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Neste Artigo

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Resumo

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Resumo

Inflamação do fígado como uma resposta à lesão é um processo altamente dinâmico envolvendo a infiltração de subtipos distintos de leucócitos incluindo monócitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células assassinas naturais (NK) e as células NKT. Microscopia intravital do fígado para monitorar a migração de células imunes é particularmente desafiador devido às altas exigências em matéria de preparação de amostras e fixação, resolução óptica e sobrevivência dos animais no longo prazo. No entanto, a dinâmica dos processos inflamatórios, assim como estudos de interacção celular poderia fornecer informações importantes para compreender melhor o início, a progressão e regressão da doença inflamatória do fígado. Portanto, um método altamente sensível e confiável foi criada para estudar a migração e célula-célula-interações de células imunes diferentes em fígado de rato durante longos períodos (cerca de 6 h) por dois fótons de microscopia de varredura a laser intravital (TPLSM) em combinação com tratamento intensivo monitorização. ent "> O método fornecido inclui uma preparação suave e fixação estável do fígado com perturbação mínima do órgão; imagiologia intravital longo prazo usando microscopia multiphoton multicolor com praticamente nenhuma fotodegradação ou efeitos fototóxicos, durante um período de até 6 horas, permitindo rastreamento de subconjuntos de leucócitos específicos; e condições de imagem estável devido à ampla fiscalização do rato parâmetros vitais e estabilização da circulação, temperatura e troca gasosa.

Para investigar a migração de linfócitos após a inflamação do fígado CXCR6.gfp ratinhos knock-in foram submetidos a imagiologia do fígado intravital em condições basais e após os danos do fígado aguda e crónica induzida por injecção intraperitoneal (s) de tetracloreto de carbono (CCl 4).

CXCR6 é um receptor de quimiocina expressa em linfócitos, principalmente em Natural T assassinas (NKT) -, Natural Killer (NK) - e subconjuntos de linfócitos T, tais como células T CD4 +, mas também asso mucosasated invariante células (MAIT) T 1. Seguindo o padrão migratório e posicionamento de CXCR6.gfp + células imunes permitiu uma visão detalhada sobre o seu comportamento alterado após a lesão hepática e, portanto, o seu potencial envolvimento na progressão da doença.

Introdução

A visualização de células e as funções celulares em órgãos inteiros ou até mesmo de organismos inteiros tem sido de grande interesse para mais de 50 anos, incluindo praticamente todas as partes do corpo 2. Por isso, alguns estudos iniciais já empregaram imagens intravital do fígado 3,4. No entanto, existem várias limitações atualizado sobre estável imagens de alta resolução a longo prazo do tecido do fígado.

Devido à posição anatómica do fígado em estreito contacto com o diafragma e o tracto gastrointestinal 5, o problema mais comum para imagiologia intravital microscópica é o movimento devido à respiração e, em menor grau, peristáltica do tracto intestinal 6. Em comparação com outros órgãos sólidos, cirurgia do fígado é particularmente desafiador. Devido à estrutura microvascular densa, manipulação cirúrgica pode conduzir a lesões hemorrágicas maciças, microcirculação comprometida 7 e também a activação de residente immune células, tais como células de Kupffer 8. Portanto, a fixação mecânica do tecido como publicado anteriormente 6,9 é susceptível de interferir com a imagem de microscopia intravital.

Em um fígado saudável, 10-15% do volume total de sangue reside dentro da vasculatura hepática, e o órgão recebe cerca de 25% do débito cardíaco geral 10, tornando o órgão altamente susceptíveis a mudanças na circulação (por exemplo, flutuações de pressão arterial ). Portanto, as interrupções no fluxo sanguíneo hepático devido, por exemplo, tensão de cisalhamento, deslocamento, lesão por manuseio excessivo dos tecidos ou circulação centralizada vai levar a alterações artificiais no comportamento migratório de leucócitos, deficiente oxigenação fígado e, portanto, mais danos ao fígado, afetando as respostas imunes do fígado, bem como preservação de órgãos e tempo de vida total do animal.

