Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Resumo

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Resumo

A gravidez é caracterizada pela infiltração de leucócitos nos tecidos reprodutivos e na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal). Essa interface é o sítio anatômico de contato entre mãe e tecidos fetais; por conseguinte, é um local de acção imunológica durante a gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal de desempenhar um papel central na implantação, manutenção da gravidez, e tempo de entrega. Portanto, caracterizações fenotípicas e funcionais desses leucócitos irá fornecer insights sobre os mecanismos que levam a distúrbios de gravidez. Vários protocolos têm sido descritos, a fim de isolar a partir de leucócitos de infiltração a decídua basal e parietal decidua; no entanto, a falta de coerência nos reagentes, enzimas, e os tempos de incubação torna difícil comparar estes resultados. Descreve-se aqui uma nova abordagem que combina a utilização de Diss mecânicas e enzimáticas suavesociation técnicas para preservar a viabilidade e a integridade dos marcadores extracelulares e intracelulares em leucócitos isolados a partir dos tecidos humanos na interface materno-fetal. Além de imunofenotipagem, cultura de células, e separação de células, as futuras aplicações deste protocolo são numerosos e variados. Seguindo este protocolo, os leucócitos isolados podem ser usados ​​para determinar a metilação do ADN, expressão de genes alvo, em termos de funcionalidade in vitro de leucócitos (isto é, a fagocitose, a citotoxicidade, proliferação de células T, e plasticidade, etc), e a produção de espécies reactivas de oxigénio na interface materno-fetal. Além disso, utilizando o protocolo descrito, este laboratório tem sido capaz de descrever novos e raros leucócitos na interface materno-fetal.

Introdução

A gravidez é caracterizada por três fases distintas: 1 imunológicos) implantação e placentação precoce associada com uma resposta pro-inflamatória (isto é, o implante se assemelha a um "ferida aberta"); 2) o segundo trimestre da gravidez, a maior parte do terceiro trimestre de gravidez quando homeostase imune é alcançada através de um estado predominantemente anti-inflamatório na interface materno-fetal; e 3) o parto, um estado pró-inflamatório ^1-7. Células do sistema imunológico desempenha um papel importante na regulação da resposta inflamatória na interface materno-fetal, onde sua abundância e mudança de localização durante toda a gravidez ^6-9.

Nos seres humanos, a interface materno-fetal representa uma área de contacto directo entre materna (decídua) e fetal (cório ou trofoblasto) tecidos. Esta interface inclui: 1) a decídua parietal que reveste a cavidade uterina não coberta pela placenta e está em justaposiçãopara o córion liso; e 2) os decídua basal, localizados na placa basal da placenta, onde é invadido por trofoblastos intersticiais ¹⁰ (Figura 1). A intimidade dessas áreas de contato cria condições para a exposição antigênica fetal à ^11-13 sistema imunológico materno. Não surpreendentemente, leucócitos compreender até 30-40% das células deciduais ^8,9,14,15 além de células do tipo do estroma e as células glandulares típicos ^8,14,16. O papel dos leucócitos na interface materno-fetal engloba vários processos que incluem a limitação da invasão do trofoblasto ^17, remodelação das artérias em espiral ^18,19, manutenção da tolerância materna ^12,20, eo início do trabalho de parto ^21-26. Leucócitos de ambos os membros adaptativa e inata do sistema imune, isto é, células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, células NK, e foram identificados em tecidos deciduais, e suasproporções e estado de activação ter sido demonstrado que variam espacialmente e temporalmente ao longo da gestação ^{6-10,12,14,24,27-30.} Perturbações na população e / ou função de leucócitos estão associados com aborto espontâneo ^31, pré-eclâmpsia ^32, restrição de crescimento intrauterino ^32,33, e trabalho de parto prematuro ^7,24. Por conseguinte, o estudo das suas características fenotípicas e funcionalidade de leucócitos na interface materno-fetal humano facilitará a elucidação das vias desreguladas em perturbações imunológicas gravidez.

Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para determinar o fenótipo e as propriedades funcionais de leucócitos é a citometria de fluxo, a tecnologia que permite a análise quantitativa de vários parâmetros simultaneamente ^34-36. Para análise de leucócitos por citometria de fluxo, é necessário o isolamento de leucócitos de uma suspensão de célula única. Por conseguinte, um método para separar Leu infiltrantekocytes a partir da interface materno-fetal é necessária para estudar a sua fenotípica e propriedades funcionais.

Vários métodos têm sido descritos para isolar leucócitos a partir da interface materno-fetal humano ^{10,14,25,27,37-39.} Enquanto alguns se aplicam desagregação mecânica ^10,25,27,38, outros usam digestão enzimática ^37,40 para a dissociação do tecido. Porque desagregação mecânica produz um rendimento mais baixo e reduziu a viabilidade ^41, e dissociação enzimática pode afectar a viabilidade celular e a superfície de retenção do marcador ^42, o método aqui descrito combina a dissociação mecânica suave com pré-tratamento enzimático para aumentar o rendimento de leucócitos isolados, sem comprometer a viabilidade celular. Uma combinação similar de métodos tem sido demonstrado ser eficaz no isolamento de leucócitos a partir de tecidos deciduais na interface materno-fetal ^39. Portanto, o protocolo aqui descrito envolve a mechadesagregação nica com um Dissociator tecido automático que aumenta a consistência, poupando tempo e trabalho quando comparado ao picar tradicional com bisturis, lâminas de barbear opostas, ou tesoura cirúrgica ^10,28. O enzima escolhido para a dissociação de tecidos foi Accutase. Ao contrário de colagenase comumente usados ^​​43, Dispase ^44, e tripsina ^45, Accutase (uma solução de desprendimento de células) combina proteolítica geral e as actividades que contribuem para colagenolíticas eficiente dissociação ainda suave ^46,47. Depois de dissociação, os leucócitos são enriquecidos da população total das células deciduais por centrifugação em gradiente de densidade. Vários meios de gradiente de densidade foram anteriormente utilizados, o mais comum dos quais são de Percoll (uma suspensão de partículas de sílica coloidal) e Ficoll a ⁴⁸ (um polímero de sacarose com um peso molecular elevado sintético) ^49. A maior eficácia de isolamento por o polímero de sacarose foi previously mostrado ^50, e o protocolo descrito aqui ainda prova que esta mídia gradiente de densidade produz uma pureza suficientemente elevada de leucócitos mononucleares.

Assim, o protocolo aqui descrito combina a desagregação mecânica do tecido com um tecido Dissociator automática, a digestão enzimática com uma solução de separação celular, e separação de leucócitos com um meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para isolar leucócitos de tecidos deciduais humanas. Este protocolo foi comprovada para preservar os antigénios da superfície das células, juntamente com a viabilidade celular. Os leucócitos isolados podem ser usados ​​em várias aplicações que incluem a imunofenotipagem com a citometria de fluxo e estudos funcionais in vitro.

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Protocolo

Este protocolo é apropriado para o isolamento de leucócitos dos decídua basal e parietalis decídua em preparação para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Além disso, as células isoladas podem ser utilizadas para selecção de células, cultura de células, o isolamento de RNA, e citologia. Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética humana deve ser obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa local e Conselhos de Revisão Institucional. A recolha e utilização de amostras humanas para fins de investigação foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) Eunice Kennedy Shriver, Institutos Nacionais de Saúde (NIH), Departamento de Saúde e Serviços Humanos (DHHS , Bethesda, MD, EUA) e Wayne State University (Detroit, MI, EUA). Consentimento informado por escrito foi obtido de todas as mulheres grávidas, antes da colheita de amostras de tecido.
NOTA: Ao trabalhar com sangue animal, células, ou de perigoagentes ous como mencionado neste protocolo, é essencial que biossegurança adequado e ações de segurança de laboratório ser seguido.

1. A dissecção das deciduais Tecidos Humanos

NOTA: A placa basal é a base por baixo e ligado à placenta e representa a face materna. As membranas corioamnióticas incluem o âmnio e cório. A placa basal inclui os decídua basal e o cório inclui os decídua parietal (Figura 1).

1. Decídua Basalis
   1. Dissecar uma parte da placa basal de um cotilédone da placenta (Figuras 1A e 1B).
   2. Coloque-o sobre uma tábua de corte estéril com as vilosidades da placenta voltadas para cima. O lado que mostra as vilosidades da placenta é geralmente vermelho sangrento com tecido cabeludo na aparência. A placa basal é suave e pálido de cor vermelha.
   3. Use afiados, tesouras de ponta fina e uma pinça para remover o villtecidos e vasos sanguíneos OUs. Manter o tecido embebido em 1x PBS (Ca2 ⁺ - Mg2 ⁺ e - livre) durante o processo (Figura 1C). Recolha 2-3 destas peças e lave-os abundantemente com 1x PBS para remover o sangue (Figura 1D).
2. Decídua parietal
   1. Dissecar uma parte das membranas corioamnióticas (aproximadamente 10 cm x 10 cm, Figura 1E). Coloque-o sobre a placa com a chorion voltada para cima. O lado coriônica contém coágulos de sangue e é geralmente luz amarelada na cor.
   2. Use uma pinça de ponta fina para remover o maior número de coágulos de sangue como possível (Figura 1E). Lavar a membrana em 1x PBS estéril para limpar o excesso de sangue a partir da membrana até que o PBS 1x corre claro.
   3. Use um raspador de células estéril descartável para raspar suavemente a camada decidual a partir da membrana. Aplicar estéril 1x PBS na membrana ao completar este processo (Figura 1F). Recolher os tecidos deciduais e colocá-los em um tubo de plástico 50 ml com PBS estéril 1x (Figura 1G).

2. mecânica desagregação e digestão enzimática

1. Lavar o tecido dissecado do decídua basal (do passo 1.1.3) ou a decídua parietal (a partir do passo 1.2.3) com 1x PBS estéril num tubo de plástico de 50 ml. Recolhe pastilhas de tecido por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
2. Aspirar o sobrenadante situado acima da pelete de tecido cuidadosamente, sem perturbar o sedimento.
   NOTA: neste momento, os peletes são muito solta porque contêm células vermelhas do sangue. Se o volume do pelete é de cerca de ou menos de 3 ml, de re-suspender o sedimento em 6 ml de solução de separação celular pré-aquecida a 37 ° C. Se o sedimento é maior do que 3 ml de volume, adicionar mais solução de desprendimento de células (cerca de 2 vezes adicionar the o volume das amostras de tecido).
3. Transfira os tecidos homogeneizados (decídua basal + descolamento célula de solução ou decídua parietal + solução separação celular) para um tubo C.
4. Colocar o tubo C no Dissociator automática e executar o programa correspondente.
   NOTA: O programa para a decídua basal é executado por 17 segundos com 668 no total tiros por prazo. O programa para os parietalis decídua é executado por 37 segundos com 235 no total tiros por prazo. Estes programas foram personalizados para isolar leucócitos dos decídua basal ou os parietalis decídua com bom rendimento e viabilidade celular.
5. Após a desagregação mecânica dos tecidos, digerir os tecidos com uma solução de separação celular comercialmente disponível, como Accutase; (Um cocktail que contém enzimas proteolíticas e colagenolíticas) durante 45 min a 37 ° C com agitação suave.

3. Isolamento de Leucócitos

1. Após a incubação, adicionar 10 ml de PBS 1x ao Digestion mistura e passá-lo através de um filtro de células 100 mm em um tubo de plástico de 50 ml. Dependendo da viscosidade da mistura de digestão, pode-se precisar de utilizar vários filtros de células para uma mistura.
2. Encher o tubo com 1x PBS e centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o PBS 1x acima dos sedimentos celulares cuidadosamente e re-suspender as pelotas com 5 ml de tampão de FACS gelada.
   NOTA: Para estudar os polimorfonucleares e mononucleares leucócitos juntos, vá para o Passo 6.1; para estudar os leucócitos mononucleares, continue com a Etapa 3.3.
3. Adicionar 5 ml de 20% de meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para um tubo de 15 ml de plástico e sobrepor-se lentamente a suspensão de células no topo do meio de gradiente de densidade. Enquanto estratificação da amostra, é importante não misturar a mídia gradiente de densidade com a suspensão de células.
4. Centrifugar com um rotor basculante para fora a 500 xg durante 30 min a 4 ° C sem o travão. É muito importante para desativar o freio para evitar misturar as células e lOsing o gradiente. Os leucócitos podem ser encontrados na interface entre o meio de gradiente de densidade e o tampão de SCAF.
5. Retirar a camada superior que contém o tampão e detritos de células FACS muito cuidadosamente utilizando uma pipeta. A banda na interface contém as células deciduais mononucleares e uma porção dos leucócitos polimorfonucleares.
6. Transferir as células na interface completamente para um novo tubo de plástico de 15 ml. Adicionar, pelo menos, três vezes mais o volume de tampão de FACS.
7. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos para peletizar as células. Aspirar o sobrenadante e lava-se as células com tampão de SCAF. Peletizar as células com uma outra centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Para realizar a cultura de células, consulte Passo 4. Para executar separação de células, consulte Passo 5. Para realizar a imunofenotipagem, consulte a Etapa 6.

4. Aplicações - cultura celular

1. Re-suspender as células do Passo 3,7 em 1 ml de meio de cultura RPMI 1640. Contar as células viáveis ​​using contador automático de células ou um hemocitômetro e uma solução de azul de trypan 0,4%.
2. Adicionar-se a quantidade de meio de cultura RPMI para fazer uma concentração de células de 1 x 10 ⁶ células / ml. As células estão agora prontos para a cultura.

5. Aplicações - Isolamento de macrófagos para a Cultura celular primária

1. Para isolar CD14 + células, magneticamente marcar as células do passo 3.7 com microesferas de CD14 (20 ul por esferas 10 ⁷ células), incubar durante 15 minutos a 4 C, e CD14 + células separado a partir de outros tipos de células através da aplicação de um campo magnético. Após 2 lavagens com tampão de MACS e remoção do campo magnético, eluir as células CD14 + magneticamente retidos com tampão MACS.
2. A seguir à centrifugação, re-suspender as pelotas celulares em meio de cultura RPMI 1640. As células estão prontas para o chapeamento (Figura 2).

6. Aplicações - imunofenotipagem

1. Para usar as células para immunophenotyping, re-suspender as células do Passo 3,7 em 1 ml de 1x PBS. Contar as células viáveis ​​utilizando um contador de células automático ou um hemocitómetro e uma solução de azul de tripano a 0,4%.
2. Rotular as células com um corante de viabilidade fixável (Figura 3). Lavar as células duas vezes com tampão FACS e suspender novamente as células em tampão de coloração. Incubar com um bloqueador de FcR durante 15 min a 4 ° C.
3. Adicionar anticorpos conjugados com fluorocromos extracelulares. Por exemplo, neste protocolo, usar anti-CD3, anticorpos anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 e anti-CD56 (Tabela 1). Incubar durante 30 min a 4 ° C, no escuro.
4. Após duas lavagens com 1x PBS, as células serão analisados ​​em 500 ul de tampão de coloração utilizando um citómetro de fluxo. Uma representação da estratégia de propagação usados ​​para analisar as subpopulações de leucócitos foram encontrados nos tecidos deciduais é mostrado na Figura 4.

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Resultados

. A dissecção de tecidos humanos na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal) é mostrado na Figura 1 Este procedimento inclui a dissecção da placa basal, que inclui os decídua basal (Figura 1A - D). A decídua basal é obtido pela remoção da vilosidade placentário (lado fetal) a partir da placa basal (Figura 1C). A parietal decidua é recolhido por raspagem suave da membrana coriónica (Figura 1E - F)...

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Discussão

Caracterização das propriedades funcionais e fenotípicas de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal humana é essencial para a compreensão dos mecanismos imunes que levam a desordens gravidez. Diversas técnicas têm sido descritas, a fim de isolar leucócitos da interface materno-fetal humano durante a gravidez ^{10,14,25,28,37,42,43.} No entanto, cada uma destas técnicas é distinto, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos diferentes de dissociação, não esp...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator