensaios de rastreio. Composto são tipicamente realizadas a uma concentração de composto 1-10 uM ^8. O protocolo de rastreio aqui descrito corrige 2 uM como a concentração de trabalho e 24 horas como o ponto final do ensaio.

1. Descongele 9 placas biblioteca de compostos à temperatura ambiente.
2. Prepare duas calhas com PBS estéril e soluções de DMSO PBS-0,5% e coloque-os sobre a mesa do robô. Para cada biblioteca de placa, preparar e rotular em conformidade uma placa de diluição - um polipropileno com fundo em U de placas de 96 poços com um volume de trabalho de pelo menos 400 ul. Encher cada poço de colunas 2-11 de placas de diluição de 398 mL de PBS estéril usando dicas fixos da manipulador de líquido. Preencha colunas 1 e 12 anos, com 50 mL de PBS estérilcom DMSO 0,5%, a fim de reproduzir a concentração do veículo nos poços de controlo (0,02%).
3. Coloque duas placas de biblioteca, as placas de diluição correspondentemente marcados, duas caixas de 50 l pontas de pipeta estéril e seis células placas sobre a mesa do robô. Descubra placas células.
4. Pipetar 2 uL da solução de stock 10 mM de um dos dois pratos de biblioteca na placa de diluição correspondente e misturar bem. Isto irá resultar numa concentração de compostos intermédios 50 uM. Utilizando o mesmo conjunto de pontas, dispensar 3 ul da diluição de 50 uM em 3 placas de 96 poços com células brancas com código de barras. Este esquema de diluição resulta em 2 uM de concentração de cada composto testado de trabalho.
   NOTA: Para evitar manipulações desnecessárias com as pontas, use um conjunto completo de 96 pontas, desde o início, apesar de as placas de biblioteca contêm apenas 80 compostos. Isto é possível uma vez que a primeira e as últimas colunas das placas da biblioteca estão vazias.
5. Substitua as pontas de pipeta e repita StEP 2.4 para a segunda placa de biblioteca.
6. Cobrir as placas de células e devolvê-las para a incubadora durante 24 h.
7. Repita os passos de 2,3-2,6 mais duas vezes para as placas de biblioteca restantes.

3. Dia 3: Realizar ensaio de luciferase

NOTA: Antes de realizar o ensaio de luciferase, é possível multiplexar com um ensaio de viabilidade celular baseado na redução de resazurina, a fim de se obter um índice de viabilidade celular de cada poço ^9. Multiplexing luciferase e ensaio de viabilidade ensaios resulta numa redução de sinal da luciferase que, no entanto, pode ser ignorado se as células fornecer um alto nível suficiente de actividade de luciferase. A actividade da luciferase pode ser detectada por uma variedade de reagentes do ensaio de luciferase ^10,11 comerciais e caseiros com sinal luminescente estável.

1. Equilibrar o reagente luciferase reconstituído de escolha para a temperatura ambiente. Verifique se o volume é suficiente para todas as placas ensaiadas. Para 27 de placas 170 ml de reagente luciferase serão necessárias, tendo em conta a manipulação de líquidos, bebedouros volume morto e passos repetidos pipetagem. Despeje o reagente luciferase em um reservatório e coloque-o sobre a mesa do robô.
2. Remover 9 placas com células da incubadora, coloque-os sobre a mesa robô, descobrir e esperar até atingir a temperatura ambiente. Adicionar 50 ul de reagente de luciferase por cavidade de placa de chapa. Entre as placas, introduzir um atraso igual ao tempo de leitura de luminescência de uma placa. Isto irá assegurar que todas as placas são medidos dentro de intervalo de tempo igual a partir da adição de reagente.
3. Após 30 minutos de incubação, colocar a primeira placa na luminometer e medir luminescência após um breve passo tremendo. Repita o procedimento para todas as placas. Grave o código de barras de cada placa e associá-lo ao arquivo de dados correspondente para evitar erros decorrentes de um grande número de placas manipulados.
4. Repita os passos de 3,2-3,3 duas vezes para os restantes 18 placas com células.
5. Recolhe-se o reagente de luciferase restante e armazená-lo a -20 ° C.

