O uso de alta resolução Termografia Infravermelha (Hrit) para o Estudo da Ice Ice nucleação e propagação de plantas

Resumo

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Resumo

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

Introdução

Congelamento temperaturas que ocorrem quando as plantas estão em crescimento activo pode ser letal, particularmente se a planta tem tolerância ao congelamento pouca ou nenhuma. Tais eventos geada muitas vezes têm efeitos devastadores sobre a produção agrícola e também podem desempenhar um papel importante na formação da estrutura da comunidade em populações naturais de plantas, especialmente em alpino, ecossistemas sub-árcticas e árcticas ^1-6. Os episódios de geadas da Primavera graves tiveram grandes impactos sobre a produção de frutos nos EUA e América do Sul nos últimos anos ^7-9 e foram exacerbadas pelo início precoce de tempo quente seguido por mais típicas baixas temperaturas médias. O clima quente no início induz botões para se abrirem, ativando o crescimento de novos brotos, folhas e flores todos os que têm muito pouca ou nenhuma tolerância geada ^1,3,10-12. Tais padrões climáticos erráticos foram relatados para ser um reflexo direto das mudanças climáticas em curso e espera-se que seja um padrão de tempo comum para as foresfuturo eeable ^13. Os esforços para proporcionar técnicas de gestão econômica, eficazes e respeitadores do ambiente ou agrotóxicos que podem fornecer tolerância a geadas aumento tiveram sucesso limitado por uma série de razões, mas isso pode ser atribuído em parte à natureza complexa do congelamento tolerância e mecanismos de prevenção de congelamento nas plantas. ¹⁴

Os mecanismos adaptativos associados com a sobrevivência geada em plantas têm sido tradicionalmente divididos em duas categorias, a tolerância ao congelamento e evitar o congelamento. A categoria anterior está associada com mecanismos bioquímicos regulados por um conjunto específico de genes que permitem que as plantas para tolerar as tensões associadas com a presença e o efeito desidratante de gelo nos seus tecidos. Enquanto a última categoria é normalmente, mas não exclusivamente, associado a aspectos estruturais de uma planta que determinam se, quando e onde as formas de gelo em uma planta ^14. Apesar da prevalência de evitar congelamento como um anúnciomecanismo aptive, pouca pesquisa tem sido dedicada nos últimos tempos para a compreensão dos mecanismos subjacentes e regulação de evitar congelamento. O leitor é remetido para uma revisão recente ¹⁵ para maiores detalhes sobre este assunto.

Enquanto a formação de gelo a baixas temperaturas pode parecer um processo simples, muitos factores que contribuem para a determinação da temperatura à qual o gelo nucleia em tecidos de plantas e como se propaga dentro da planta. Parâmetros como a presença de extrínseco e intrínseco nucleadores de gelo, contra eventos nucleação homogênea heterogêneos, térmico-histerese (anticongelante) proteínas, a presença de açúcares específicos e outras osmolytes, e uma série de aspectos estruturais da planta pode desempenhar um importante papel no processo de congelação em plantas. Colectivamente, estes parâmetros influenciam a temperatura à qual uma planta congela, onde o gelo é iniciada e como ele cresce. Eles podem também afectar a morfologia dos cristais de gelo resultantes.Vários métodos têm sido utilizados para estudar o processo de congelação em plantas sob condições de laboratório, incluindo espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) ^16, ressonância magnética (MRI) ^17, crio-microscopia ^18-19, e microscopia eletrônica de varredura de baixa temperatura (LTSEM ). ²⁰ Congelamento de plantas inteiras em ambientes de laboratório e campo, no entanto, tem sido principalmente monitorizadas com termopares. A utilização de termopares para estudar congelamento baseia-se na libertação de calor (entalpia de fusão), quando a água passa por uma transição de fase do estado líquido para um sólido. A congelação é então gravada como um evento exotérmico. ^21-23 Mesmo que os termopares são o método típico de escolha no estudo de congelação em plantas, a sua utilização tem muitas limitações que limitam a quantidade de informação obtida durante a ocorrência da congelação. Por exemplo, com termopares é difícil quase impossível de determinar onde o gelo é iniciado em plantas, como se propaga,se propaga a uma taxa ainda, e se alguns tecidos permanecem livres de gelo.

Avanços em termografia infravermelha de alta resolução (Hrit) ^24-27, no entanto, têm aumentado significativamente a capacidade de obter informações sobre o processo de congelação em plantas inteiras, especialmente quando usado em um modo diferencial de imagem. ^28-33 No presente relatório, descrevem a utilização desta tecnologia para o estudo de vários aspectos do processo de congelação e vários parâmetros que afectam onde e gelo e em que a temperatura é iniciada em plantas. Um protocolo irá ser apresentada que vai demonstrar a capacidade da bactéria-nucleação de gelo-activo (INA), Pseudomonas syringae (Cit-7), para actuar como um nucleador extrínseca iniciar a congelação em uma planta herbácea a, uma temperatura abaixo de zero elevado.

De alta resolução Infrared Camera

O protocolo e exemplos documentados neste relatório utilizar uma alta resolução infravermelhoradiómetro de vídeo. O radiómetro (Figura 1) fornece uma combinação de imagens de espectro visível e infravermelho e dados de temperatura. A resposta espectral da câmera é na faixa de 7,5 a 13,5 mm e fornece 640 x 480 pixels de resolução. Espectro visível imagens geradas pelo construído em câmara pode ser fundido com IR-imagens em tempo real, o que facilita a interpretação de imagens complexas, térmicas. A gama de lentes para a câmera pode ser usada para fazer close-up e observações microscópicas. A câmera pode ser usada em modo stand-alone, ou interface e controlada com um laptop usando software proprietária. O software pode ser utilizado para se obter uma variedade de dados térmicos incorporados nos vídeos gravados. É importante notar que uma grande variedade de radiómetros infravermelhos estão disponíveis comercialmente. Portanto, é essencial que o pesquisador discutir a sua aplicação pretendida com um engenheiro de produto experiente e que o investigador testar a capacidade de qualquer específic radiômetro para fornecer as informações necessárias. O radiômetro de imagem usados ​​no protocolo descrito é colocado em uma caixa de acrílico (Figura 2) isoladas com isopor i n fim de dissuadir a exposição a condensação durante os protocolos de aquecimento e esfriamento. Essa proteção não é necessária para todas as câmeras ou aplicações.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Preparação de materiais de plantas

1. Utilize qualquer folhas ou plantas inteiras de material sujeito planta (Hosta spp. Ou Phaseolus vulgaris).

2. Preparação de soluções aquosas contendo Ice nucleação ativos (INA) Bactérias

1. Culturas da bactéria INA, Pseudomonas syringae (Estirpe Cit-7) em placas de Petri a 25 ° C em agar Pseudomonas F preparada com 10 g / L de glicerol a 100% por direcção do fabricante.
2. Após culturas cresceram suficientemente, lugar a 4 ° C até ser necessário, mas manter a 4 ° C durante dois dias antes de garantir um elevado nível de actividade de nucleação de gelo.
3. Raspe bactérias de uma única placa a partir da superfície do agar com um plástico, descartáveis ​​ou reutilizáveis ​​espátula de metal no momento da utilização e em lugar de 10-15 ml de água desionizada numa cuvete descartável de 25 ml. A concentração deve estar no intervalo de 1 x ^07-1 outubro x 10 ^{9 ·} Ml ^-1. A solução aparece nublado. Não há necessidade de se confirmar a concentração, utilizando um hemocitómetro ou um espectrofotómetro, tal como concentração precisa ser apenas aproximados.
4. Vortex a cuvete para um mínimo de 10 segundos para distribuir as bactérias.
   Nota: A concentração específica da mistura INA resultante não é importante e o protocolo descrito irá fornecer mais do que um nível adequado de actividade de nucleação de gelo. Esta mistura de bactérias INA e água será usada mais tarde nos experimentos de nucleação.

3. configuração de uma experiência de congelação

1. Coloque a câmara de infravermelhos de alta resolução (SC-660) no interior da caixa de protecção de acrílico de modo a que os projectos de lente através de uma abertura na parte da frente da caixa e os fios de ligação da câmara a uma saída do dispositivo portátil ou gravação através da abertura traseira da caixa . Fixe a tampa da caixa e coloque a caixa de dentro da câmara ambiental ou freezer em um local que vai tudoow o material sujeito planta a ser visto.
   1. Fornecer um fundo escuro em torno do material vegetal, forrando as paredes da câmara com papel de construção preto para impedir a interferência de energia infravermelha refletida.
   2. Montar a câmara com iluminação LED para minimizar o aquecimento da fonte de luz quando gravar imagens em comprimentos de onda visíveis é necessária. Apenas um mínimo de iluminação, tal como um armário de luz operado por bateria ou outro dispositivo de LED pequeno, é necessário para as plantas a ser visível pela câmara.
      1. Uma vez que as imagens visíveis do material sujeito planta são tomadas, desligue a iluminação LED. Distribua todas as conexões externas com fio (conexão firewire de computador, cabo de alimentação, etc.) para a câmera através de uma porta ou outra abertura na câmara.
   3. Preencha qualquer espaço extra na porta ou abertura com material isolante de espuma para evitar ou reduzir os gradientes de temperatura dentro da câmara. Ajustar a temperatura inicial da câmara a 1 ° C.
2. Alinhe plantas ou partes de plantas para que o material vegetal é no campo de visão da câmera-e o material vegetal é visível na tela de visualização remota ou dentro do software escolhido.
3. Permitir que as plantas atinjam a 1 ° C durante 30 min a 1 hora, dependendo do tamanho do material de planta, antes de iniciar uma experiência de congelação controlada. Isto garante que a temperatura da planta não vai ficar para trás da temperatura do ar por diversos graus uma vez que o experimento de congelação é iniciada. A equilibração é conseguida quando a temperatura do material vegetal é a menos de 0,5 ° C de temperatura do ar.
   1. Coloque uma camada de isolamento de isopor no topo do solo de vasos de plantas se as plantas em vaso são utilizados. Uma vez que as plantas têm equilibrada, iniciar o arrefecimento da câmara.
      Nota: A camada de isolamento sobre a superfície do solo do vaso reduz a quantidade de perda de calor continuou a partir do vaso ao ar que envolve a planta, e impede que as raízes de freezing, dado que isto não ocorrem tipicamente durante um evento de geada na natureza devido ao enorme reservatório de calor residual presente no solo.
4. Defina os parâmetros da câmera desejados (paleta de cor, faixa de temperatura, áreas específicas de interesse, etc.), como discutido na 3.4.1-3.4.4.
   1. Selecione a paleta de arco-íris para exibir as variações de temperatura enquanto visualiza a imagem ao vivo.
   2. Definir a amplitude de temperatura de 5 ° C por ajustamento da barra de temperatura localizado logo abaixo da imagem no software.
   3. Escolha a escala linear (algoritmo), para converter os dados de infravermelhos para a imagem de cor falsa, tal como definido pela paleta seleccionados (arco-íris) e definir o intervalo de temperatura de 5 ° C e para controlar automaticamente com base na imagem. Alternativamente, ajustar o intervalo definido manualmente durante a realização do experimento.
      1. Utilizar a temperatura de um ponto específico ou uma temperatura média dentro da área definida de interesse fornecida pelo softwsão. Recuperar os dados de temperatura de todos os pixels da sequência de vídeo gravado ou da informação embutido no arquivo de imagem. Figura 3 mostra uma tela típica de dentro de software ResearchIR.
   4. Posicionar um cursor num local dentro do tecido da planta que representa um ponto específico de interesse. Definir a área de interesse como pontos (1 -3 pixels de tamanho), caixas, linhas, círculos ou elipses. Várias combinações de pontos ou formas pode ser localizada sobre a imagem.
5. Gravação de uma seqüência de vídeo
   1. Ajuste a câmera para gravar a 60 Hz e para a gravação de ser parado manualmente.
   2. Indicar o local no computador ou disco rígido externo onde o ficheiro de vídeo gravado será colocado.
   3. Iniciar a gravação.
      Nota: A gravação de um disco rígido externo é altamente recomendável uma vez que grandes arquivos de vídeo serão gerados. Arquivos de vídeo gravados podem ser mais tarde editada para conter somente a parte que contém o neinformações neces-. Isto irá reduzir significativamente o tamanho do arquivo.
   4. Diminuir a temperatura da câmara de incrementos de 0,5 -1,0 ° C. Espere até que a temperatura da planta equilibra com a temperatura do ar e, em seguida, baixar a temperatura novamente por 0,5-1,0 ° C. Dependendo da massa de tecido da planta a ser observada e a sua morfologia, de equilíbrio pode levar de 10 a 15 min. Assim, dando uma velocidade de arrefecimento de cerca de 4 ° C / h.
   5. Continuar dessa maneira até que a planta congela e observações estão concluídas. Terminar a gravação quando o processo de congelação foi concluída.
      Nota: O tecido da planta se ter equilibrado com a temperatura do ar quando o material de planta e de fundo são da mesma cor, uma vez que estão à mesma temperatura. Uma vez que a temperatura de fundo e a temperatura do tecido da planta são os mesmos, pode ser difícil de visualizar o material vegetal até a temperatura diminuir de novo e não há diferencial de temperatura entre o tecido da planta e umatemperatura IR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Ice-atividade de nucleação do gelo + bactéria, Pseudomonas syringae (estirpe Cit-7)

Uma gota de 10 ul de água e 10 ml de água contendo P. syringae (Cit-7) foram colocados sobre a superfície abaxial de uma folha Hosta (Hosta spp.) (Figura 4). Tal como ilustrado, a gota de água contendo as bactérias INA congelou primeiro e era responsável por induzir a folha para congelar enquanto a gota de água sobre a superfície da folha permaneceu desco...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

A água tem a capacidade de supercool a temperaturas bem abaixo de 0 ° C e a temperatura a que a água irá congelar podem ser bastante variável. ³⁶ A temperatura limite para a super-ref rigeração de água pura é de cerca de -40 ° C e é definido como o ponto de nucleação homogénea. Quando a água congela a temperaturas mais altas do que -40 ° C que é provocada pela presença de heterogénea nucleadores que permitem pequenas embriões de gelo para formar o qual, em seguida, servir como um catalisad...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1