Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Resumo

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO₂ anaesthesia.

Resumo

Experiências de acoplamento usando Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão da seleção e comportamento sexual. Experimentos muitas vezes exigem métodos simples, fácil e barato para distinguir entre indivíduos em um julgamento. A técnica padrão para isso é CO ₂ anestesia e, em seguida, a rotulagem ou a asa recorte cada mosca. No entanto, este é invasivo e tem sido demonstrado que afectam o comportamento. Outras técnicas utilizadas para identificar a coloração moscas. Este artigo apresenta um método simples e não invasivo para a rotulagem Drosophila que permite que eles sejam identificados individualmente dentro de experimentos, utilizando corante alimentar. Este método é usado nos ensaios em que dois machos competem para acasalar com a fêmea. Tingimento permitiu a identificação rápida e fácil. Houve, no entanto, alguma diferença na força da coloração nas três espécies testadas. Os dados são apresentados mostrando o corante tem um menor impacto no comportamento de acasalamento de CO ₂ em Drosophila melanogaster. O impacto da anestesia CO ₂ é mostrada a depender da espécie de Drosophila, com D. pseudoobscura e D. subobscura mostrando nenhum impacto, enquanto que D. machos melanogaster tinha reduzido sucesso de acasalamento. O método do corante apresentado é aplicável a uma vasta gama de modelos experimentais.

Introdução

Ao longo das últimas décadas tem havido um interesse crescente em como a seleção sexual e competição entre machos impacto na evolução ^1,2. Experiências sobre o comportamento de acasalamento têm desempenhado um papel importante no desenvolvimento e teste de teorias da seleção sexual ^3,4. Em particular, a pesquisa com espécies do gênero Drosophila, tem contribuído grandemente para a compreensão da seleção e comportamento sexual. No entanto, é importante investigar se técnicas comumente utilizadas poderia influenciar artificialmente os resultados de experiências de acasalamento padrão ^5,6.

A anestesia é frequentemente utilizado para o manuseio e identificação em experimentos ^7. Por exemplo, as moscas são comumente coletadas antes do acasalamento, ou classificados em genótipos ou tratamentos experimentais utilizando dióxido de carbono (CO ₂₎ anestésico. Em experiências em que dois ou mais indivíduos precisam ser distinguidos, é prática comum para anestesiar a flies e clip parte da ala off para identificar cada indivíduo ou grupo de tratamento ^5,8. É fundamental, no entanto, para entender como CO ₂ tratamento irá afetar o comportamento. O efeito do CO ₂ anestesia foi examinado em Drosophila melanogaster em que os machos expostos ao CO ₂ foi significativamente mais longo para acasalar e que teve sucesso de acasalamento menor que os homens ou machos não anestesiados anestesiados utilizando a exposição ao frio ^5. Este efeito foi observado tanto quando a anestesia foi aplicado no dia da experiência e quando as moscas foram um dia para se recuperar. No entanto, este estudo foi limitado em ensaios apenas examinando em que um único macho foi apresentado para cada fêmea ^5. Um cenário mais realista é para uma mulher encontrar vários machos ^9,10, permitindo que a concorrência entre os homens, o que pode permitir a detecção de perdas mais sutis de ginástica masculina devido à anestesia. O uso de anestesia CO ₂ também seren encontrada para reduzir a fecundidade e longevidade de adultos de D. melanogaster quando eles são expostos logo após a eclosão, como é comum na recolha virgem voa ^11.

Uma alternativa para o CO ₂ anestesia é marcar moscas alimentando-os alimentos coloridos com corante ^{4,6,10,12,13.} Este corante entra no intestino da mosca e é visível através do abdómen, permitindo moscas coloridas para ser distinguido de moscas sem cor, ou a partir de moscas marcadas com uma cor diferente. Métodos diferem na forma como esta pode ser aplicada: a ser adicionado directamente à alimentação ^12, através tingido levedura complementar colar ^6, ou através de exposição a um novo substrato tingido comida ^13. Essas técnicas de marcação parecem mostrar nenhum efeito sobre o desempenho ^4,6 acasalamento. No entanto, um papel examinar directamente os efeitos do mesmo corante alimentar sobre adulto D. melanogaster encontrou uma forte redução na expectativa de vida ^14. Trabalhos anteriores também se concentrou almost inteiramente em D. melanogaster, tanto no que diz respeito aos efeitos do CO ₂ anestesia ^5,11 e corante alimentar ¹⁴ métodos. Actualmente, há pouca informação sobre a forma de CO ₂ a anestesia ou a utilização de coloração intestinal afecta o comportamento de acasalamento dos outros Drosophila.