Os primeiros estudos microscópicos foram baseados em mi epifluorescência intravitalcroscopy, mas várias restrições técnicas, tais como o branqueamento foto e baixa profundidade de penetração limitar o uso desta técnica para imagiologia do fígado a longo prazo 4,11,12. Com o desenvolvimento da microscopia multiphoton na década de 1990, as limitações de branqueamento foto ou profundidade de penetração foram principalmente resolvido, já que este novo método era tecnicamente capaz de realizar estudos de imagem em praticamente todos os órgãos em situações da vida real 13-15. No entanto, os principais desafios que subsistem no que diz respeito à geração de imagens de fígado foram: movimentos de respiração, autofluorescência do tecido do fígado, protegendo o fluxo sanguíneo inalterado nos sinusóides hepáticos, e de imagem especialmente estáveis ​​por longos períodos de várias horas 16.

Apesar de vários estudos abordaram a função e migração de vários leucócitos no fígado 17, por exemplo, a NKT células-18-20, células T 21,22, os macrófagos do fígado 23,24 ou neutrófilos 25, a longo prazo multiphoton mimaging icroscopy ainda não tinha sido estabelecida com sucesso, uma tarefa ainda mais difícil em animais com doença hepática aguda ou crônica devido ao dano existente e, portanto, maior susceptibilidade a danos maiores 26. No entanto, monitorando o comportamento migratório e função celular de leucócitos no fígado em tempo real, permite que novas idéias em seu papel especial na homeostase do fígado e doença 27.

O receptor de quimiocina CXCR6 é expresso em vários subconjuntos de linfócitos, incluindo células assassinas naturais (NK), as células NKT e algumas populações de células T 18,28. Estudos anteriores em ratos indicaram que CXCR6 e sua CXCL16 ligando cognato pode controlar o patrulhamento de células NKT em sinusóides hepáticos durante a homeostase. Por conseguinte, a utilização de ratinhos CXCR6.gfp (transportando um knock-in de proteína fluorescente verde [GFP] no locus CXCR6) tem sido descrita para investigar a migração de linfócitos em vários órgãos tais como o cérebro 29e também fígado 18,20, mostrando aumento da infiltração de células CXCR6.gfp sobre a inflamação.

Com o método proporcionado no presente estudo foi possível seguir estes processos durante um longo período de tempo sob condições estabilizadas. O procedimento baseado multiphoton intravital permitido de imagem que foi altamente reprodutível com perturbação mínima do animal e do órgão; otimizado para a sobrevivência dos animais a longo prazo através de monitoramento extensa, seguida de perto o controle da respiração e circulação; e altamente flexível e fácil de adoptar igualmente para outros órgãos parenquimatosos, tais como de rim ou baço.

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Protocolo

NOTA: Os experimentos foram realizados em conformidade com a legislação alemã que rege os estudos em animais após o 'Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório "(publicação NIH, 8ª edição, 2011) e da Directiva 2010/63 / UE relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos (Jornal Oficial da União Europeia, 2010). Permissão oficial foi concedida a partir do cuidado com os animais e uso de escritório governamental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemanha).

Nota: Os passos que podem ser omitidos para a imagem latente de curto prazo (por exemplo, tirar fotos, pilhas 3-D ou também de microscopia de lapso de tempo curta duração) são marcados com asterisco (*) para reduzir o tempo de preparação e simplificar o protocolo cirúrgico. Imagiologia também pode ser realizada sem grande controlo e de circulação, se necessário, no entanto, o tempo de sobrevivência será acentuadamente reduzido.