4. Dia 4: Análise de Dados

1. Processar dados experimentais utilizando normalização de todas as amostras para a média dos controles na placa tratados com o veículo. Para cada composto biblioteca, calcular o valor de x média e SD sobre triplicados.
2. Selecione up-regulação e down-regulação sucessos, definindo um limite de X ± k × SD, onde o X valor médio e SD são computadas com todos os valores de ensaio processado, e k é uma constante definida.
3. Escolher um limite arbitrário de corte <20% dos controlos tratados com o veículo quando uma redução do sinal da luciferase é mais provavelmente associados com a toxicidade do composto. Descartando os hits abaixo deste limiar irá reduzir significativamente uma série de visitas de falso-positivos no contra-triagem.
   NOTA: Em vez de normalização à base de controle, dados experimentais podem ser processados ​​aplicando pontuação Z ou o seu B s analógico robustanúcleo ^12. Além disso, os métodos estatísticos alternativos para seleção hit estão disponíveis ^12.

5. Counter-screening

NOTA: Os compostos identificados no rastreio primário (rotulado "hits") são confirmadas e avaliadas para a especificidade por um contra-rastreio.

1. Cereja escolher os hits selecionados das alíquotas armazenados em tubos com código de barras 2D individuais e criar novo "hit placas", salvando o layout correspondente. Não se esqueça de deixar posições livres para controles.
   NOTA: Na ausência de um sistema de cherry-picking eficiente, pode-se testar tanto o controle e 3 'células portadoras UTR em paralelo na triagem primária. Neste caso, a selecção específica de compostos com efeitos dependentes apenas introduzido na UTR 3 'será possível após o rastreio primário eliminando a necessidade de contra-rastreio. No entanto, o rastreio paralelo em duas linhas celulares vai dobrar o ensaiocustos.
2. Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção "Dia 1: Preparar e celulares das sementes"), para cada um "hit placa" preparar três placas de 96 poços de cada CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL células estáveis.
3. Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção "Dia 2: tratar as células com Biblioteca compostos"), use cada placa hit para tratar de três CHP134-mycn3UTR e três placas CHP134-CTRL em 2 mM concentração de trabalho.
   NOTA: Enquanto o contador da tela aqui descrito é realizado em triplicado, com a dose única de 2 uM, pode ser benéfico para substituir as repetições padrão e testar as visitas em 3 concentrações de diluições de 10 vezes variando de 2 uM a 20 nM. A aplicação desta abordagem não só permitiria confirmar os dados do ecrã primário, mas também para obter dados preliminares de resposta à dose sobre as visitas primárias, minimizando taxas de falsos positivos. Neste caso, uma tubagem análise diferente deve ser aplied para processar os dados experimentais e confirmar os hits.
4. Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção "Dia 3: Execute Luciferase Assay"), medir a atividade da luciferase em todas as placas-CHP134 mycn3UTR e CHP134-CTRL.
5. Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção "Dia 4: Análise de Dados"), normalizar os dados experimentais de poços tratados com a média dos controles na placa tratados com veículo e calcular a média e SD sobre repetições. Para cada composto testado, calcular a alteração vezes a actividade de luciferase em CHP134-mycn3UTR versus células CHP134-CTRL. Selecione mudança vezes arbitrária cut-offs> 1,5 e significância p-valores de <0,01.
   NOTA: Nas configurações de ensaio descritas o parâmetro determinante para o sucesso especificidade é uma mudança vezes significativa da atividade da luciferase em CHP134-mycn3UTR vs. células CHP134-CTRL. Se necessário, pode-se também avaliar a toxicidade composto realizando simultaneamente um ensaio de viabilidade celular no SEcompostos selecionada. Isso pode ser especialmente benéfico se os hits primários são contra-selecionados em uma análise de resposta à dose. Para uma dose única, a experiência indica uma forte correlação da actividade da luciferase reduzida com a diminuição da viabilidade celular ^6. Portanto, diminuição da actividade de luciferase em células-alvo bem como as células de controlo pode ser considerado como um indicador de toxicidade do composto na concentração testada.

Resultados

Utilizando a abordagem descrita, que rastreada uma biblioteca de 2.000 composto de potenciais moduladores de mecanismos de controlo pós-transcricional exercida através da 3 'UTR do gene MYCN. A Figura 3 mostra os resultados da despistagem primária exemplificado por uma placa única biblioteca. Sinal da luciferase apresentada como percentagem de controlos tratados com veículo foi obtida por medição da actividade de luciferase em placas em triplicado de células CHP134-mycn3UTR tratados...

Discussão

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.

The identification of primary hits is based ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 μl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 μl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A