O seguinte estudo avalia o efeito do CO ₂ anestesia sobre o comportamento de acasalamento de três espécies de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura, e D. subobscura). O efeito de coleta de moscas em CO ₂ foi examinado em ambos solteiros e dois ensaios de acasalamento dos machos. O efeito do CO ₂ também tem sido observadas variações significativas em D. melanogaster ⁵ e assim por diferentes períodos de latência entre a exposição ao CO ₂ e acasalamento foram testados. Um método de recorte anestesia e asa marcação alternativa: é também avaliada a utilização de corantes alimentares para manchar as moscas.

Protocolo

1. Preparação de Fly Alimentos com corante alimentar

1. Pegue um frasco Drosophila padrão com cerca de 20 ml de alimento no fundo (Figura 1). Use a seguinte receita para o mix de alimentos utilizando 1 L de água fervente: 10 g de ágar, 85 g de dextrose, 60 g de farinha de milho, 40 g de fermento, e mexa por 5 min de chiar. Adicionar 25 ml de 10% nipagen uma vez que a mistura tenha arrefecido a 75 ° C.
2. Após o alimento ter arrefecido e solidificado adicionar duas gotas (aproximadamente 0,5-1 ml) de corante azul para o início da comida e distribuídos por toda a superfície do frasco (Figura 1). Use um corante de cor diferente, se preferir.
3. Deixar a comida durante dois dias no frigorífico de modo a que o corante é absorvido pela camada de topo de alimentos; isso evita a umidade excessiva danificar as moscas durante o período de maturação. Adicionar um pequeno pedaço de papel de seda, se a umidade excessiva ainda é um problema para desfazer-se umidade extra e posteriormenteremova.
4. Transferência voa para a comida, individualmente ou em grupos.
   Nota: As moscas ganhará coloração intestinal dentro de 1 dia de serem colocados sobre os alimentos. Alternativamente, as moscas totalmente maduras sobre a comida tingido antes da experiência (aumento de mortalidade durante o período de maturação, não foi observada a partir de exposição ao corante alimentar).
5. Verifique se as moscas tingidos pode ser facilmente distinguidos dos moscas não-tingidos. Se eles não podem ser distinguidas, repetir os passos 1,1-1,4 usando uma maior concentração de corante, ou um corante diferente.

