Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar andaimes electrospun nanofibras com organização gradated de fibras e explorar suas aplicações na regulação da morfologia celular / orientação. Gradientes no que diz respeito às propriedades físicas e químicas dos scaffolds nanofibras oferecer uma ampla variedade de aplicações na área biomédica.

Resumo

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introdução

Nanofibras são um utilitário popular para engenharia de tecidos, devido à sua capacidade de imitar a matriz extracelular na sua estrutura e tamanho relativo ^1. No entanto, algumas interfaces de tecido nativo, tais como o local de inserção do tendão para osso, contêm fibras de colagénio, os quais exibem uma estrutura organizacional variável que aumenta na direcção de alinhamento do tendão e diminui no local do osso ^2-5. Assim, para a regeneração de tecidos eficaz, há uma necessidade de fabricar uma estrutura de suporte que pode efectivamente mimetizar este gradiente estrutural.

Anteriormente, houve uma pesquisa conduzida em mudanças graduais na composição de fibra, mais especificamente, o teor mineral ^6. No entanto, a recriação da componente estrutural dos tecidos conjuntivos permanece largamente inexplorado. Um estudo anterior examinada gradientes morfológicas estudando o efeito da densidade de partículas de sílica de superfície sobre a proliferação de osteoblastos de calvárias de rato e encontrou um inverse relação entre a densidade de partículas de sílica e a proliferação de células ^7. Mas as mudanças morfológicas que mediaram a proliferação celular em trabalhos anteriores eram em sua maioria relacionada à rugosidade superficial falta a capacidade de imitar fibra de mudanças organizacionais ^7,8. Um estudo recente tentativa de fabricar um andaime que imitava as orientações de fibras colágenas originais usando um romance coletor para eletrofiação ^9. Embora este estudo conseguiu produzir um andaime com fibras de ambos alinhados e aleatórios, não conseguiu imitar as mudanças graduais exibidas nos tecidos nativos. Além disso, na produção de componentes separados, com uma mudança imediata da alinhado com orientação aleatória, as propriedades biomecânicas do presente andaime diminuiu significativamente. Nenhum trabalho anterior foi capaz de produzir scaffolds nanofibras aplicáveis ​​com gradações contínuas em orientações de fibra de alinhados e aleatória. Nosso estudo recente mostrou recreação sucesso de andaimes de nanofibrascom gradações de organização das fibras que podem, potencialmente, imitam a organização do colágeno nativo no tendão-de-osso de inserção ^10. Este trabalho tem como objetivo apresentar os protocolos utilizados para a produção de andaimes de nanofibras com uma estrutura que se assemelha a de organização das fibras na interface do tecido do tendão-de-osso nativo.

Estruturas de nanofibras Gradiente têm potencialmente de longo alcance aplicações em uma variedade de campos. Estamos focados em aplicações para engenharia de tecidos do local de inserção do tendão-de-osso através da combinação de nossos andaimes com células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) que já são utilizadas para a regeneração de tecidos em vários substratos ^11-14. Além disso, ADSCs são muito semelhantes na natureza para as células-tronco da medula óssea em termos de multipotency e os recursos são abundantes que podem ser colhidas usando um simples ^15,16 procedimento de lipoaspiração. Semeando destas células para andaimes nanofibras gradativas aumenta ainda mais a sua tisprocessar as aplicações de engenharia, permitindo a distribuição controlada das células que podem, potencialmente, diferenciam-se em vários tecidos. Além disso a sementeira de células estaminais, nanofibras pode ser encapsulado com moléculas de sinalização para a regulação da resposta celular. Acoplamento nanoencapsulação com o gradiente de organização destes suportes permite o estudo do comportamento celular ou possíveis modelos de implantes e os revestimentos. A encapsulação de moléculas funcionais como proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2), que tem sido mostrado induzir a diferenciação dos osteoblastos ^15,16, poderia aumentar ainda mais as aplicações de engenharia de tecidos destes suportes ^10.

Protocolo

1. Preparação da Solução

1. Prepara-se uma solução de poli (ε-caprolactona) (PCL) (M _w = 80.000 g / mol) a uma concentração aproximada de 100 mg / ml. Dissolver PCL numa mistura de diclorometano (DCM) e N, N-dimethlyformamide (DMF), a uma proporção de 4: 1 (v / v) com uma concentração de 10% (w / v).
2. Colocar a solução em um tubo de vidro de 20 ml para a mistura. Coloque tubo de vidro em limpador ultra-sônico por 30 minutos, ou até que a solução é translúcida.

2. Preparação Aparelho

1. Adicionar a solução PCL preparado em uma seringa de 5 ml com uma agulha romba de calibre 21 em anexo.
2. Coloque bomba de seringa numa posição vertical, electrospinning, de acordo com a Figura 1.
3. Use um coletor de aço inoxidável-gap com um espaço aberto de 2 cm x 5 cm para o substrato de fibra alinhada. Colocar o colector 12 cm depois da ponta da agulha.
4. Ligue a corrente contínua (DC) de alta tensão da fonte de alimentação para oagulha e aterrar o colecionador. Certifique-se de que o coletor é aterrado individualmente, sem contato com o outro equipamento de laboratório.

3. Electrospinning

1. Conjunto de bomba de seringa a 1,50 ml / hr, até que as gotículas que formam a ponta da agulha são substituídas imediatamente, removido. Em seguida, defina a taxa de fluxo de 0,50 ml / hr.
2. Vire o operador de tensão a 12 kV.
3. Electrospin até que as fibras uniaxialmente alinhados cobrir completamente a lacuna no coletor.
4. Aplicar cola nas bordas de uma pequena placa de vidro e transferir as fibras a partir do colector abertura para a placa de vidro. Colocar a placa de vidro na parte superior de um pedaço de folha de alumínio que tem o mesmo tamanho que a placa de vidro e é ligada à terra.
5. Posicionar o segundo colector de seringa de acordo com a Figura 3.
6. Fixe a máscara de plástico para a segunda bomba de seringa e posicioná-lo de 2 mm acima do coletor.
7. Adicionar Cumarina 6 a 1% (w / w) para a solução de PCL-se nanoencapsulation é desejado-e misturar até a solução estar translúcida.
8. Coloque o PCL ou PCL / Coumarin 6 solução em uma agulha 5 ml com um blunt agulha de calibre 21. Definir bomba vertical para 0,50 ml / hr e horizontal para puxar a 9 ml / h ou a uma velocidade aproximada de 1 mm / min.
9. Electrospin até que a máscara se mudou quase completamente para fora do colector, mas com a área da borda ainda sob a máscara.

4. Fiber Caracterização

1. Colocar as amostras de fita condutora dupla face ao pino metálico e revestimento com platina por 40 seg usando um revestidor por crepitação a 40 mA.
   1. Examine fibras através do microscópio eletrônico de varredura (SEM) de acordo com os nossos estudos anteriores ^17,18.
   2. Coletar imagens a uma tensão de aceleração de 15 kV.
2. Realizar análise rápida de Fourier (FFT) em uma amostra de fibra separada para medir o alinhamento de fibras. As informações detalhadas sobre o alinhamento das fibras de medição por FFT pode referir-se to estudos anteriores ^19,20.

5. As células-tronco Sementeira.

1. Esteriliza-se as amostras de fibras por imersão em uma solução de etanol a 70% durante 2 horas. Em seguida, lavar as fibras com água destilada para remover quaisquer contaminantes.
2. Obter ADSCs humanos e em células de cultura de um frasco de 25 ^cm2 a 37 ° C numa atmosfera de 95% ar / 5% de CO _2. Mudar o meio de cultura de células em dias alternados ^10.
3. Tripsinizar as células e contagem do número de células. Especificamente, remover todo o meio de cultura a partir do balão de cultura de células e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes. Em seguida, adicionar 1 m ^l de uma solução a 0,25% de tripsina-EDTA (pré-aquecido no banho de água a 37 ° C) para cobrir a monocamada de células e incuba-se o balão no incubador de cultura de células durante 2-3 minutos. Adicionar 4 ml de meio de cultura e lava-se a todas as células a partir da superfície por meio da pipetagem de toda a superfície. Th Centrifugar a suspensão de células e re-dispersae o sedimento de células em meio de cultura. Contagem de células, via hemacitómetro. Semente de cerca de 1 x 10 ⁴ células para o andaime colocado em nanofibras de 35 mm -cultura prato e incubar durante 3 a 7 dias.
4. Células mancha utilizando diacetato de fluoresceína (5 mg / mL em acetona) (FDA), em seguida, as amostras de imagem usando um microscópio de fluorescência. Especificamente, adicionar 100 ul de solução FDA para o prato de cultura e incuba-se durante 30 min. Lavar as células com PBS três vezes antes de imagem fluorescente. Analisar orientação celular por um programa de mat-lab personalizadas com base nos nossos estudos anteriores ^10.

Resultados

Usando este protocolo, um tapete de fibra com um gradiente de organização foi formada. A Figura 3 mostra as imagens SEM tomadas em vários locais no cadafalso nanofibras. Qualitativamente, pode ser determinado que não existe uma progressão das fibras alinhadas uniaxialmente a 0 mm (Figura 3A) para uma variedade de fibra casual aos 6 mm (Figura 3D). A FFT dá um valor quantitativo para o alinhamento de fibras, detalhes sobre os processos quantitativos são detalhados...

Discussão

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2