Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

Resumo

Micropartículas verter à membrana celular (MPs) são vesículas biológicas activas que podem ser isolados e os seus efeitos patofisiológicos investigados em vários modelos. Descrevemos aqui um método para a geração de MPs derivadas de linfócitos T (LMPS) e para demonstrar o seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias respiratórias.

Resumo

O interesse nas funções biológicas de células derivadas de vesículas de membrana em comunicação célula-célula tem aumentado nos últimos anos. As micropartículas (MP) são um tal tipo de vesículas, que variam em diâmetro de 0,1 mm a 1 mm, e normalmente eliminados da membrana plasmática de células eucarióticas submetidos a activação ou a apoptose. Aqui descreve-se a geração de linfócitos T derivados de micropartículas (LMPS) a partir de células CEM T apoptóticas estimuladas com actinomicina D. LMPS são isoladas através de um processo de múltiplos passos de centrifugação diferencial e caracterizadas por citometria de fluxo. Este protocolo também apresenta um método de detecção da morte celular in situ para demonstrar o efeito pró-apoptótica de LMPS em células epiteliais brônquicas derivadas de rato primários respiratórias explantes de tecido brônquico. Os métodos aqui descritos proporcionam um procedimento reprodutível para o isolamento de quantidades abundantes de LMPS de linfócitos apoptóticos in vitro. LMPS derivadodeste modo pode ser utilizado para avaliar as características de vários modelos de doenças, e para a farmacologia e toxicologia de teste. Dado que o epitélio das vias aéreas como uma barreira física e funcional protectora entre o ambiente externo e o tecido subjacente, o uso de explantes de tecido brônquico, em vez de linhas de células epiteliais imortalizadas fornece um modelo eficaz para investigações que requerem tecido vias aéreas.

Introdução

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

Protocolo

NOTA: Masculino camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) são de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canadá.) E manipulados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão de CHU Sainte-Justine Animal Care. Rato explantes de tecido dos brônquios fornecer uma boa fonte de células epiteliais brônquicas primárias para investigar os efeitos pró-apoptóticos de LMPS em células epiteliais. Este protocolo descreve a geração in vitro de LMPS, bem como um método para detectar células apoptóticas epiteliais brônquicas em explantes de tecido tratados com LMPS. Este protocolo é composta de 3 seções.

1. LMPS produção e caracterização

NOTA: Para evitar a contaminação, garantir que todos os materiais utilizados no experimento são estéreis ou autoclavado. Execute todas as etapas na RT em uma cabine de segurança biológica em condições estéreis, salvo indicação em contrário.

1.1) Estímulo e Recolha de MPs⁹

1. Descongelar uma aliquota de 10 milhões de células T CEM em um banho de água a 37 ° C. Dilui-se em 10 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo, em um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 200 gx 5 min isento de soro. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de pré-aquecido.
2. Transferência de células para um balão de cultura de tecidos T75 (para as células em suspensão) com 15 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo e incubar durante 4 dias numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO _2.
3. Após 4 dias, transferir todo o meio de cultura e as células para um balão de cultura de tecidos T175 contendo 100 ml de meio fresco. Continuar a incubação das células durante cerca de 72 horas sob as mesmas condições até terem crescido até uma densidade de 2 milhões de células / ml.
4. Células uniformemente dividida entre quatro frascos T175 contendo cada um 150 ml de meio fresco e continuam até que as células de cultura de células foram cultivadas (aproximadamente 48 horas de incubação) a uma densidade de 2 milhões / ml.
5. Recolher as células de cada balão por centrifugação a 200 xg durante 5 min e ressuspender 300 x 10 ⁶ células para um novo frasco T175 contendo 150 ml de meio fresco, para manter a 2 milhões / ml de densidade celular.
6. Adicionar actinomicina D (dissolvido em DMSO a 2 mg / ml) ao meio, numa concentração final de 0,5 ug / ml e incubar durante 24 horas.
7. Transferir todo o meio de cultura para tubos cónicos de 50 ml e girar para baixo as células a 750 xg durante 5 min. Transferir o sobrenadante para 50 ml tubos cónicos e centrifugar a 1500 xg por 15 min para remover fragmentos de células grandes.
8. Transferir o sobrenadante para um frasco de 250 ml e ultracentrífuga a 12.000 xg durante 50 min. Desprezar o sobrenadante e recolher pellets.
9. Lavar peletes LMPS enriquecido com 40 ml de PBS estéril num tubo de 50 ml por centrifugação a 12.000 xg durante 50 min. Repita esta etapa duas vezes.
10. Recolher o último sobrenadante da lavagem; ele será usado como controlo do veículo. Suspender as pastilhas em 1 LMPSml de PBS e transferir para um microtubo de 1.5 ml estéril. Alíquotas e armazenar LMPS isoladas a -80 ° C (para evitar múltiplos ciclos de livre-descongelamento).

1.2) Caracterização de MPs via Análise FACS ⁴

1. Preparar 2 amostras de tampão de anexina, com uma e outra sem _CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, mais ou menos 5 mM de _CaCl2.
2. Filtro de tampão de FACS e anexina fluxo do fluido do invólucro através de um filtro de 0,22 um para remover as partículas.
3. Dilui-se 1 ul de LMPS em 44 ul de tampão de anexina com _CaCl2 a 5 mM para um tubo de FACS. Preparar outro tubo com 1 ml de LMPS em 44 ul de tampão de anexina sem _CaCl2 (controle negativo).
4. Adiciona-se 5 ul de annexinV-Cy5 em cada tubo e misturar bem. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Parar a reacção por diluição da mistura com 400 ul de fluido de revestimento de fluxo FACS em cada tubo.
5. Adicionam-se 10 ul (200000 pérolas), de 7 mm de contagem beasuspensão ds como padrão interno em cada tubo para se obter uma contagem absoluta.
6. Estabelecer portas do tamanho relativo (FSC-H, PMT E00, escala logarítmica) e granularidade relativa (SSC-H, PMT 325, escala logarítmica) gráfico de pontos no citômetro de fluxo utilizando partículas fluorescentes calibrado de tamanho de 1 mm (portão 1) e contando grânulos portão 7 mm (portão 2).
7. Analisar a amostra LMPS em FSC-H enredo / SSC-H usando os portões estabelecidos e FL-4 canais para anexina (PMT 765, escala logarítmica) gráfico de pontos, através da aquisição de um sinal de até 20 mil contas de contagem são alcançado em portão 2.
8. Determinar os eventos positivos de annexinV LMPS em tampão de anexina contendo CaCl ₂ e em seguida subtrair os eventos de LMPS em tampão de anexina sem _CaCl2 (controle negativo).
9. Calcula-se o número absoluto de MPs com base na seguinte equação:
   

1.3) Determinação do MP Protein Concentração (Ensaio de Bradford)

1. Prepare a 5 diluições em série de um padrão de proteína 1,25-20 ug / ml. Pipetar 800 ul de cada solução padrão e amostra para um tubo de ensaio limpo em duplicado. Adicionar 200 ul de reagente corante de Bradford a cada tubo. Misture bem, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
2. Medir a absorvância a 595 nm. Determinar a concentração de proteína de LMPS utilizando a regressão linear da curva padrão.

2. explantes tecido brônquico e Tratamento LMPS

NOTA: Preste atenção especial para o ambiente de trabalho estéril, e assepticamente preparar as soluções e médio utilizadas nos seguintes experimentos. Para preparar o meio de cura completa, adicionar 1 ml de tecido em cicatrização Médias Suplementos com Serum (descongeladas em gelo) a 100 ml Tissue Cura Médio e misture bem.

2.1) Preparação de explantes de tecidos bronquiais

1. Antes de cultura, arranhar 6 áreas de 1 cm ²cada um na extremidade da superfície de cada 100 milímetros prato de cultura de tecidos com uma lâmina de bisturi. Casaco cada riscado 100 mm de prato de cultura de tecido com 2 ml da solução de revestimento de prato de cultura, e incuba-se a placa em uma incubadora de CO ₂ humidificado O / N a 37 ° C. Vacuum aspirar a solução excedente e encher o prato com 15 ml de lavar roupa Tissue Medium.
2. Eutanásia camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) por inalação de _CO2 de acordo com protocolos aprovados pelo comitê de ética do cuidado animal.
3. Assepticamente dissecar tecido pulmonar com bisturi, Dumont super fino pinça e tesouras cirúrgicas. Remova cuidadosamente vasos do parênquima e do sangue. Coloque o tecido pulmonar em gelada Tissue lavar Médio para o transporte para o laboratório, se for o caso.
4. Além disso dissecar brônquio submerso no meio de lavagem de tecidos e separar o brônquio com um diâmetro de 1 a 2,5 mm a partir de tecidos periféricos de pulmão. Fatia tecidos bronquiais em ~ 5 milímetros anéis brônquica grossas com um bisturi.
5. Use um movimento de escavar com as estéreis forceps microdissecting curvas para pegar os fragmentos dos brônquios e colocá-los para as áreas riscadas dos pratos.
6. Remover o meio de lavagem de tecidos, e os fragmentos incubar à temperatura ambiente durante ~ 5 min para permitir que adiram aos pratos.
7. Adicionar 10 ml de meio de cura completa para cada prato e coloque-os em uma atmosfera controlada câmara incubadora modular. Lave com a câmara de mistura de gás de alta O ₂ (70% _{de O2,} 25% de _N2 e 5% de CO _2,). Coloque a câmara numa incubadora orbital de bancada e agite-o a 37 ° C. Agitar a câmara durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que a forma de fluir de forma intermitente ao longo dos fragmentos.
8. Após 24 horas de incubação, observar os explantes de tecido sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida. Selecione explantes brônquica, com completa, movimento cabelos finos e animada epitélio brônquico para tratamento LMPS subseqüente.

2.2) Tratamento LMPS

1. Prepare meio de crescimento completo como se segue: Crescimento de degelo suplementos médias com soro e de fibroblastos inibidor sobre gelo. Adicionar 1 ml de meio de crescimento os suplementos com soro e 200 ul de inibidor de fibroblastos a 100 ml de meio de crescimento; homogeneizar. Aquecer o meio de crescimento completo a 37 ° C durante 10 min antes da utilização.
2. Diluir LMPS isolados em um novo tubo eppendorf estéril com PBS para preparar um estoque LMPS a uma concentração de 800 ug / ml.
3. Adicionar 0,5 ml de Meio Completo Crescimento para cada poço de uma placa de 12 poços de cultura de tecidos.
4. Transferir os explantes brônquicas seleccionados com os fórceps microdissecting curvas do protocolo anterior (secção 2.1) a cada poço da placa de cultura de tecido.
5. Rotular a placa de cultura de forma adequada para identificar LMPS poços de tratamento e poços de controlo. Adicionar 25 ul LMPS estoque em cada tratamento bem LMPS (para uma concentração final de 40 ug / ml) e 25 ul de veículo de controlo (ver LMP s produção) aos poços de controlo.
6. Continuar a incubação num incubador modular câmara de atmosfera controlada a 37 ° C com agitação suave.
7. Após 24 horas, lavar explantes 3 vezes com PBS e avançar para a (fixação paraformaldeído a 4% [PFA]) próximo passo.

3. exame histopatológico

3.1) Prepare as seguintes soluções antes de prosseguir para as próximas etapas

1. Preparar tampão PBS 1x por mistura de NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,76 mM, KH ₂ PO _4, pH 7,4.
2. Para preparar PFA a 4%, dissolver 20 g de PFA em 400 ml de água, aquecida a 60 ° C com agitação; adicionar algumas gotas de NaOH 10 M para limpar a solução. Em seguida adicionar tampão de PBS 1x e ajustar o volume para 500 ml e o pH a 7,4. Filtrar e alíquota; armazenar a -20 ° C.
3. Prepare os seguintes reagentes de desidratação ou de reidratação; 100%, 90%, 70%, etanol a 50% e xileno.