2. Dois ensaios de acasalamento dos machos o uso de alimentos para colorir

1. Para a produção de descendência, configurar vários frascos contendo pares de moscas fêmeas e machos (pequenos grupos de machos e fêmeas também são adequados, apesar de ter o cuidado de evitar a aglomeração de larvas). Permitir que as fêmeas põem ovos e mover as moscas para novos frascos a cada 5-7 dias. Armazenar os frascos a uma temperatura adequada para a espécie de interesse (22 ° C fou D. pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C para D. melanogaster).
2. Antes da coleta de moscas experimentais remover todas as moscas dos frascos de coleta em um horário definido, antes de recolher machos e fêmeas para garantir que eles vão ser virgens (D. melanogaster - 6 horas a 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 horas a 22 ° C, e D. subobscura - 24 h a 22 ° C).
   Nota: Se as moscas não são virgens esse viés vontade o seu comportamento em ensaios de acasalamento ^15.
   1. Loja e macho maduro individualmente no padrão de 75 x 20 mm frascos de plástico (contendo ~ 20 ml de alimento). Isso evita os impactos negativos sobre o comportamento de acasalamento dos machos e fitness visto em algumas espécies em que os machos são mantidos em grupos de ^16.
   2. Expor metade dos homens para o tratamento desejado (CO ₂ anestesia, neste caso). Use um tapete de CO ₂ ou toque para expor as moscas durante o tempo necessário. Metade da loja do males em cada tratamento em alimentos de cor até que o acasalamento ocorre. Isto irá torná-los visualmente distinguíveis durante os ensaios de acasalamento.
   3. Para a transferência de moscas usar um aspirador ^17. Rotular cada frasco para identificar tanto o tratamento e o estado de cor do sexo masculino. Aqui, use quatro tratamentos (anestesia, não colorido = G-NC, anestesia, colorido = GC, sem anestesia, não colorida, NG-NC, e sem anestesia, colorido, NG-C).
3. Transferir fêmeas recém-emergidas em frascos de alimentos frescos a amadurecer como grupos de 10.
4. Permitir moscas para amadurecer à idade de acasalamento (D. melanogaster - 3 dias, D. pseudoobscura - 5 dias, D. subobscura - 7 dias: ¹⁸ loja voa a uma temperatura adequada para a espécie a ser estudadas (por exemplo, 22 ° C para D. . pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C para D. melanogaster).
5. Mova fêmeas para frascos individuais (containing ~ 20 ml de alimento) um dia antes do julgamento de acasalamento para a aclimatação para o frasco de acasalamento. Identifique esses frascos para que os frascos podem ser diferenciados. Tenha cuidado para cegar o experimento usando rotulagem neutral (ie, 1-150) por isso não é possível adivinhar a identidade das moscas em qualquer frasco.
   Nota: A pessoa que coloca as moscas em cada frasco terá que saber a identidade das moscas colocados em cada frasco como eles vão notar que o tratamento foi manchada. No entanto, o observador que assiste o acasalamento não deve conhecer a sua identidade. Para fazer isso serão necessários pelo menos dois pesquisadores, um para configurar e uma para observar.
6. Início aos ensaios de acasalamento entre 10-12 horas, ou em um momento que coincide com a luz que vem no ciclo claro / escuro as moscas estão expostos a ("amanhecer" para as moscas). Adicione duas moscas do sexo masculino para cada frasco de acasalamento (que contém uma única mosca fêmea), utilizando um aspirador. Certifique-se de que os dois homens são de diferentes tratamentos (anestesia oucontrole) e que se tem coloração intestinal para torná-lo possível diferenciá-las umas das outras, e observe que macho é manchada.
7. Caso ocorra a cópula, gravar o status do macho que se encaixa (ou coloridas ou não - colorido). Se os testes duram 2 horas, assuma a fêmea não vai acasalar.
   Nota: 2 horas é adequado para estas espécies, mas outras Drosophila pode precisar de mais ou menos tempo.

3. único macho Trials Acasalamento

1. Para únicos ensaios masculinos, repita Protocol 2 com duas alterações:
   1. No passo 2.3 não manter machos em alimentos coloridos.
   2. No passo 2.7, adicionar apenas um único macho para cada frasco.
2. No passo 2.8, gravar o momento em que a mosca é adicionada ao frasco, o tempo de acasalamento os arranques e o tempo do acasalamento acabados devem ser gravados. A partir desses valores, calcular o sucesso de acasalamento, latência e duração.

