Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

Resumo

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Resumo

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo para a determinação electrofisiológico da função retiniana. Através da colocação de um eléctrodo sobre a superfície da córnea, a actividade eléctrica gerada em resposta à luz pode ser medido e utilizado para avaliar a actividade das células da retina in vivo. Este manuscrito descreve o uso do ERG para medir a função visual em peixe-zebra. Zebrafish têm sido utilizada como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à facilidade de supressão do gene por oligonucleótidos morfolino e manipulação farmacológica. Em 5-10 dpf, apenas cones são funcionais na retina das larvas. Por isso, o peixe-zebra, ao contrário de outros animais, é um sistema poderoso modelo para o estudo da função visual cone in vivo. Este protocolo utiliza anestesia standard, micromanipulação e protocolos lupa estereoscópica que são comuns em laboratórios que realizam pesquisa de peixe zebra. Os métodos descritos fazer uso de eq eletrofisiologia padrãouipment e uma câmera de luz baixa para orientar o posicionamento da microeletrodos gravação sobre a córnea larval. Finalmente, é mostrado como um ERG estimulador / gravador comercialmente disponível originalmente concebido para ser utilizado com os ratos podem ser facilmente adaptados para uso com o peixe-zebra. ERG de peixe-zebra larval proporciona um excelente método de ensaio de função visual cone em animais que tenham sido modificadas por morfolino injecção de oligonucleótidos, bem como mais recentes técnicas de engenharia do genoma, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), activador de transcrição-Como efector As nucleases (TALENS), e Agrupamentos regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete (CRISPR) / Cas9, todos os quais têm aumentado consideravelmente a eficiência e eficácia do gene alvo em peixes-zebra. Além disso, tirar vantagem de a capacidade de agentes farmacológicos para penetrar larvas de peixes-zebra para avaliar os componentes moleculares que contribuem para o foto-resposta. Este protocolo descreve uma instalação que pode ser modificado e utilizado pelos investigadorescom vários objetivos experimentais.

Introdução

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo electrofisiológico que tem sido amplamente utilizado na clínica para determinar a função da retina em seres humanos. A actividade eléctrica em resposta a um estímulo de luz é medida colocando os eléctrodos de gravação sobre a superfície externa da córnea. As características do paradigma do estímulo e a resposta forma de onda de definir os neurónios da retina que contribuem para a resposta. Este método foi adaptado para utilização com um número de modelos animais, incluindo ratinhos e peixes-zebra. A resposta típica do ERG vertebrado tem quatro componentes principais: a uma onda, que é um potencial negativo córnea provêm de uma actividade celular de fotorreceptores; da onda b, um potencial positivo córnea derivado da EM células bipolares; a-d onda, um potencial positivo córnea interpretado como a actividade das células bipolares Off; e o c-ondas, que ocorre alguns segundos após a onda b e reflecte a actividade em Müller glia e a retinal epitélio pigmentar ^1-4. Referências adicionais para a compreensão da história e os princípios de análise ERG em humanos e animais modelo são o livro on-line, WebVision, da Universidade de Utah e textos como os Princípios e Práticas de Eletrofisiologia Visual Clínica ^{4, 5.}

Danio rerio (peixe-zebra) tem sido favorecido como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à sua rápida maturação e transparência, o que permite uma análise morfológica não invasivo dos sistemas de órgãos, e ensaios comportamentais e inverso telas genéticos (para revisão, ver e Fadool Dowling ^6). Larvas do peixe são altamente passíveis de manipulação genética e farmacológica, que, quando combinada com sua alta fecundidade, torná-los um modelo animal excelente para análises biológicas de alto rendimento. A maior proporção de cones para hastes no peixe-zebra larval - cerca de 1: 1 em comparação com os ratinhos (~ 3% de cones) - os tornam particularmente úteis para o estudo da função dos cones ^7-9.