e_step "> 3.2) Explant Fixation e Tissue Seção desparafinização

1. Colocar cada explante num tubo de microcentrífuga marcado com 1,5 ml de 4% de PFA e incubar O / N a 4 ° C. Lavar os explantes duas vezes com PBS 1x.
2. Desidratar explantes através de uma série de álcoois (etanol a 70%: 3 vezes 30 minutos cada; etanol a 90%: 2 vezes 30 minutos cada; etanol a 100%: 3 vezes cada 30 min, em seguida, o xileno: 3 vezes 20 min cada). Execute todas as etapas na RT em um exaustor.
3. Imbed explantes de tecido em parafina a 58 ° C num forno. Prepare 5 mm de espessura de tecido usando um micrótomo rotativo.
4. Float as seções em um banho de água a 56 ° C, e em seguida, montar as secções em lâminas histológicas marcados. Colocar as lâminas em cavaletes de coloração manuais e seco a 65 ° C durante 1 h. Permitir que os slides para esfriar em temperatura ambiente.
5. Mergulhe as prateleiras em 4 pratos mancha consecutivos contendo xileno por 10 min cada, para remover a parafina. Mergulhar as prateleiras em uma série de etanol para remover o xileno: 100%, depois 95%, thpt 80%, em seguida, 70%, em seguida etanol a 50% (5 minutos para cada etapa). Lavar as cremalheiras com água da torneira durante 5 minutos para remover o etanol.

3.3) Hematoxilina e Eosina (H & E) Coloração

1. Continue trabalhando com os cortes de tecidos fixos; colocar o suporte para um prato de coloração com hematoxilina de Mayer durante 15 min. Lavar o rack com água da torneira para remover Hematoxilina para 20 min.
2. Colocar em água destilada durante 30 sec.Place em etanol a 95% durante 30 seg. Coloque em Eosina Y coloração solução prato para 1 min. Desidratar através de duas mudanças de etanol a 95%, etanol a 100%, e de xileno durante 2 min cada.
3. Realize uma verificação rápida sob um microscópio para garantir que o excesso de eosina é removido. Coloque 2 a 3 gotas de Meio de Suporte (Fisher SP15-100) em cada slide, em seguida, cubra com uma tampa de vidro.

3.4) In Situ celular Detecção de morte: TUNEL Assay

1. Antes de começar, preparar a solução de trabalho de proteinase K: 20 ug / ml emTris 10 mM / HCl, pH 7,4.
2. Repita os passos 1 a 5 da secção 3.2 (fixação Explant e tecido seção desparafinização). Lavar as lâminas com deionizada H ₂ O.
3. Mergulhar as lâminas com 1x PBS durante 10 min. Escorra o excesso de PBS. Incubar as secções de tecido, durante 30 min à temperatura ambiente com uma solução de proteinase K a trabalhar. Lavar as lâminas duas vezes com PBS 1x.
4. Realize o ensaio TUNEL conforme descrito no manual de instruções do kit de detecção de morte celular. Montar usando meio de montagem, e lamela manualmente com lamelas de vidro.
5. Analisar amostras sob um microscópio de luz. Use Imagem Pro 4.5 para analisar as células em apoptose na cor marrom.

Resultados

LMPS foram caracterizados com coloração de anexina V por ¹⁰ células activadas por fluorescência (FACS) e fechado utilizando uma pm grânulos em que 97% das MPs (≤1 um) foram anexina-V-Cy5 positivo (Figura 1A e 1B). Normalmente, cerca de 2,5 mg de LMPS foram obtidos seguindo este protocolo. Explantes de tecido brônquico de ratos C57BL / 6 foram submetidos a tratamento e LMPS veículo. A análise histopatológica das secções brônquicas revelado o efeito de LMPS sobre a integridade est...

Discussão

MPs são mediadores ativos de conversas cruzadas intercelular e seu estudo é promissor em muitas áreas da ciência. ¹¹ Este estudo apresentou um protocolo detalhado para in vitro geração em larga escala de LMPS derivado de uma linha de células T por apoptose. Estas MPs expressar um grande repertório de moléculas de linfócitos e são biologicamente implicado na regulação da homeostase celular e tecidual. No entanto, LMPS derivadas de diferentes fontes podem ser biologicamente diferente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E