Análise 4. Dados

1. Use pacote estatístico adequado para analise. Se os dados são normais e só tem dois tratamentos, usar t-testes ou equivalente Modelo Linear Generalizado (GLM). Por dois experimentos do sexo masculino, usar testes binomial ou uma GLM binomial que estão disponíveis em qualquer pacote de estatísticas de base.
   Nota: Para obter os dados de exemplo, todas as análises foram realizadas em R versão 3.0.3 ^19.
2. Verifique os dados de latência de acasalamento e duração de acasalamento para a normalidade, traçando histogramas de latência e duração de frequência para cada tratamento ^20, e usando um teste para a normalidade, como Shapiro-Wilk. Se não for normal, transformá-lo, ou usar as estatísticas não paramétricas equivalentes ^20.
   Nota: Para obter os dados de exemplo a partir das experiências individuais masculinos log transformação cumpridos os requisitos de normalidade e variâncias iguais.
3. Se os dados podem ser normalizada, de uso de t-testes para examinar as diferenças entre a latência de acasalamento e duração nos ensaios de acasalamento dos machos solteiros quando se usa dois tratamentos ^21. Se forem utilizados vários tratamentos,tentar uma análise de variância (ANOVA) ^20. Se os dados não podem ser normalizada, tente testes não-paramétricos equivalentes ^21.
4. Use testes binomial para testar um efeito de qualquer corante alimentar ou ₂ anestesia CO sobre o sucesso de acasalamento dos machos competem ^20. Se são utilizados vários tratamentos, como é o caso com os dados de exemplo, utilizar uma estrutura com GLM erro binomial ^21.
5. Para os dois ensaios masculinos nos dados de exemplo, use MLG com estruturas de erro binomial. Um GLM examinou a cor como uma variável de resposta (colorido = 0 e incolor = 1) com as espécies, o estado de gás e tratamento de gás instalado como explicativo variables.One GLM examinado CO ₂ como uma variável de resposta (gaseados = 0 e não-gaseados = 1) com as espécies, o estado de cor e tratamento de gás instalados. Em cada caso, o modelo de produzir máxima, e executar simplificação do modelo baseia-se AIC ^20.

Resultados

Dois ensaios de acasalamento dos machos - O efeito do CO ₂ anestesia no comportamento de acasalamento

O melhor modelo encontrado para explicar a variação do efeito do CO ₂ anestesia continha espécies como um factor (com pseudoobscura D. e D. subobscura fundido, como eles não mostraram diferenças entre si). Em D. pseudoobscura e D. subobscura não houve efeito significativo de CO ₂ anestesia no sucesso de acasalamento em dois ensaios do sexo masculino _(1.589 Z = 0,087, P = 0,931). Para D. melanogaster, os machos expostos ao CO ₂ anestesia teve significativamente menor sucesso de acasalamento (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). Houve também uma interação significativa entre espécies e de tratamento (χ ² = _1,589 6,83, P = 0,009), com um efeito maior a ser visto quando D. melanogaster foram expostos ao gás à cobrança ou 1 dia antes os ensaios (Tabela 1). However, D. machos melanogaster expostos a CO ₂ dois dias antes do ensaio experimental não mostrou um efeito de CO _2.

Dois ensaios de acasalamento dos machos - O efeito da coloração intestinal no comportamento de acasalamento

Modelo simplificação não mostrou efeito significativo de corante alimentar sendo encontrados para qualquer uma das três espécies (P> 0,1). Quando o tratamento ou estado de gás foram incluídos na análise estes foram também não significativo (P> 0,1). As proporções de acasalamentos bem sucedidos para moscas de cor em todos os tratamentos estão apresentados na Tabela 2. A diferença na coloração entre moscas mantidos em alimento colorido e incolor pode ser visto na Figura 1. A intensidade da coloração de alimentos do intestino foi maior em D. pseudoobscura e D. subobscura do que em D. melanogaster.

Ensaios de acasalamento única - o efeito do uso de CO ₂ anestesia sobre mcomportamento ating

Não houve diferença na latência de acasalamento para qualquer uma das três espécies quando o CO ₂ anestesia foi usada para recolher recentemente emergiram adultos. Um efeito foi encontrado para a duração do acasalamento em D. subobscura quando foi exposta ao CO ₂ dois dias antes de ensaios de acasalamento (Figuras 2 e 3 e Tabela 2).

Figura 1. Fotografia que mostra frascos de colorido e não colorido Fly Alimentos (A) e da Força de Intestinal Coloração em Male D. Subobscura (B).

Figura 2. A média e 95% de intervalo de confiança para a cópula Latência para as três espécies investigadas em ensaios Homem Solteiro, quando os machos eram anestesiard (barras claras) ou não anestesiados (barras escuras) quando recolhido como Virgins antes da maturidade sexual.

Figura 3. A média e 95% Intervalos de Confiança para Cópula Duração para as três espécies investigadas em ensaios Homem Solteiro, quando os machos foram anestesiados (barras claras) ou Não anestesiados (barras escuras) quando recolhido como Virgins antes da maturidade sexual.

Tratamento	Espécies	Ensaios No.	No. moscas colorido que acasalaram	p-valor	No. moscas gaseados que acasalou	p-valor
Coleção de CO 2	D. mel	73	36	1	27	0,0344
	D. PSE	79	41	0,8221	44	0,3682
	D. sub	71	40	0,3425	33	0,6353
Expostos ao CO 2 de 18 horas antes	D. mel	57	28	1	19	0,0163
	D. PSE	65	32	1	31	0,8043
	D. sub	68	38	0,3961	35	0,9036
Expostos ao CO 2 dois dias.	D. mel	56	19	0,0222	32	0,3497
	D. PSE	70	32	0,5504	33	0,7202
	D. sub	56	29	0,8939	26	0,6889

Tabela 1. Os resultados de dois experimentos Masculino escolha para todas as espécies e tratamentos examinados.

Espécies	Traço	df	t-value	p-valor
D. melanogaster	Latência	58	1.379	0,174
	Duração	58	1.243	0,221
D. pseudoobscura	Latência	109	0,419	0,676
	Duração	109	0,436	0,664
D. subobscura	Latência	83	0,098	0,922
	Duração	83	1.767	0,081

Tabela 2. Os resultados de experimentos de conjugação de solteiro examinar o efeito de Coleta em CO ₂ Anaesthesia no Acasalamento Latência e duração. Os testes foram realizados em três espécies de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura e D. subobscura).

Discussão

Estes dados mostram que o impacto da anestesia CO ₂ é inconsistente entre as espécies, com duas das três espécies com pouco impacto. Nossos resultados sugerem marcação com corante alimentar teve um impacto menor sobre o sucesso de acasalamento dos machos do que o CO ₂ anestesia para D. melanogaster. Estas experiências demonstram que os corantes alimentares podem facilmente e barato para ser usado moscas etiqueta para ensaios de acoplamento envolvendo vários machos.

Das espécies Drosophila três modelos examinados, apenas D. melanogaster mostrou um efeito de CO ₂ anestesia sobre o desempenho do acasalamento em uma situação competitiva. Em contrapartida, nenhuma das espécies mostrou um efeito da coleta do gás em ensaios de acasalamento individuais em termos de latência de acasalamento, contrariamente aos resultados anteriores para D. melanogaster ^5. O efeito da concorrência poderia, portanto, ser destacando efeitos de fitness mais sutis de anestesia CO _2, que só são detectáveisem situações em que há competição masculina por homens. Exposição a coleção no início e um dia antes de o julgamento ter um efeito negativo sobre a capacidade dos machos de D. melanogaster para obter um acasalamento. Exposição dois dias antes do julgamento, contudo, não mostrou qualquer efeito. Tanto D. pseudoobscura e D. subobscura não mostrou qualquer efeito da exposição a gás em qualquer dos ensaios. Uma explicação é que D. melanogaster era vulnerável a exposição precoce ao CO _2, porque devem ser recolhidos mais cedo na vida (0-6 hr de idade) do que as outras espécies para garantir os machos são virgem. Daí masculino D. melanogaster desta idade podem ser mais sensíveis como a cutícula da mosca ainda é o endurecimento, em comparação com as outras espécies que tiveram mais tempo para a sua cutícula para endurecer. Em geral, isso apóia a idéia de que os efeitos do CO ₂ anestesia são espécies específicas e os investigadores devem testar adequadamente o efeito em suas espécies-alvo. Currently, a maioria dos trabalhos sobre o efeito do CO ₂ anestesia foi realizada em Drosophila melanogaster ^5,11,22 e, por conseguinte, pode não ser apropriado aplicar a outras espécies relacionadas.

O método não-invasivo alternativo apresentado para diferenciar as moscas é corante alimentar. Os resultados sugerem que este tratamento não teve efeito em toda a todas as espécies examinadas. No entanto, enquanto que a sua utilização foi bem sucedida em proporcionar um marcador mais barato e facilmente visível para distinguir entre indivíduos deve notar-se que o corante foi mais fácil de distinguir em D. pseudoobscura e D. subobscura do que em D. melanogaster. Anterior autores têm usado várias cores (vermelho, verde e azul) ^4,6. Encontramos coloração azul para ser o mais fácil de distinguir em todas as espécies, em particular D. pseudoobscura e D. subobscura. Usando várias cores permitiria potencialmente experimentos mais complexos, com muitos flie marcados individualmentes. No entanto, os testes preliminares de diferentes corantes são essenciais, já que alguns corantes alimentares não conseguem colorir as moscas, possivelmente ser digerida quando consumidos. Outros corantes podem ter efeitos tóxicos e reduzir a sobrevivência das moscas, e deve ser evitado ^14). Métodos de coloração de alimentos alternativos usando manchas mais caras também têm sido utilizados para examinar a integridade intestinal para D. melanogaster ^23. Estes podem fornecer uma alternativa, embora mais caro, método de tingimento ^23.

O método de corante é tão rápido como CO ₂ recorte asa como moscas podem ser armazenados em alimentos tingidos da coleção. A absorção dos alimentos foi rápida (~ 3 horas), assim que o armazenamento O / N em alimentos de cor também seria suficiente para marcar moscas, como usado em outros estudos ^6. No entanto, a duração da coloração é relativamente curto (~ 4-5 h) em relação ao recorte de asa (permanente) ou de pó fluorescente marcação (10 - 12 dias) ^24. Como espécie Drosophilavariar em aparência, corantes diferentes serão mais ou menos eficazes para diferentes espécies, e dado que algumas estirpes (por exemplo, mutantes de knock-out) pode ser vulnerável a alterações na dieta, qualquer utilização do corante requer um teste preliminar da sua eficácia particularmente se mais exposição prolongada a corantes podem ser tóxicos ^14. Em contraste com o estudo realizado por Kalaw et al. ^14, não foi encontrada uma mortalidade significativa após o armazenamento por vários dias em alimentos coloridos para D. melanogaster (3 dias), D. pseudoobscura (5 dias), ou D. subobscura (7 dias), provavelmente devido à diferença de corante utilizado.

O passo crítico para a utilização com sucesso do corante é a etapa 1.5, validando que o corante escolhido funciona bem com as espécies e da estirpe a ser utilizada. Uma técnica alternativa envolve a aplicação de pó colorido para o exterior da mosca antes do uso em experiências de campo ^24. Este método tem sido utilizado para rastrear indivíduos no campo devido to da duração da marcação e da facilidade de massa marcação voa ^24. Embora não tenhamos explicitamente testado esse método em ensaios de acasalamento, seria importante analisar os efeitos que a poeira poderia ter sobre os sentidos importantes no acasalamento, particularmente em Drosophila ^{25, 26.} Na espécie, no entanto, onde tingimento intestinal não é possível, estes métodos podem ser apropriados.

Em conclusão, descobrimos que em duas das três espécies testadas (D. pseudoobscura e D. subobscura) não houve efeito encontrado tanto de CO ₂ anestesia ou corante alimentar na capacidade de acasalamento dos machos. Para D. melanogaster um efeito negativo de CO ₂ a anestesia foi detectado, mas a coloração de alimento não afetou o sucesso de acasalamento dessa espécie. Em geral, o método do corante proporciona um método não-invasivo, de simples e barata para a identificação de Drosophila indivíduo que é equivalente ou melhor do que os métodos que requerem anestesia de CO _2. Eleé provável que este método poderia funcionar em uma variedade de espécies.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic tubing	Fisher Scientific	TWT-200-061G	Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.
Fine mesh	Any haberdashery	-	Fine curtain mesh is suitable
1 ml pipette tips	VWR	83007-376	Various brands of pipette tips would be suitable
Plastic Vials	Sarstedt	58.49	Larger vials or bottles could also be used.
Cotton Balls	Lewis Medical Solutions	28170	The size of cotton will vary depending on the size of vials used
Blue Food colouring	Thesugarcraftcompany	-	Other dye colours and brands can have variable results.
CO2 Tank	BOC	BOC 40VK
Sharpie Markers	Steadtler	Lumocolor 313 S	Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness
Stopwatch	Salter	SL3920	Any stopwatch with a good digital display would be fine