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Resumo

Este protocolo detalha um método para isolar vesículas extracelulares (SVE), pequenas partículas membranoso liberados a partir de células, a partir de tão pouco como 10 amostras de soro ul. Esta abordagem evita a necessidade de ultracentrifugação, exige apenas alguns minutos de tempo de ensaio, e permite o isolamento de VE a partir de amostras de volumes limitados.

Resumo

Vesículas extracelulares (SVE), partículas membranoso liberados a partir de vários tipos de células, realizar um grande potencial para aplicações clínicas. Eles contêm ácido nucleico e proteína de carga e são cada vez mais reconhecido como um meio de comunicação intercelular utilizado por ambos eucariota e células procarióticas. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho, os protocolos para o isolamento de veículos eléctricos são muitas vezes moroso, complicado e requer grandes volumes de amostra e equipamento caro, tal como uma ultracentrífuga. Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos uma plataforma de imunoafinidade baseado em papel para separar subgrupos de EVs que é fácil, eficiente e requer volumes de amostra tão baixas como 10 jul. As amostras biológicas podem ser pipetados directamente para zonas de teste de papel que tenham sido quimicamente modificados com moléculas de captura que têm uma afinidade elevada para marcadores de superfície específicos EV. Immunosorben ligado a enzima Nós validar o ensaio por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), com base em papelensaios t (P-ELISA), e análise de transcriptoma. Estes dispositivos baseados em papel permitirá o estudo de EVs na clínica e no ambiente de pesquisa para ajudar a avançar a nossa compreensão das funções EV na saúde e na doença.

Introdução

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

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Protocolo

Um diagrama geral do procedimento de operação é fornecida na Figura 1. Usando as práticas éticas, foram coletadas amostras de sangue de indivíduos saudáveis, e obteve amostras de humor aquoso de pacientes através do Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sob IRB aprovou protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. fabricação de dispositivos de papel

  1. Cortar papel de cromatografia em círculos de 5 mm de diâmetro para fornecer o mesmo layout como uma microplaca de 96 poços. Sanduíche estas peças de papel com duas folhas de poliestireno com registada furos de passagem, e laminado.
  2. Modificar dispositivos de papel, utilizando o método de conjugação química descrita nas etapas seguintes 28.
    1. Tratar de papel com dispositivos de plasma de oxigénio (100 mW, 1% de oxigénio, 30 seg) em uma câmara de plasma.
      ATENÇÃO: cuidado especial deve ser tomado quando se trabalha com trimetoxissilano 3-mercaptopropil e N -γ-maleimidobutiriloxi suecinimidaéster (GMBS), uma vez que ambos são sensíveis à humidade e tóxico. Usar luvas de protecção e evitar a inalação ou contato com a pele e os olhos. Mantenha o frasco bem fechado estoque e permitir que atinjam a temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação de água. Como alternativa, abra a garrafa de dentro de um saco de luva cheia de azoto ou caixa. Alíquota em pequenos frascos para evitar a abertura freqüente da garrafa estoque.
    2. Imediatamente incubar tratada dispositivos de papel em um (v / v) solução de 4% de 3-mercaptopropil trimetoxi silano, em etanol (200 proof) durante 30 min.
    3. Lavar dispositivos de papel com etanol e incubar com 0,01 umol / ml GMBS em etanol durante 15 min.
    4. Lavar com etanol (200 proof) e incubar dispositivos de papel com 10 ug / ml de avidina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 hora a 4 ° C. Armazenar a 4 ° C, se necessário, e usar dentro de 4 semanas.
  3. Molhar cada zona de ensaio de papel com 10 ul de PBS contendo 1% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) Por 3 × 10 min antes de manchar 10 jul biotinilado moléculas de captura por 3 × 10 min. Utilizam anti-CD63 anticorpo (20 ug / ml em PBS contendo 1% (w / v) de BSA e 0,09% (w / v) de azida de sódio) ou anexina V (1:20, v / v em tampão de ligação da anexina V) como moléculas de captura.
  4. Enxaguar anticorpo ou anexina V moléculas anti-CD63 não ligados utilizando 10 ul correspondente PBS contendo 1% (w / v) de BSA ou anexina V soluções tampão de ligação para 3 x 1 min, respectivamente.

2. Serum e Aqueous Humor Coleta e Processamento

  1. Recolha de soro.
    1. Colete 10 ml de sangue periférico por punção venosa em tubos de separação de soro e inverter cuidadosamente o tubo de cinco vezes. Defina o tubo na posição vertical e aguarde 30 min.
    2. Centrifugar a 1.200 x g durante 15 min. Transferir o soro a partir da camada superior para um tubo limpo, e centrifuga-se novamente a 3000 × g durante 30 min.
    3. Passe o sobrenadante com um fil 0,8 mmter. Manter a amostra a -80 ° C até à sua utilização.
  2. Coleção humor aquoso: coletar amostras de humor aquoso de pacientes diagnosticados por um oftalmologista diretamente através de procedimentos e armazenar amostras invasiva a -80 ° C até o uso.

3. Isolamento de Extracelular Vesículas

  1. Amostras pontuais em cada zona de teste de papel a uma taxa de 5 mL / min.
  2. Enxaguar os VE não ligados com 10 ul correspondentes PBS contendo 1% (w / v) BSA a ligação de anexina V ou soluções tampão para 3 x 1 min para dispositivos papel funcionalizados com anti-CD63 ou anticorpos anexina V moléculas, respectivamente. Execute as seguintes ensaios a jusante.

4. jusante Ensaio Exemplo 1: eletromicrografias de digitalização

  1. Corrigir EVs capturadas em funcionalizado zona de teste de papel utilizando 10 mL de 0,5 × fixador de Karnovsky para 10 min.
  2. Lavar as amostras com amplo PBS por 2 × 5 min.
  3. Desidratar oamostras com subsequente etanol 35% durante 10 min, de etanol a 50% durante 2 x 10 min, etanol a 70% durante 2 x 10 min, etanol a 95% durante 2 × 10 minutos, e 100% de etanol durante 4 x 10 min.
  4. Critical seco e por pulverização catódica revestir as amostras com paládio / ouro, e examinar utilizando um microscópio eletrônico de varredura operado em baixa tensão de aceleração de elétrons (~ 5 kV).

5. Downstream Ensaio Exemplo 2: ELISA baseado no Livro

  1. Adicionar uma solução contendo 5 uL de anti-CD9 anticorpo primário a 1: 1000 em PBS a cada zona de ensaio contendo VE capturados. Espere 1 min.
  2. Lavar as amostras com 30 ml de PBS foram agitados a 100 rpm durante 30 segundos.
  3. Adicionar 5 uL de uma solução contendo peroxidase de rábano (HRP) -ligada anticorpo secundário em 1: 1000 em PBS e esperar 1 min.
  4. Lavar as amostras com 30 ml de PBS foram agitados a 100 rpm durante 30 segundos.
  5. Adicionar um substrato colorimétrico 5 ul contendo 1: 1 razão em volume de peróxido de hidrogénio umad 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e digitalizar utilizando um scanner de mesa.

6. Ensaio jusante Exemplo 3: Isolamento de ARN

  1. Mergulhar as amostras em 35 uL de auxílio de isolamento de ARN baseada em polivinilpirrolidona e 265 ul de lise / tampão de ligação para lisar os VE capturados. Vortex vigorosamente.
  2. Adicionar 30 ul de homogenato fornecido no kit de isolamento ao lisado. Vortex vigorosamente e colocar em gelo durante 10 min.
  3. Extrai-se o ARN utilizando a separação do ácido fenol-clorofórmio descrito nas etapas seguintes.
    1. Tome 330 ul de fenol-clorofórmio a partir da camada do fundo do frasco e adiciona-se ao homogeneizado / lisado. Vortex vigorosamente.
    2. Centrifuga-se a 10000 xg durante 5 min. Transferir a fase aquosa (superior) para um tubo limpo e anotar o volume removido.
  4. Precipitar o ARN total com etanol a 100% do volume que é 1,25 vezes o volume da fase aquosa removida na etapa anterior e collect o ARN na solução de eluição pré-aquecido a 95 ° C.
  5. Concentrar e purificar o ARN utilizando um kit de limpeza de ARN de acordo com o protocolo do fabricante.

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Resultados

A capacidade do dispositivo de papel para isolar subconjuntos de veículos eléctricos assenta de forma eficiente mediante o reconhecimento sensível e específico de marcadores de superfície EV. A modificação das fibras de papel estável com moléculas de captura é conseguido usando a química da avidina-biotina, conforme descrito noutro local 28-30. A eficácia de conjugação química e que o método de fisiossorção é avaliada utilizando leituras baseados em fluorescência. As zonas de teste de pape...

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Discussão

Os passos mais críticos para o isolamento bem sucedido de subgrupos de vesículas extracelulares são: 1) uma boa escolha de papel; 2) uma cobertura estável e elevada de moléculas de captura na superfície das fibras de papel; 3) manuseio adequado de amostras; e 4) práticas de higiene geral de laboratório.

Os materiais porosos têm sido utilizados em muitos ensaios de baixo custo e sem equipamento. Eles podem ter o tamanho de poro sintonizável, funcionalidade versátil, baixo custo e a...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte pelo Conselho Nacional de Ciência Taiwan grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) e NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), e do Veterans General Hospitais e University System of Taiwan Programa Comum de Investigação (CC).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

Referências

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
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