Na retina de vertebrados, cones desenvolver antes de hastes ^10. Curiosamente, cones de peixe-zebra são operativas logo em 4 dpf, permitindo a análise eletrofisiológica seletiva de cones nessa fase ^{6, 11,12.} Em contraste, as respostas de ERG em hastes aparece entre 11 e 21 dpf ^13. Portanto, larvas do peixe em 4-7 dpf servir funcionalmente como uma retina all-cone. No entanto, o photopic ERG resposta nativo de 4-7 larvas dpf é dominado pela onda b. Aplicação de agentes farmacológicos, tais como a L - (+) - 2-amino-4-butírico-ácido fosfono (L-AP4), um agonista para o receptor de glutamato metabotrópico (mGluR6) expressa pela SOBRE células bipolares, bloqueia eficazmente a geração da onda b e revela o potencial isolado massa cone receptor, (a "uma onda") ^14-17.

Aqui nós descrevemos um simples e reliable método para análise do ERG usando equipamentos disponíveis comercialmente ERG concebido para utilização com ratos que foram adaptados para uso com larvas de peixes-zebra. Este sistema pode ser utilizado em larvas do peixe de diferentes origens genéticas, bem como aqueles tratados com agentes farmacológicos, para ajudar os investigadores na identificação de vias de sinalização que contribuem para a sensibilidade visual e adaptação ^de luz ^16. Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo vai orientar os pesquisadores no uso de análise ERG para responder a uma variedade de questões biológicas relacionadas à visão, e demonstrar a construção de uma configuração flexível ERG.

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Protocolo

Manutenção de animais e protocolos experimentais foram aprovados pelos cuidados e uso Comitês da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill Animais Institucional, e atender a todas as necessidades do Gabinete NIH of Laboratory Animal Welfare e da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International.
NOTA: Para obter larvas para análise ERG, publicado protocolos para criação de peixe-zebra padrão e manutenção foram empregados ^18. As larvas são obtidas através da reprodução natural e alojados sob um ciclo claro / escuro de 10 horas 14 horas de luz. Este protocolo foi optimizado para as larvas em 5-7 dias pós-fertilização (DPF), mas poderia idealmente ser realizada em peixes mais velhos com pequenas modificações para o procedimento. Aqui, use a tensão TL de tipo selvagem larvas do peixe em 5 dpf.

1. Micropipeta Produção

1. Puxe vários micropipettes usando 1,5 x 0,86 milímetros (diâmetro externo de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato polido-fogo comfilamento (temperatura de fusão, 821 ° C) e um P-97 Flaming / Brown Micropipeta extrator equipado com filamento caixa calor. Usar o programa para formar micropipetas descritos na Tabela 1.
2. Verifique cada micropipeta sob um microscópio com um governante graticule adequadas para garantir que as pontas são de 10-15 m de diâmetro e tem uma abertura de ponta suave (ou seja, sem bordas irregulares).
3. Armazenar cuidadosamente micropipetas para evitar danos ponta e exposição ao pó. As opções de armazenamento incluem placas de Petri com fita laboratório, caixas forradas com espuma, ou recipientes de armazenamento micropipeta comercialmente disponíveis.
   NOTA: Outros puxadores de micropipeta de vidro capilares e podem ser usadas, desde que o diâmetro correcta da micropipeta e uma ponta de alta qualidade seja atingido.

Pressão	Calor	Puxe	Velocidade	Tempo
500	560	-	30	200
500	450	-	30	200
500	410	55	40	200

Tabela 1: Programa para a produção de micropipetas usando um P-97 flamejante / castanho Micropipeta Puller equipado com um filamento caixa de calor são feitas usando micropipetas de 1,5 x 1,0 ^mm2 (diâmetro exterior de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato-polidas ao fogo, com filamentos. (temperatura de fusão, 821 ° C).

