A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Resumo

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Resumo

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Introdução

Biomarkers obtidos a partir de sangue fornecer informações úteis de diagnóstico, previsão, e estratificando medidas em muitos contextos clínicos, incluindo a doença cardiovascular ^{1, 2} ciências câncer e doença psiquiátrica ^3. Eles também podem ser usados ​​em ciência básica para avaliar o "estado" de um organismo, incluindo o grau de fome, a inflamação, ou o stress presente. Tais medidas podem ser influenciadas por variáveis ​​que podem ou não podem ser críticos para a questão dos juros, incluindo o tempo do dia em que a amostra é obtida eo gênero dos indivíduos. Ele também pode ser influenciada pela tensão induzida durante os procedimentos de amostragem de sangue em si. Hormonas de stress e a percepção de dor pode alterar-se rapidamente a composição do sangue.

Os roedores são o animal de laboratório mais utilizada, e vários métodos foram desenvolvidos para a recolha de sangue. O método ideal de coleta de sangue deve ter Physiologica mínimol impacto sobre o animal, não necessitam de anestesia, permitir a amostragem rápida e repetida, e fornecer o volume de sangue suficiente para inúmeras aplicações a jusante. Técnicas populares para recolha de sangue, como cateterização da jugular amputação da ponta da cauda veia ou não atender a esses critérios.

O objectivo deste protocolo é descrever uma técnica de coleta de sangue para uso em ratos que é minimamente estressante, não requer anestesia, permite múltiplas coletas de sangue dentro de um único assunto, e fornece um volume relativamente grande amostra de tal forma que vários ensaios podem ser realizados numa única amostra. O objectivo deste método é a obtenção de amostras de sangue que são minimamente influenciado pela resposta de stress agudo.

Protocolo

Todas as experiências foram realizadas utilizando ratos adultos machos Long-Evans. Todos os procedimentos estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animal Institucional do Instituto de Tecnologia de Massachusetts e do Animal Care e Use o Office Revisão da o USAMRMC.

1. Preparação

1. Heparinise o cateter e seringa através da colocação da agulha blindado em um tubo de 500 ul contendo heparina (1.000 unidades USP / ml) e, em seguida, aspirar e expelir solução de heparina, através da agulha.
   1. Anexar um cateter de borboleta para a seringa. Manter a blindagem sobre a agulha do cateter para proteger a ponta afiada de danos.
   2. Retirar um volume de heparina que é ligeiramente maior do que o volume de sangue que serão recolhidos. Retire a seringa e encha-o com o ar.
   3. Volte a ligar a seringa ao cateter e usar oar para expelir o excesso de solução de heparina; garantir que apenas quantidades vestigiais permanecer na tubagem, agulha e seringa.
   4. Coloque o cateter estéril, com a seringa ainda fixa, em uma superfície estéril.
2. Garantir rapidamente o rato em um pano limpo garantindo que previsão e patas traseiras estão em uma posição confortável e respiração é irrestrita.
   1. Prenda o envoltório com gancho e laço de fita; assegurar que os genitais externos não são constringido.
   2. Peça a um assistente gentil e firmemente refrear o rato (abdômen e base da cauda) sobre uma superfície de trabalho sólida com o rabo pendurado na borda do balcão.

2. Amostragem de sangue

1. Imergir a cauda em 42 ° C para a água de 40-50 seg para dilatar os vasos sanguíneos e secar a cauda com uma toalha de papel. Localizar a veia da cauda para ser sangrado (girar todo o corpo, com a cauda para evitar a torção da cauda).
   Nota: O aquecimento suficiente da cauda é crítica para a rápida collection de uma amostra de sangue. Se a vasculatura é constringido, a colocação adequada do cateter é difícil, e o fluxo sanguíneo é muito reduzido. Uma almofada de aquecimento pode ser usada como uma alternativa à imersão em água.
2. Identificar o ponto de amostragem.
   Nota: A artéria se encontra ao longo do aspecto médio-dorsal da cauda; não use isso para amostragem.
   1. Alvo ambos os lados esquerdo e direito veias da cauda que se encontram lateralmente à artéria. A pigmentação da cauda, ​​que varia de acordo com a tensão e aumenta com a idade, algumas podem obscurecer da vasculatura. Alvo de um porção da veia na porção inferior da cauda.
   2. Limpe a área de alvo com solução anti-séptica de clorexidina 2%.
3. Criar uma pressão negativa na seringa e um cateter, retirando o êmbolo de zero a cerca de 50 ul.
4. Segure a cauda gentil e firmemente perto da ponta para manter a cauda em linha reta para coleta de amostras. Certifique-se de que o fluxo sanguíneo não for obstruído por um aperto excessivamente apertado.
5. Lentamente inserir o cateter na veia num ângulo raso cerca de 5 cm a partir da ponta da cauda. Quando a veia é penetrado, o sangue irá fluir para dentro do cateter. Lentamente, retirar o êmbolo da seringa para recolher o volume desejado a uma taxa constante (~ 20 ul por segundo).
   1. Consulte o pessoal veterinário para obter informações sobre o volume de sangue máxima que pode ser cobrada. A quantidade máxima de sangue que devem ser recolhidos depende do status de peso e saúde do rato. Não retirar mais de 15% do volume total de sangue em um período de 14 dias.
      Nota: O sangue é muito mais difícil de recolher a partir de animais que foram agudamente estressados ​​nos minutos antes da coleta da amostra, pois os hormônios do estresse contraem a vasculatura. Por exemplo, mover gaiola do rato a um novo quarto, levando vários minutos para embrulhar o animal, ou inserção repetida do cateter em uma veia são todos susceptíveis de desencadear uma resposta de estresse agudo.
   2. Facilitar bloofluxo d por "ordenha" a veia. Passar um dedo ao longo do comprimento da veia, a partir da base para a ponta da cauda, ​​mas permanecem mais de 2 cm a partir da ponta da agulha inserida ou o cateter pode ficar desalojado da veia.
   3. Se o sangue não pode ser recolhido com êxito a partir do local inicial de penetração do cateter, re-inserir a agulha mais acima na veia. Se o sangue foi coletado no local inicial, re-pressurizar a agulha desligando e voltando a ligar o cateter e seringa antes da re-inserção na veia. Em geral, evitar penetrações adicionais.
   4. Como várias penetrações pode causar o colapso da veia da cauda, ​​em que o fornecimento de sangue para a cauda é cortada eo tecido macio cauda torna-se necrosada, eutanásia do rato se houver colapso veia da cauda.
6. Quando o volume da amostra adequada ser coletada, liberar a pressão na seringa por desconectar e reconectar o cateter. Aspirar usando ligeiramente o êmbolo da seringa (~ 50 & #181; l), e retirar a agulha da veia.
   Nota: Se a agulha seja retirada sem primeiro libertar a pressão na seringa, o sangue vai escorrer a partir da agulha.
7. Resumidamente aplicar pressão ao local de inserção para parar o sangramento, e limpe a área com solução anti-séptica. Retorne o rato à sua gaiola.

3. Processar a amostra de sangue

1. Ar aspirado para garantir que nenhum sangue permanece dentro da agulha do cateter, e usar uma tesoura para cortar o tubo de cateter logo acima da agulha. Expelir o sangue em um estéril 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
   Nota: Se o sangue é empurrado através da agulha, a força de corte pode levar as células vermelhas do sangue para romper o que pode interferir com muitos ensaios a jusante. Remover a agulha, para evitar hemólise.
   1. Para recolher o plasma sanguíneo, que contêm tubos de uso EDTA como anticoagulante (aqui, utilizar 10 ul de EDTA 0,1 M para 200-400 ul de sangue; garantir a concentração de EDTA utilizada não interfere wom o ensaio downstream) e colocar no gelo.
      1. Rotação amostras de sangue total a 2100 xg numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) durante 10 min até 10 min de colheita. Elui-se o plasma, evitando perturbar as camadas de células de sangue vermelhas e brancas.
   2. Para a coleta de soro do sangue, amostras de lugar (sem anticoagulante) à temperatura ambiente por até 30 min para permitir a coagulação. Girar os tubos de recolha numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 2000 x g. O soro pode então ser eluída.
2. Utilize amostras imediatamente, ou armazenar a -80 ° C por até um ano.

Resultados

O plasma sanguíneo recolhido a partir da veia lateral da cauda, ​​tal como descrito no protocolo dá uma amostra de plasma que era translúcida e de cor amarela pálida na aparência. Como mostrado na Figura 1, numa amostra de hemólise confere uma tonalidade vermelha com o plasma. A resposta ao estresse agudo pode alterar rapidamente a composição do sangue. Por exemplo, circulando concentração de corticosterona pode aumentar significativamente dentro de 10 minutos de exposição estressor, como mostrado na Figura 2. Os baixos níveis de corticosterona basais obtidos com este método, antes da exposição a factores de stress revelam que o próprio procedimento de amostragem não é uma fonte importante de stress.

Figura 1:. Aparência da amostra (A) Uma amostra hemolisada é mostrado. Após centrifugação, o plasma ou soro camada (superfície indicada pela AR pretolinha) parece tingido de rosa ou vermelho. Matizes mais escuras indicam maiores níveis de hemólise. (B) Depois de centrifugação, uma amostra adequadamente recolhido terá um aspecto límpido, amarelado a banda superior (superfície indicada pela seta preta), que corresponde ao plasma ou soro não hemolisado. Quando a remoção desta camada, é importante para não perturbar o sangue total subjacente, quer empurrando a ponta da pipeta em toda a camada de sangue ou por aspiração de alguns do sangue total para a ponta. Qualquer plasma ou soro contaminado com sangue total deve ser descartado.

Figura 2: corticosterona do plasma é rapidamente elevada após uma experiência estressante Foi obtido sangue a partir da veia lateral da cauda de ratos do sexo feminino Long-Evans adultos antes e 10 min após a exposição a 4 tons (10 sec, 2 kHz, 85 dB) co-terminal. com footshocks (1 seg, 350 mA). Corticosterona no plasma de sangue na linha de base (290,4 ± 138,8 pg / ml) foi significativamente menos do que os níveis observados 10 minutos a seguir à apresentação da tensão de choque nas patas (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), tal como determinado por t emparelhado -test. *, P <0,05

Discussão

Aqui, nós descrevemos um processo rápido e simples para a obtenção de uma amostra de sangue de um rato que oferece vantagens significativas sobre outras técnicas vulgarmente utilizadas. Em primeiro lugar, ele não necessita de anestesia, em contraste com a amostra a partir da veia jugular ou da cavidade retro-orbital. Quando as amostras de sangue são recolhidos em torno procedimentos comportamentais, a administração de anestésicos é indesejável porque pode interferir com a aprendizagem e memória ^4,5. Em segundo lugar, ele oferece a capacidade de recolher volumes de sangue maiores do que outras técnicas de punção venosa, como a recolha das veias safenas pedal ou dorsais. Utilizando a técnica descrita aqui, até 1,5 ml de sangue pode ser coletado de um rato em um único ponto do tempo, um volume que facilmente permite que vários ensaios para ser executado em paralelo. Finalmente, este procedimento minimiza o potencial de dano tecidual comparado a amputação da ponta da cauda ou sangramento retro-orbital. A utilização deste procedimento facilita o cumprimento com o animal Welfare Act eo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, que exigem minimizar a dor eo sofrimento que resulta de procedimentos de laboratório realizados em animais.

Recomenda-se que os investigadores novas para praticar este método e as técnicas de retenção de sangramento da cauda, ​​a fim de minimizar o tempo que os animais experimentais são contidos. O sangue coletado em menos de 3 minutos do início de contenção proporciona ótimos resultados.

O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para a amostragem de 1 a 4 vezes por semana, mas não mais do que duas vezes por dia. Enquanto colecções repetidas de sangue pode ser realizado, diferentes pontos de amostragem que se deslocam para cima a partir da base da cauda deve ser usado, e as veias da cauda esquerda e direita deve ser alternado como locais de amostragem. O volume total de sangue de roedores é 6-7% do seu peso corporal, e não mais do que 15% do volume total de sangue deve ser recolhido dentro de um período de 2 semanas. Soroou plasma compreende cerca de 40-60% do volume da amostra recolhida.

A amostragem de sangue através das veias da cauda laterais podem também ser executada no rato, como descrito aqui com algumas pequenas modificações. Em primeiro lugar, pode ser utilizado apenas um pequeno calibre (27 L) cateteres. Em segundo lugar, é recomendado o uso de um limitador tubo, em vez de um envoltório, para imobilizar os ratinhos. O volume de sangue que pode ser obtida a partir do ratinho usando punção venosa do feixe vascular submandibular (200-500 uL) é maior do que pode ser recolhida de forma segura a partir da veia da cauda (200 ul máxima). Porque a amostragem de sangue do feixe vascular submandibular requer contenção mínima e pode produzir mais sangue, esta é a via preferida para a amostragem no mouse.

A rapidez com que este procedimento pode ser realizado, juntamente com a sua natureza minimamente invasiva, também minimiza a perturbação potencial de medidas baseadas em sangue pela resposta aguda de estresse ^6. Oresposta ao estresse agudo pode alterar os níveis circulantes de muitas moléculas, incluindo interleucinas e outros fatores imunológicos-ativo ^7, hormônios do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, ⁸ hormônios no sistema nervoso simpático ^{9, 10} grelina, opióides endógenos ^11, dopamina e serotonina ^12. Se são desejados repouso circulante medidas dessas moléculas ou outros reguladas por estas moléculas, é importante para minimizar a resposta ao stress, que é accionado dentro de tão pouco como um minuto do início da exposição ao stressor.

As respostas ao estresse não só alterar a composição do sangue, mas também representam um obstáculo técnico para coleta de sangue por causa da constrição dos vasos através de uma maior unidade do sistema nervoso simpático. Torna-se cada vez mais difícil obter o fluxo de sangue constante de um rato que está montando uma resposta ao estresse agudo. Por isso, a angústia do animal deve ser mínimazada, a fim de se obter rapidamente as amostras que reflectem o estado fisiológico de interesse.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium heparin (1,000 USP units/ml)	Patternson Veterinary Supply	25021040010
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	JT Taylor	JT2020-01
Dermachlor rinse-chlorhexadine	Butler Schein	6356	Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate
SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters	VWR Scientific	TESV25BLK
BD Tuberculin 1 cc syringes	VWR Scientific	BD309659
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR Scientific	89202-682
500 μl microcentrifuge tubes	VWR Scientific	21150-330
Scissors, stainless steel, 5"	VWR Scientific	82027-586
500 ml plastic beaker	VWR Scientific	414004-149
Clean cloth wrap	Butler Schein	2993
Velcro tape, 0.75 in width	Monoprice	B004AF9II6	Hook and loop tape
Timer	VWR Scientific	62344-641