1. Setup Microscópio e pré-cirurgia Preparação (5-10 min)

  1. Sistema Ligue (microscópio, laboratório de energia, laser, almofada de aquecimento, câmara climática, web cam, dispositivo de bomba de seringa, respirador).
  2. Ligue O 2 de abastecimento para Isoflurane Vapor e definir o nível de isoflurano para 1,5 Vol% (v / v), conectar-se a um pequeno respirador animal.
    1. Para imagens de curto prazo, manter a anestesia com isoflurano somente após a indução inicial anestesia ip (veja o passo 2.2). Em seguida, use 2 Vol% (v / v) isoflurano, e manter o tempo de imagem inferior a 2 horas para garantir estável microcirculação hepática.
  3. Definir a respiração 120-140 ciclos respiratórios / min com um volume de 150-200 uL.
  4. Configure fase rato agarose. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarose, vertendo-a em um prato (aproximadamente 10 cm x 15 cm base) num ângulo de 40 °.
  5. Configure área de trabalho cirúrgico coletando a instrumentação necessária. Para prevenir a infecção microbiana, desinfectar instrumentos usando uma solução a 1% de Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, formaldeído durante 5 minutos antes da experiência (Figura 1A).
  6. Obter restantes componentes: desinfectante da pele (por exemplo, solução de povidona iodo de 10%), no fígado (fase de pilhas e ponte), solução de agarose (3% (w v) em PBS /), bomba de seringa com 5% (w / v) de uma solução de glucose (G-5), bomba de seringa com solução anestésica I (cetamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, 5 ug de fentanil / ml), cotonetes, n-Butil-2-Cyanoacrylat, e 1x PBS. Coloque agarose fase prato em câmara de incubação para o pré-aquecimento.

2. A traqueotomia (10-15 min)

  1. Use camundongos C57BL / 6 a partir da casa de reprodutoras de 25-28 g. Casa os ratinhos sob condições específicas isentas de patogénios de acordo com as orientações FELASA, num ambiente de temperatura e humidade controladas com um ciclo luz / escuro de 12 h de 12 horas de luz. Permitir que os animais livre acesso à dieta padrão ratos (Sniff Padrão Rodent Diet) e água ad libitum.
  2. Anestesiar o mouse pelo initial intraperitoneal (ip) de injecção de 250 ul de solução de anestésico cetamina (II 0,1 mg / ml, xilazina 1 mg / ml, de Buprenorfina 10 ug / ml).
    1. * Para manutenção durante imagens intravital, administrar continuamente solução anestésica I por injecção contínua ip (cetamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, 5 ug de fentanil / ml) usando um dispositivo de bomba de seringa com uma taxa de fluxo de 0,2 ml / h em combinação com inalação de isoflurano 0,5 vol% (v / v).
    2. Verifique reflexos após 5 min (por exemplo pitada almofada do pé com uma pinça), desinfectar a pele de traqueostomia, preparação começar se o mouse está em estado de anestesia cirúrgica tolerante.
    3. Aplicar olho creme de protecção (por exemplo, dexpantenol 50 mg / g) para evitar a córnea de secar (Figura 1B).
  3. Fixar do mouse sobre a preparação mesa expondo lado ventral usando fita adesiva para as extremidades; overstretch suavemente pescoço, fixar nessa posição, por exemplo., através da utilização de uma faixa de borracha t enganchadoo incisivos.
    1. Desinfectar pele e da pele utilizando uma solução de povidona-iodo, mediante a aplicação de desinfectante com uma cotonete.
  4. Efetuar corte inicial pele (0,5-1 cm de comprimento) diretamente abaixo do queixo (Figura 1C)
    1. Dissecar cuidadosamente tecido conjuntivo entre as glândulas salivares (Figura 1D).
    2. Retire com cuidado aberta muscular tubo circundante traquéia (Figura 1E, F).
  5. Coloque fio cirúrgico debaixo da traquéia para posterior fixação do tubo de ventilação (Figura 1G).
    1. Abrir traqueia com micro-tesoura entre anéis cartilaginosos realizando uma incisão em forma de T (Figura 1H)
  6. Coloque tubo de ventilação na traquéia através da incisão (~ 0,5 centímetros). Para empurrar o tubo para a frente, pegue final caudal com pequenas pinças anatômicas e avançar gentilmente o tubo na traquéia (Figura 1-I)
  7. Fixar tubo com fio cirúrgico (por exemplo, , 5-0) com a linha colocada no Passo 2.5 dando um nó em torno de tubo no interior da traquéia; executar segunda fixação cranial do tubo na pele para evitar depositioning acidental (Figura 1J, K).
  8. Corte do selo com cola de tecidos (por exemplo, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1D).
  9. Fixar tubo na cabeça, usando fita adesiva.

3. laparotomia (15-20 min)

  1. Coloque o mouse sobre almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Shave abdômen, retire cuidadosamente o cabelo da pele. Desinfetar pele raspada e pele com a solução de iodopovidona.
  2. Realize uma pequena pele cortada abaixo do esterno utilizando uma tesoura cirúrgica (Figura 2A). Estender o corte lateralmente abaixo das costelas para ambos os lados, cauterização todos os vasos sanguíneos visíveis para evitar sangramento.
  3. Executar cuidadosamente um pequeno corte na linha alba abaixo do esterno, a abertura do peritônio (Figura 2B). Estender o corte para ambos os lados usando cauterizção para impedir o sangramento (Figura 2C, D).
  4. Coloque o mouse em agarose fase prato (Figura 2E). Inserir as pilhas de altura adequada em ambos os lados do rato (geralmente 12-14 lamelas) (Figura 2F).
  5. Coloque sensor de gatilho respiratório debaixo parte superior das costas para sincronizar o microscópio com a respiração. Ative unidade de gatilho (Figura 2G).
  6. Coloque fio cirúrgico (5-0) através do esterno para retrair costelas (Figura 2?).
  7. Cuidadosamente corte ligamento ligar fígado e diafragma (ligamento falciforme), bem como do tracto gastrointestinal e fígado usando tesouras cirúrgicas curvas. Cortar o ligamento falciforme para baixo na aorta (Figura 2J).

4. Configuração da amostra (10-15 min)

  1. Coloque o mouse sobre o lado direito, com um ângulo de 45 ° para facilitar o acesso a grande lobo hepático.
  2. Adicionar ponte encenar abaixo das costelas, que abrange o abdominalcavidade. Fabricação de uma ponte, usando uma lâmina de cobertura padrão com revestimento de fita adesiva para cobrir as bordas cortantes (Figura 2K).
  3. Coloque grande lobo hepático no palco. Deslizar cuidadosamente sonda stylus dupla bola ou uma espátula acolchoado abaixo do fígado e segure a parte superior do órgão com um cotonete molhado ou tecido molhado. Levante lobo para o slide e aplicar arrastar suave. Lobe pode ser dobrado ou enrolado. Prestar cuidados extra para só manipulação suave do fígado (Figura 2L).
  4. Coloque estacas laterais de apoio, por exemplo, pilhas de pequenas peças de cobertura (20 mm x 20 mm), com aproximadamente a mesma altura do lóbulo do fígado ao lado dela para suportar a cobertura de deslizamento.
  5. Coloque grande lamela (24 mm x 50 mm) no lóbulo do fígado. Certifique-se de que lamela é orientada mais horizontal possível (Figura 2 M).
    NOTA: A cobertura de vidro deve estar em contato com o tecido sem apertar. Verifique se há sinais visíveis de fluxo sanguíneo prejudicado (tecido branco). Se microcircmento é interrompido, adicionar um maior apoio stakes.
  6. * Coloque dois cateteres intraperitoneal independentes (Figura 2 N) para anestesia longo prazo e G-5 aplicação. Instale cateteres lateralmente na parte inferior do abdômen ao lado dos membros posteriores.
    NOTA: Os cateteres intraperitoneais podem ser auto-fabricados através da ligação 27 agulhas G com tubagem de silicone flexível (Figura 3).
  7. * Agulha Fixate com um laço de 5-0 cirúrgica na pele para evitar o deslocamento acidental.
  8. * Prenda bomba de seringa com solução anestesia I à cateterização 1, defina a taxa de fluxo de 0,2 ml / h; anexar bomba de seringa com G-5 ao cateter 2, definir taxa de fluxo de 0,1 ml / hr.

5. Rato Monitoring

  1. * Coloque eletrodos de ECG em frente e as extremidades traseiras (Figura 4A).
  2. * Conecte a tubulação de expiração para o CO 2 sensor de nível.
  3. Adicionar sensor de temperatura externo conectado a almofada de calor (Figura 4C).

6. Incorporação e fixação do tecido (5-10 min)

  1. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarose em 1X PBS. Incorporar fígado quando a temperatura é 41 ° C, utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha de 18 G (Figura 5A).
  2. Pour agarose restante em lamela e em torno do rato (Figura 5B, C). Espere até agarose está totalmente gelatinizado.
  3. Retire o excesso de agarose usando a espátula Heidemann, preparando uma grande viewfield suficiente para digitalizar o lobo hepático preparado (Figura 5D, E).

7. Criação de Imagens

  1. Transferir o mouse na câmara de microscópio climáticas.
  2. Adicionar 50-100 ml de 1x PBS (pré-aquecido a 37 ° C).
  3. Cubra amostra prato para evitar a evaporação (Figura 5F).
  4. * Diminuição isoflurano inalativa de 0,5 Vol% (v / v).
  5. * Iniciar o monitoramento de software, a gravação de ECG, freqüência cardíaca e expiratória CO 2.
  6. Comece imagem: abrir lapersianas SER, identificar campos exibição de interesse, definir limites superior e inferior para Z-stacks, e começar a tempo de gravação lapso. Reajustar Z pilhas se necessário, para corrigir-Z deriva (ex., Devido a alterações na pressão sanguínea ou a variação de temperatura, Figura (5G).
    NOTA: Após a conclusão do período de imagem, ou se a circulação ou anestesia dos animais torna-se instável, sacrificar os ratinhos por deslocamento cervical (sem despertar da anestesia).

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Resultados

Para validar nossa abordagem TPLSM intravital, nós submetido GFP / + camundongos CXCR6 a imagem TPLSM intravital. Os ratos foram quer deixados sem tratamento como controlos de linha de base ou submetido a uma única injecção intraperitoneal de tetracloreto de carbono (CCl 4) para induzir danos no fígado aguda 20.

As sequências de vídeo foram tomadas ao longo de um período de tempo de 2-5 horas, e as células foram traçadas ao longo do tempo, devido à...

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Discussão

O objetivo do nosso estudo foi desenvolver um método altamente padronizada, estável e reprodutível para a imagem latente TPLSM intravital do fígado. Imaging Intravital em geral deu informações valiosas sobre o comportamento celular sob condições reais seguintes homing e interação de diferentes populações de leucócitos em desenvolvimento, a homeostase e da doença. No entanto, a posição anatómica um pouco difícil de fígado, devido a que movimento respiratório e intestinal peristáltica são transmitido...

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Divulgações

The authors disclose no conflict of interests.

Agradecimentos

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetics
BuprenorphineEssex Pharma997.00.00Analgeticum, 0.1 mg/kg
FentanylRotex Medicacharge: 30819
Fluovac anesthesia systemHarvard Apparatus34-1030
Glucose 5%Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiserEickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotonic (0.9%) NaCl solutionDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10%cevaCharge: 36217/09
Xylazin 2%medistarCharge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml SyringeBD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flaskSchott Duran21 226 36
25 ml Beaker 2xSchott Duran50-1150
2 ml syringeBD Plastipak
4-0 Vicryl sutureEthiconV7980
Agarosecommercially available
Bepanthen Eye and Nose ointmentBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery KitFine Science Tools Inc.18010-00
Cotton Gauze swabsFuhrmann GmbH32014
Cover Slip 24x50 mmROTH1871
Durapore silk tape3M1538-1
Feather disposable scalpelFeather02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm IDSmiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525x 0.5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
Microscope SlidesROTH1879
Poly-Alcohol Haut…farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
Sterican needle 18 G x 1B. Braun304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
Tissue papercommercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PLGatz0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2Storz&KleinS-01134
Dumont No.7 forcepsFine Science Tools Inc.91197-00
Graefe forceps curved x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Graefe forceps straight x2Fine Science Tools Inc.11050-10
Heidemann spatula HD2Stoma2030.00
Needle holder MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
ScissorFine Science Tools Inc.14074-11
Semken forcepsFine Science Tools Inc.11008-13
Small surgical scissors curvedFine Science Tools Inc.14029-10
Small surgical scissors straightFine Science Tools Inc.14028-10
Standard pattern forcepsFine Science Tools Inc.11000-12
Vannas spring scissorsFine Science Tools Inc.15000-08
Equipment
ECG Trigger UnitRapid Biomedical3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide AnalyzerAD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
Multiphoton microscope Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorderAD InstrumentsPL3508
Temperature controlled heating padSygonix26857617
Temperature sensorcomercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&BoxLife Imaging Services

Referências

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