2. Preparação Tampão

1. Use filtrada, tampão oxigenado de Ringer peixe ¹⁹ no capilar de microeléctrodos e para saturar a esponja de álcool polivinílico (PVA), sobre o qual as larvas são colocadas para experiências. Como alternativa, use E3 meios de embrião ou de Solução Salina Equilibrada de Hank.
2. Preparar a solução de Ringer 10x peixe, tal como descrito na Tabela 2. Ajustar a pH 7,8, esterilizar e utilizando um filtro de 0,22 um e armazenar o estoque de 10x a 4 ° C.
3. Criar uma solução de trabalho no dia do experimento, diluindo a solução 10x de Ringer para 1x com água deionizada, destilada. Filtrar através de um sistema de filtro de 0,22 um. Composto oxigenado por borbulhamento com 95% _{de O2} / 5% de CO _{2 gasoso} durante 10 minutos. Cap firmemente depois de assegurar que a solução permanece oxigenado.

NaCl	1,25 M
KCl	26 mM
CaCl2	25 mM
MgCl2	10 mM
glicose	100 mM
HEPES	100 mM

jove_content "> Quadro 2: Preparação de solução 10x peixinho de Ringer.

3. Eletrorretinograma Platform

1. Realizar experiências ERG sobre uma mesa de anti-vibração no interior de uma gaiola de Faraday para melhorar a relação sinal-ruído. Anexar uma plataforma de aço sob encomenda para a mesa de anti-vibração utilizando porcas. Coloque uma plataforma móvel de plástico com um polímero uretano de absorção de choque inferior viscoelástico sobre a mesa sob a fonte de luz.
2. Posicione a câmera com um stand magnetizado, voltado para baixo, para a plataforma móvel de plástico. Posicione o micromanipulator (que vai realizar a gravação de microeletrodos) com um segundo posto magnetizado para a direita da plataforma de plástico móvel. Assegure-se que a câmara e micromanipulador não será perturbada pelo movimento de outros equipamentos e que não bloqueiam a iluminação proveniente da fonte luminosa.
3. Ligue a câmara a um monitor de vídeo e posicioná-la para ver o olho dolarva para colocar o eletrodo na posição adequada.
4. Certifique-se de que a instalação esteja devidamente aterrado com fio de cobre. Para verificar o barulho, coloque o eletrodo de referência e na ponta do microeletrodos de gravação em um prato de 35 milímetros Petri preenchido com solução de Ringer. Verifique os níveis de ruído elétrico da instalação com um osciloscópio ou um recurso embutido do aparelho ERG. Os níveis de ruído não deve ser mais do que ± 10 mV a partir da linha de base.

4. Esponja Preparação

1. Corte um retângulo pequeno de esponja de PVA seco que vai caber confortavelmente em uma placa de Petri de 35 mm. A espessura da esponja não deve ser maior do que a profundidade do prato. Use uma faca com uma lâmina de barbear limpa para o corte.
2. Realizar uma redução adicional na esponja para acomodar o eléctrodo de referência (ou um corte raso longitudinalmente na parte inferior da esponja ou uma borboleta cortado verticalmente através de uma das extremidades mais pequenas).
3. Use um marcador resistente a produtos químicospara marcar um pequeno ponto na esponja (onde a larva será colocado) que pode ser utilizado para posicionar a câmara.
4. Mergulhe a esponja PVA na solução de Ringer até à saturação. Retire e seque rapidamente sobre uma toalha de papel 2-3 vezes. Coloque a esponja em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri.
5. Posicionar a placa de Petri contendo a esponja sobre a plataforma de plástico de modo a que a marca pode ser visualizado pela câmara.

5. Preparação Eletrodo

NOTA: A configuração do peixe-zebra consiste em um eléctrodo de referência em contacto com a solução saturada de PVA a esponja de Ringer e um eléctrodo de gravação em contacto com a córnea. O eletrodo de referência é constituído por uma pelota de Ag / AgCl. O eléctrodo de registo de uma micropipeta de vidro é puxado cheio com solução de Ringer e realizada por um suporte de microeléctrodo contendo um fio de Ag.

1. Do cloreto de eletrodos, mergulhando-os em solução de hipoclorito de sódio a 6-9% (água sanitária) para 5 min (a micr gravaçãowire oelectrode) ou 15 minutos (o eletrodo de referência). Ar seco sobre um Kimwipe durante 5 min.
   1. Dependendo do estilo do corte feito no Passo 4.2, coloque o pellet Ag / AgCl do eletrodo de referência em (para o corte borboleta vertical) ou menos (para o corte raso longitudinal na parte inferior) da esponja. Fixe o cabo-eletrodo de referência para o sistema de gravação.
   2. Alternativamente, se a configuração do ERG tem limitações de espaço ou não são particularmente fortes artefatos fotovoltaicos do eletrodo Ag / AgCl, conecte o eletrodo de referência para a esponja através de uma ponte de sal agar para mover o eletrodo para fora do caminho da luz.
2. Anexar ~ 40 cm do tubo de tamanho adequado para a 5 ml de não-bloqueio Luer da seringa. Encha a seringa com solução de Ringer. Titulares microeletrodos que possuem portas de pressão são tipicamente enviados com adaptadores para acomodar tubos com diâmetros internos de 1/16 ", 3/32", 1/8 "ou 5/32".
3. Encha um 1 ml Luer não seringa fechadura comSolução de Ringer e, usando um Micro-fil, preencha cuidadosamente o suporte de microeletrodos. Evitar a formação de bolhas.
4. Fixe a seringa de 5 ml para a porta de pressão do titular do microeletrodos com tubulação e usá-lo para garantir que o titular da microeletrodos está cheio de solução de Ringer. Usando o Micro-fil e 1 ml cheia com solução de Ringer, encher o copo micropipeta a partir da ponta e assegurar que não há bolhas de ar.
5. Fixe a micropipeta de vidro para o titular da microeletrodos, tendo o cuidado de manter a linha reta fio do eletrodo. Uma vez garantido, a utilizar seringa de 5 ml para forçar cuidadosamente solução de Ringer através do microeléctrodo até que uma pequena quantidade de solução é visível na ponta. Aplicação ocasional de pressão para a seringa (não quando aplicado a córnea) vai impedir a formação de bolhas de ar, bem como oclusões devido à acumulação de pó ou sal, na ponta da micropipeta.
   1. Se a solução sai como uma corrente, substituir o gmicropipeta moça, como a abertura da ponta é muito grande ou está danificado.
6. Com cuidado, coloque o microeletrodos de gravação no micromanipulator e anexar a liderança para o sistema de gravação.

6. Análise Eletroretinograma

NOTA: Devido ao predomínio cone da retina larval, os resultados do ERG de alta qualidade pode ser obtido quando os preparativos para a gravação são realizadas sob baixos níveis de luz branca indireta (<1 lux) ou com curtos períodos de tempo (<1 min) de maior intensidade ( ≤250 lux) luz de trabalho. Um curto período de adaptação ao escuro ainda é necessária antes da gravação (veja o passo 6.7). No entanto, experimentos podem ser realizados sob luz vermelha ou infravermelha dim usando uma câmera infravermelha de minúsculas. Todos os experimentos foram realizados em esterilizada por filtração (0,22 mm) de água do sistema do Mecanismo UNC Zebrafish aquicultura mas a mídia embrião alternativos podem ser utilizados.

1. Corte quadrados de papel toalha medindo aproximadamente 1cm ^2.
2. Se a medição potencial de receptor isolado massa cone, incubar 3-5 larvas em água do sistema com 500 uM (±) -2-4-Amino-phosphonobutyric ácido (APB) durante 5 min.
   NOTA: Enquanto APB é uma mistura racémica do composto activo (G) e inactivos formas de AP4 (R), é tão eficaz como a L-AP4 e é menos dispendiosa.
3. Anestesiar 3-5 larvas em água sistema com 0,02% (w / v) tricaina até sem resposta, cerca de 1-2 min.
4. Use uma bomba de pipeta e pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente larvas indivíduo para quadrados de papel toalha sob um estereoscópio dissecando com uma iluminação mínima (≤250 lux para <1 min). Verifique a posição de cada larva e escolher um candidato que é lateral-se dorsal com um olho não obstruído.
   1. Para gravações prolongados (> 30 min), manter a larva úmida por vidros do corpo até, mas não incluindo a cabeça com 3% de metilcelulose usando um pincel fino de pêlo de camelo.
5. Utilizando uma pinça, transferir o squar toalha de papele com a larva à esponja úmida PVA.
   1. Para as gravações prolongados (> 30 min), aplicar um fluxo contínuo de água saturado de 100% _{de O2} do gás através da larva, fazendo borbulhar o gás através de um difusor em um frasco de braço lateral contendo água destilada. Posicione o tubo que sai do lado do braço balão que transmite o oxigênio umidificado perto da cabeça do larva.
      NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo irá prolongar a vida do peixe ^16.
6. De acordo com um mínimo de iluminação, use o micromanipulator e câmera para posicionar a ponta de microeletrodos no ponto médio entre o nasal e extremidades caudais do olho e pressione suavemente sobre o limite dorsal da córnea.
   NOTA: Extravio da ponta do eletrodo para as áreas muito distantes da córnea pode resultar em formas de onda ERG de polaridade invertida.
7. Permitir larva para dark-se adaptar para 5-10 min.
8. Registrar as respostas flash de teste a luz fornecida a partir de uma fonte de luz LED ou estimulador ótico usando o avaiestimulação e gravação de equipamentos lable. Ajuste os parâmetros do protocolo, como a intensidade do flash, comprimento flash, cor flash, intensidade de fundo e configurações de cores e filtros para atender o experimento.
9. Quando terminar com o experimento, a eutanásia larvas de acordo com as diretrizes AVMA / IACUC.

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Resultados

Normalmente, ERGs são registrados a partir de larvas do peixe em 5 dpf, uma vez que uma série de estudos publicados gravações ERG, nesta fase, ^{9, 16,20.} Respostas larval foram medidos em condições de adaptação ao escuro, sem iluminação de fundo usando a 20 ms estímulo de luz LED branco. Utilizamos um sistema ERG comercialmente disponível consiste em um estimulador luz Ganzfeld e computador controller / gravador. O estimulador utiliza um sistema de modulação de largura de pulso rigidamente contro...

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Discussão

Neste protocolo um procedimento simples para gravações ERG de peixe-zebra larval é detalhado. Este procedimento permite uma análise rápida e abrangente de function.There visual são vários passos críticos em todo o procedimento que deve ser mantido em mente. O larvas do peixe deve ser saudável antes do experimento para impedir a morte durante os tratamentos potenciais da droga e garantir meios de subsistência prolongada durante as gravações do ERG. Além disso, é importante que as larvas utilizadas nas exper...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Faraday cage	80/20 Inc	custom	Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge	Amazon	B000ZOWG1C	Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems	Corning	431154	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2	Diagnosys, LLC	contact	Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome	Diagnosys, LLC	contact	Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator	Drummond	3-000-024-R	Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand	Drummond	3-000-025-MB	Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions	Grass Technologies	F-LX	Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor	Grass Technologies	DF-215/10	Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline	Lowes or Home Depot	various	For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters	Millipore	SCGP00525	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor	Monoprice	4127	Connecting camera to BNC cable
BNC cable	Monoprice	626	Connecting camera to video adaptor
Camera lens	Navitar	1582232	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler	Navitar	1501149	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter	Sewell	SW-29297-PRO	BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB	Sigma	A1910	mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass	Sutter	BF-150-86-10	Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)
P97 Flaming/Brown puller	Sutter	P97	For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet	Thorlabs	SB12A	Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard	Thorlabs	B2436F	Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts	Thorlabs	PWA074	Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh	TWP	022X022C0150W36T	To line Faraday Cage
Pipette pump	VWR	53502-233	Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes	VWR	14672-608	Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera	Watec	WAT-902B	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222)	Western Chemical	Tricaine-S	Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil	WPI	MF28G-5	Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder	WPI	MEH2SW15	Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode	WPI	DRIREF-5SH	Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative)	WPI	EP1	Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder	WPI	13620	Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard