Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Resumo

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Resumo

Analisando as respostas fisiológicas de neurônios olfatórios (OSN) quando estimulados com ligantes específicos é fundamental para compreender a base dos comportamentos olfativos-driven e sua modulação. Estas propriedades de codificação dependem muito da interação inicial entre as moléculas de odor e do receptor olfativo (OR) expressa nas ORS. A identidade, especificidade e ligando espectro da expressa ou são críticos. A probabilidade de encontrar o ligando do ou expresso em um OSN escolhido aleatoriamente dentro do epitélio é muito baixo. Para responder a este desafio, este protocolo utiliza ratinhos geneticamente marcadas que expressam a proteína fluorescente GFP sob o controlo do promotor de RUP definidos. ORS estão localizadas no epitélio apertado e organizada que reveste a cavidade nasal, com as células vizinhas influenciar a sua maturação e função. Aqui nós descrevemos um método para isolar um epitélio olfativo intacta e gravar através de gravações de patch-clamp as propriedades de ORS expressing receptores olfativos definidos. O protocolo permite que um para caracterizar as propriedades de membrana OSN, mantendo a influência do tecido vizinho. A análise dos resultados de patch-clamp produz uma quantificação precisa de ligando / ou interações, vias de transdução e farmacologia, propriedades de codificação 'ORS e sua modulação em nível da membrana.

Introdução

Neurônios olfatórios (OSN) representam o primeiro passo de percepção olfativa. Localizado no epitélio olfativo que reveste a cavidade nasal nos roedores, eles transformam a informação química dos odores em potenciais de ação enviadas através do seu axônio para o cérebro. Para compreender melhor os mecanismos de codificação olfativas, é necessário caracterizar as propriedades de transdução de membrana e de ORS. Até recentemente, a maioria das técnicas usadas para caracterizar as propriedades de ORS de mamífero foram realizadas em dissociado ORS ^1-4. O processo de dissociação usa vários (ou seja, enzimas) processos mecânicos e químicos para libertar os ORS de seu ambiente. Estes processos induzem um baixo número de células disponíveis para as gravações. Este número baixo pode ser ainda mais crítica no caso de células GFP rotulados. Dissociação também remove as interações locais célula-a-célula entre ORS e outras células do epitélio olfactivo, que pode melhorar survival e modulação das propriedades "ORS. A fim de evitar o procedimento de dissociação, uma preparação intacta foi desenvolvido ^5.

Cada OSN expressa um receptor olfativo (OR) seleccionados a partir de uma grande família multigene ^6. Há ~ 1000 RUP expressos no epitélio olfatório principal no mouse. Devido ao grande número de, ou em animais de tipo selvagem, as possibilidades para gravar ORS que expressam o mesmo ou são muito baixos. Para superar estas limitações, os ratinhos alvo do gene estão disponíveis em todas as ORS que expressam um identificado ou estão marcados com uma proteína fluorescente ^7-9. Estes ORS marcadas foram usadas para fazer análise funcional em preparações dissociadas ^7,10,11 com os inconvenientes mencionados anteriormente. Uma preparação epitélio intacto ⁵ de camundongos geneticamente marcadas, portanto, contorna essas questões. Ele permite o monitoramento da atividade de ORS expressam RUP definidos com precisão em um ambiente tão perto no vivo possível. Além disso, gravações de patch-clamp de ORS também permitir uma análise precisa das propriedades da membrana, via de transdução de farmacologia, ligando / ou interações. Todos estes tópicos dificilmente podem ser analisadas usando gravações extracelular. Nós usamos essa técnica para monitorar as respostas dos ORS que expressam os receptores olfativos SR1 e MOR23 ^12,13. A viabilidade da técnica foi confirmada por outros grupos em MOR23 expressam ORS ^14, bem como em outras RUP neurónios que expressam ^15,16. O controlo de uma população definida de ORS pode levar à análise das suas propriedades em muitos contextos diferentes, tais como o desenvolvimento ^{14, 17} envelhecimento, odorante induzida plasticidade ^18, e o papel de variações na sequência do receptor olfactivo, em odor de codificação ^15. Este protocolo proporciona assim uma ferramenta poderosa para monitorizar as propriedades funcionais de ORS definidas ao nível da membrana.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Université de Bourgogne e foi aprovado pelo comitê de ética Université de Bourgogne.

1. Os animais

1. Use geneticamente camundongos OR-IRES-tauGFP disponíveis no Laboratório Jackson. Estes murganhos foram desenvolvidos no laboratório Dr. Peter Mombaerts ', a fim de analisar a segmentação do axónio e desenvolvimento do sistema olfactivo ^19. Por exemplo, a linha MOR23-IRES-tauGFP, o número de ações 006.643, leva o nome oficial estirpe B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; Da mesma forma, a linha SR1-IRES-tauGFP, número de estoque 6717 leva o nome oficial B6; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. Em relação à idade dos animais: para um melhor resultado do protocolo, utilizar animais entre 2 e 4 semanas de idade. Nesta faixa etária, a dissecção é mais fácil (ossos mais macios, mais firme do epitélio olfatório) e os botões dendríticas são bigger comparar com animais mais velhos.

2. Preparação de eletrodos e Soluções

1. Para as pipetas estimulantes: compra prepulled estimulando pipetas. Caso contrário, prepará-los manualmente.
   1. Usando uma chama, dobrar um milímetro seis pipetas de vidro em cerca de 1 cm da ponta. Insira estes seis pipetas além de uma linha reta 7 ^th em 1,5 centímetros de calor encolher tubulação fortalecer por um orifício.
   2. Calor encolher o tubo para manter os barris ligados juntos. Anexar um tubo de calor psiquiatra adicional para a outra extremidade dos barris. Puxe este pipeta estimulante, com um puxador de multi-barril.
   3. Adicione um pouco de cola líquida branca à volta do orifício para fortalecer as pontas dobradas. Deixe secar O / N.
2. Prepare 1 ou 2 L de solução de Ringer extracelular normal (em mM: NaCl 124, KCl 3, _MgSO4 1,3, _CaCl2 2, _NaHCO3 26, NaH ₂ PO ₄ 1,25, glicose 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Mantenha a 4 ° Caté à sua utilização.
3. Preparar a solução estoque intracelular (em mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanossulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 sacarose; pH 7,2 (KOH) e 310 mOsm. Manter a 4 ° C até à sua utilização. Bom para várias semanas.
4. Preparar a solução intracelular de gravação com nistatina extemporaneamente (no último minuto) antes de experimento.
   1. Pesar 3 mg de nistatina, adicionar 50 ul de DMSO; vortex 20 seg depois sonicar 2-3 minutos até completamente diluída.
   2. Adicionar 20 ul de solução de DMSO-de nistatina em 5 ml de solução de reserva intracelular. Vortex 20 seg, depois sonicar 3 min. Conservar esta solução a 4 ° C e proteger da luz direta, nistatina é sensível à luz. Esta solução pode ser utilizada por algumas horas. Substituir todos os dias.
   3. Uma vez que a preparação epitélio olfativo é sob o microscópio, tirar um pouco dessa solução em uma seringa de 1 ml com uma ponta amarela alongado-chama para preencher os eletrodos; proteger da luz direta. Uma vez que, à TA, a solução nistatinanão é estável; substituir a solução na seringa de 1 mL a cada hora ou mantê-lo em gelo.
5. Puxe eléctrodos de registo com um puxador de obter longo pescoço e uma pequena ponta (~ 2 mm) com uma resistência de 15-20 mohms com a solução de nistatina interno.
6. Preparar a solução odorante em 0,5 M em DMSO sob exaustor; aliquota e manter a -20 ° C até à sua utilização. Diluir odorante em solução de Ringer, até à concentração desejada. Encha a pipeta estimulante.

3. Preparação de epitélio olfatório

Nota: os ratos OR-IRES-tauGFP expressar o tauGFP sob o controlo do promotor OU. Nesses camundongos, todos os neurônios que expressam o OR de interesse são marcadas com GFP. Este protocolo é adaptado para as RUP expressos em todas as zonas. No entanto, dissecções e gravações são mais fáceis para as RUP expressas na zona dorsal.

1. Anestesiar os animais por injecção de uma mistura de cetamina e xilazina (150 mg / kg e 10 mg / kg BODy de peso, respectivamente). Decapitação pode ser realizada com uma tesoura afiada para ratos jovens ou com uma guilhotina roedor mantido adequadamente para ratos mais velhos.
   1. Usando anel tesouras de dissecção fazer uma incisão medial longitudinal através da pele dorsal. Retire a pele, puxando-o para além. Usando a tesoura, corte as mandíbulas inferiores na articulação da mandíbula. Remover os dentes frontais superiores por um corte coronal paralelo aos dentes.
   2. Faça um corte coronal da cabeça atrás dos olhos e manter apenas a parte anterior da cabeça. Mergulhá-lo em solução de Ringer gelada para a dissecação sob o âmbito de aplicação.
2. Dissecar no âmbito: no lado ventral, faça um corte longitudinal ao longo do maxilar superior / os dentes. Cortar os ossos dorsais longitudinalmente, seguindo o lado dorso-lateral da cavidade nasal. Remover a maioria dos ossos e paladar; transferir o septo e o epitélio ligado a ele em oxigenado Ringer a RT.
3. Para a dissecção final: Logo antes de iniciar a gravaçãosessão, descascar o epitélio do septo subjacente com uma pinça. Retire o epitélio com uma pinça e com dois cortes 4-5 mm de tesoura (uso microvannas tesoura) na parte anterior do septo onde a adesão é mais forte.
   1. Retire cuidadosamente o órgão vomeronasal, cortando-a ao longo da sua ligação ao epitélio dorsal do septo. Transferir o epitélio para uma câmara de registo com a camada da mucosa voltada para cima; mantê-lo liso na câmara com uma harpa.
4. Câmara de instalar sob um microscópio vertical equipado com óptica de fluorescência e uma câmera sensível. Visualize a preparação na tela do computador com alta ampliação de 40X através de um objetivo de imersão em água (abertura numérica 0,8) e uma ampliação de 2X ou 4X adicional conseguido por uma lente de aumento. Perfundir continuamente oxigenado com Ringer a RT (1-2 mL / min).

4. A gravação da sessão

1. Procurar célula fluorescente: excitar a preparação em 480nm para EGFP, que emite luz no intervalo de 530-550 nm; alvo um botão dendrítica que é fiável visível na fluorescência e sob campo claro.
2. Preencha eléctrodo com solução intracelular com nistatina; remover as bolhas batendo suavemente sobre o eletrodo.
3. Insira eletrodo no suporte do eléctrodo, aplique pressão positiva na pipeta; A resistência deve ser de 15-20 mohms.
4. Traga eletrodo perto do celular; uma vez que a resistência atinge ~ 40 mohms, libere pressão positiva e aplicar uma ligeira pressão negativa para chegar a um gigaseal.
5. Uma vez que o selo é atingido, definir o potencial de membrana a cerca de -75 mV;
6. Uma vez que a célula se abre, prosseguir com protocolos de estimulação, tratamentos farmacológicos. Para medir a resposta a uma única estimulação odorante, 200-500 ms ficha de actividade espontânea, para estimular a 500 ms e medir a resposta da célula para até 10 seg ^13. Para tratamentos farmacológicos, perfundir os agentes farmacológicos naa concentração desejada ^{de 20.}

Análise 5. Dados

1. Analisar as correntes induzidas por estimulação odorante como se segue: a amplitude máxima, o tempo de subida (tempo necessário para atingir 90% da amplitude máxima, em mseg), a corrente total (área sob a curva em Pas), a hora a 50% (tempo entre o início e o deslocamento da resposta a 50% da amplitude máxima, em mseg).
   1. Usando as correntes de pico de transdução (amplitude máxima atingida), em diferentes concentrações, desenhar e ajustar uma curva de resposta à dose utilizando a equação de Hill: Imax = I / (1 ​​+ (K _1/2 / C) ^n), em que I representa a corrente de pico , Imax a resposta máxima nas concentrações saturantes, K1 / 2 a concentração para a qual metade da resposta máxima foi alcançada, C a concentração do odorante e n o coeficiente de Hill.
2. Analisar gravações de potencial de membrana em pinça de corrente para a despolarização máxima, o total potencial provocada (área sob a curva em mVsec); registro de atividade spiking espontânea longo de 30 s para um mínimo de gravações; excitabilidade registro através picos gerado pela injeção de correntes (10/05 PA).

Resultados

O resultado deste protocolo depende da qualidade da dissecção. A dissecção passos deve ser curto (menos do que 10 a 15 min) e preciso (isto é, para evitar danos do epitélio). A figura 1 ilustra como uma preparação ideal parece em diferentes níveis de ampliação. Numa ampliação baixa sob condições de campo brilhante os diferentes tipos de células (tais como botões de células ORS, apoiando) são distinguíveis (Figura 1A). Ao mais alto nível de ampliação, norm...

Discussão

A capacidade deste protocolo para monitorar corretamente as propriedades de ORS saudáveis ​​depende muito da qualidade da preparação. Por conseguinte, os passos de dissecação são críticos. Em primeiro lugar, é fundamental prestar atenção à qualidade (pH, osmolaridade), oxigenação e temperatura (gelo-frio, mas não congelado) do meio de dissecção. Em segundo lugar, a manipulação do epitélio com ferramentas de dissecação deve ser tão limitada quanto possível, para evitar danos. Finalmente, é ess...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
vibration table with Faraday cage	TMC	63-500 SERIES	required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope	Olympus	BX51WI	upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives	Olympus	LUMPLFL40XW	at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera	Olympus	DP72	a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters	Olympus/Chroma		depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier	HEKA	EPC10 USB	monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software	HEKA	Patchmaster	controls the amplifier during the experiment
micromanipulator	Sutter	MP225	precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller	Sutter	P97	with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass	Sutter	BF120-69-10	in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber	Warner Instruments	RC-26G	a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass	WPI	TW100F-4	attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller	MDI	PMP-107-Z	by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector	Toohey Company	P/N T25-1-900 Single Channel	this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator	Narishige	YOU-1	a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings	N/A		tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump	gardner denver	300 series	a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system	N/A	N/A	gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extracellular solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extracellular solution
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	E3889	internal solution
Potassium hydroxyde	Sigma-Aldrich	P1767	internal solution
Methyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387509	intracellular solution
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	intracellular solution