Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

Resumo

Oscilações são propriedades fundamentais da rede e são modulados pela doença e drogas. Estudar oscilações cérebro-slice permite a caracterização das redes isoladas em condições controladas. Protocolos são fornecidos para a preparação de fatias cerebrais agudos para evocar CA1 oscilações γ.

Resumo

Oscilações de rede neuronal são características importantes da actividade cerebral na saúde e na doença e pode ser modulada por uma variedade de fármacos utilizados clinicamente. Um protocolo é fornecido para gerar um modelo para o estudo de oscilações CA1 γ (20 - 80 Hz). Estas oscilações γ são estáveis ​​durante pelo menos 30 min e dependem actividade sináptica excitatória e inibidora em adição a activação de correntes de pacemaker. Oscilações tetanicamente estimuladas têm uma série de características reprodutíveis e facilmente quantificáveis, incluindo contagem de pico, duração de oscilação, a latência ea frequência que apresentar um relatório sobre o estado da rede. As vantagens das oscilações estimuladas electricamente incluem a estabilidade, reprodutibilidade e aquisição episódica robusta permitindo caracterização da função de rede. Este modelo de CA1 oscilações γ podem ser usadas para estudar os mecanismos celulares e para investigar a actividade sistematicamente como rede neuronal é alterado na doença e pelas drogas.Doença farmacologia estado pode ser facilmente incorporado pela utilização de fatias de cérebro de modelos animais geneticamente modificados ou de intervenção para permitir a selecção de drogas que visam especificamente mecanismos da doença.

Introdução

Oscilações de rede do cérebro ocorrem nas faixas de frequências distintas que se correlacionam com estados comportamentais. Em roedores, oscilações θ do hipocampo (5-10 Hz) são observadas durante comportamentos exploratórios ^1,2, enquanto oscilações γ (20 - 80 Hz) associado com vários processos cognitivos, incluindo a percepção e atenção ^3,4. Atividade da rede síncrona γ também está implicado na patologia de distúrbios como a epilepsia e esquizofrenia ^5,6. Por exemplo, oscilações γ Pensa-se que correspondem a áreas corticais de focos epilépticos ^5,7,8 e poderiam ser utilizados como marcadores de pharmacosensitivity ou resistência, dois importantes áreas de investigação na pesquisa da epilepsia ^9.

A fatia do hipocampo do cérebro é um modelo que tem sido amplamente utilizada para investigar a atividade da rede ^10-12. Vários protocolos têm sido desenvolvidos para gerar oscilações γ em fatias cerebrais que tipicamente imodulação farmacológica nvolve tais como Mg ²⁺ baixo, 4-aminopiridina (4AP), bicuculina e ácido caínico ^12-17. Deficiências de oscilações farmacologicamente desencadeadas são de que eles ocorrem aleatoriamente após a aplicação da droga e não são gerados de forma fiável ou estável ao longo do tempo. Electricamente desencadeada oscilações γ ultrapassar muitos destes problemas e também tem a vantagem de ser temporariamente bloqueado para o evento estimulante para permitir a gravação e análise episódica. Aqui é descrito um protocolo para gerar oscilações CA1 γ, oferecendo uma estimulação tetânica para os oriens estrato na fatia do hipocampo.

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Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo comitê de ética animal Instituto Florey.

1. Instalação para corte fatias do cérebro do

1. Prepara-se uma solução de corte composta por (mM) 125 de colina-Cl, 2,5 de KCl, 0,4 de _CaCl2, 6 de _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, NaHCO ₃ 26, 20 D-glucose saturado com gás de carbogénio (95% O ₂ -5 % de CO ₂₎ e um fluido cerebroespinal artificial (aCSF solução) de gravação formada por (mM) NaCl 125, KCl 2,5, _CaCl2 2, _MgCl2 2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3, 10 de glucose-D, saturado com carbogénio. Coloque a solução de corte no gelo para mantê-lo frio.
2. Congelar aproximadamente 400 ml da solução de corte e misturam-se com 100 ml de solução descongelada de corte para criar uma pasta de gelo. Bolha com carbogénio (95% _O2 5% _CO2) a um caudal de aproximadamente 0,5 L / min por meio de pequenos ctubulação Aliber ou de vidro sinterizado para produzir um fluxo constante, mas suave de bolhas.
3. Prepara-se uma proveta de 250 ml com uma inserção de rede de nylon levantado em que as fatias de cérebro vai ser colocado. Encha com aCSF para cobrir a malha por aproximadamente 2 cm e bolha com carbogênio, garantindo que as bolhas não perturbar directamente área da fatia segurando. Também é importante que não existem bolhas de ar na rede de nylon, por isso, se qualquer estão presentes removê-los. Esta será a câmara de retenção e é mantida à TA (20 - 25 ° C).
4. O layout dos instrumentos de dissecação, incluindo um grande par de tesouras, um pequeno par de tesouras, pequenos e grandes espátulas, micro e pequenas e grandes pinças e chill-los no gelo. Coloque o bloco de corte de tecidos vibratome no gelo em um quadrado de papel alumínio. Obter dois pedaços de papel 6 cm de filtro, uma única lâmina de barbear borda, e um copo de 25 ml cheio com a solução de lama de corte bem.
5. Encha um segundo recipiente com gelo, e colocar um pedaço de tecido paper sobre o gelo e colocar um prato de cultura de 12 centímetros na parte superior. Encha o prato de cultura com o corte de solução de pasta de gelo e espuma com carbogênio. Este é o contentor no qual o cérebro com dissecção ser realizada.
6. Prepare o vibratome. Remover uma lâmina de barbear duplo gumes frescos (use uma nova lâmina de cada vez) da embalagem e spray com etanol 80% de água, em seguida, deionizada. Cortar a 3 ml de transferência pipeta de plástico no ponto onde ele começa a diminuir. Isto irá ser utilizado para transferir as fatias de cérebro. Dobre a 27 G agulha na base por cerca de 45 ° e anexar a uma seringa de 1 ml. Isto irá ser utilizado para manipular fatias durante o corte.

2. Corte fatias de cérebro

1. Anestesiar um rato (P16 - P18) com isoflurano a 2% ou um método aprovado localmente. Após a indução, decapitar o animal com um grande par de tesouras e soltar a cabeça no prato de cultura 12 centímetros que contém borbulhado pasta solução de corte. A pasta deve mergulhar totalmente a cabeça pararesfriamento rápido.
2. Segurar a parte frontal da cabeça com uma mão a descamação da pele e do tecido conjuntivo para a frente em direcção ao nariz. Usando as pequenas tesouras cortar o tecido conjuntivo para revelar o crânio subjacente. Em seguida, retire os músculos que recobrem aspecto dorsal do crânio e pescoço.
3. Remover o cérebro do crânio por fixar a primeira parte frontal do crânio com as grandes pinça e, em seguida, fazer dois cortes laterais através do osso ou outro lado do buraco occipital, utilizando as pequenas tesouras (Figura 1, os cortes marcados A1 e A2).
   1. Faça outro corte entre os olhos (apenas anterior do bregma) (Figura 1, corte marcado B), em seguida, corte cuidadosamente ao longo da sutura sagital anteriormente e refletem as seções corte do crânio para revelar o cérebro (Figura 1, corte C rotulado).
   2. Use a pequena espátula para colher o cérebro eo lugar em uma placa de cultura. Esteja ciente do crannervos ial sobre o aspecto inferior do cérebro, que terá de ser rompida, isto pode ser feito usando o menor tamanho micro espátula. Utilizando a espátula de transferir maiores do cérebro para o copo de 25 ml cheio com a solução de lama de corte.
4. Preparando o hemisfério cerebral para corte.
   1. Coloque um pedaço de papel de filtro 6 centímetros no fundo de um prato de cultura fresco, em seguida, preencher com chorume fresco solução de corte e bolha. Utilizar a espátula maior para posicionar o cérebro, o lado ventral para baixo, para o papel de filtro. Pegue uma lâmina de barbear nova e limpa aresta única e cortar o cérebro para remover o cerebelo, em seguida, faça um corte ao longo da linha média para separar o cérebro em dois hemisférios.
5. Preparando o bloco de tecido vibratome.
   1. Aqui o bloco de tecido vibratome refrigerados, secar a superfície, e colocar uma gota de cola de cianoacrilato no meio e distribuídos uniformemente para o tamanho aproximado do cérebro. Utilizar a pequena espátula para manipular um doshemisférios cerebrais para o grande micro espátula de modo que o lado medial do cérebro está em baixo.
   2. Tocar a borda da espátula na interface do cérebro no segundo pedaço de papel de filtro para remover o máximo da solução quanto possível. Deslize o cérebro fora das espátula maiores, usando a espátula menor para guiá-lo para a cola.
   3. Prenda o bloco de corte para a câmara de vibratome e encher a câmara com lama solução de corte e bolha, garantindo o cérebro está completamente imerso. Rodar o bloco de corte de modo que o lado ventral do cérebro está virada para a lâmina.
6. Cortando o cérebro.
   Nota: Cada vibratome é único por isso siga as instruções do fabricante.
   1. Definir a espessura da fatia de 450 mm, e assegurar a lâmina está a vibrar, uma vez que se move através do cérebro a uma velocidade de cerca de 0,3 mm / s. Cortar inteiramente através do cérebro do lado ventral para a superfície cortical, isso vai produzir fatias de cérebro sagital inteiras que podem Be usado para registros eletrofisiológicos. Fatias serão produzidos lateralmente para medialmente e tipicamente 3-4 fatias pode ser cortada a partir de cada hemisfério.
   2. Se a base dos elevadores fatia usar o bent 27 G agulha para imprensa suave a fatia de volta para baixo. À medida que cada fatia é cortada, utilizar a pipeta de transferência para movê-lo para a plataforma na câmara de retenção, onde eles são viáveis ​​para até 8 horas.

3. extracelulares Eletrofisiologia Recordings

1. Montagem da fatia na câmara de gravação.
   1. Utilizando a pipeta de transferência, coloque uma fatia do cérebro dentro de uma câmara de gravação submersa perfundidos com aCSF fluindo a 1 - 2 ml / min e aquecida a 32 ° C. O aCSF usado para gravações difere do que na câmara de retenção, como a concentração de Mg ²⁺ é aumentada de 2 mM a 4 mM.
   2. Fixe a fatia com uma "harpa" (aço inoxidável semi circular com fios de nylon esticadas em toda a 2 - espaçamento de 3 mm). Lugarharpas, de modo que as cadeias correm paralelamente ao CA1. Aumentar a velocidade de perfusão para 8 - 10 ml / min a 32 ° C.
2. Sob um microscópio de dissecação lugar um eléctrodo estimulante e um eléctrodo de registo (eléctrodo de vidro preenchido com a solução de gravação aCSF) sobre a superfície do estrato radiante de CA1 (Figura 2A). Coloque o eletrodo estimulando primeiro, em seguida, coloque o eletrodo de registro.
3. Estimular a Schaffer dos colaterais com um 120 - 150 mA amplitude e 0,1 ms duração do pulso de teste e observar o campo pós excitatório sináptica potencial (fEPSP) forma de onda resultante para determinar fatia saúde (Figura 2B). Os eléctrodos de estimulação e de registo pode precisar de ser movido para a fatia de cerca de 50 - 100 | iM a partir da superfície da fatia para obter a gravação de um fEPSP com uma pequena da salva de fibra e grande amplitude. A garantia Schaffer evocado fEPSPs são estereótipo e oferecer um bom indicador da fatia saúde. HEalthy fatias mostram tipicamente uma saraivada de fibra para fEPSP relação de amplitude inferior a 0,3.
4. Reposicionando os eletrodos.
   1. Usando um microscópio de dissecação, mover-se do eléctrodo estimulante para o meio das stratum oriens e mover o eléctrodo de registo para a camada de células piramidais o mais próximo do eléctrodo de registo como possível, como mostrado na Figura 3A. Os eléctrodos de estimulação e de registo pode ter de ser empurrada para dentro da fatia de cerca de 50-100 uM de modo que a amplitude da resposta ao fEPSP 120-150 uA pulso de teste é de aproximadamente 1 mV.
5. Gerando oscilações γ.
   1. Para gerar oscilações γ estimular o tecido com um trem de 20 x 0,1 pulsos ms entregues a 200 Hz. Este estímulo tetânico pode render respostas reprodutíveis quando entregues a cada 5 minutos.
6. Utilize os seguintes parâmetros de gravação.
   1. Escala o ganho do sinal de saída para combinar com a gama de tensão de entradao conversor de analógico para digital. Certifique-se que o máximo esperado excursão sinal usa um mínimo de 30% da gama de tensão de entrada. Tenha cuidado ao definir ganhos para alta como sinais pode cortar. A largura de banda típica necessário para gravações de campo é de 500 Hz com acoplamento AC a 0,1 Hz para remover desvio da linha de base.
   2. Digitalizar pelo menos 4-5 vezes mais rápido do que a frequência de corte do filtro passa-baixo para evitar a turbulência de sinais.
7. Análise de dados.
   1. Dados filtro de alta freqüência de 5 Hz para remover quaisquer mudanças da linha de base. Identificar picos utilizando um derivado de limiar, com uma separação mínima evento de 10 ms, um tempo típico de evento para o pico e o intervalo de regressão de 7 ms, de um limiar de ~ 100 mV / ms, e um vale a separação de 100%. Calcular latência como o tempo necessário para o primeiro pico identificado para ocorrer após o fim do artefacto de estimulação. Esta análise permite a caracterização do número de espigas, a latência, intervalo inter-eventos, e calculada como a duraçãosegue:
   2. Calcular o número de picos como o número total de picos por oscilação para cada varrimento é determinada.
   3. Calcula-se a latência de oscilação. Para cada oscilação, subtrai-se o tempo do primeiro ponto identificado a partir da extremidade do artefacto de estimulação.
   4. Calcule o intervalo médio inter-evento (ISI). Determinar o período de tempo entre vários picos detectados e média.
   5. Calcula-se a duração da oscilação. Medir o tempo entre o primeiro eo último pico detectado dentro de cada oscilação.

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Resultados

Estimulação tetânica dos oriens estrato gerado robustos e reprodutíveis oscilações γ (35,4 ± 2,2 Hz), ver Figura 3B. Para demonstrar que as oscilações foram geradas na rede local de CA1 as entradas de CA3 foram cortados pelo corte da fatia na região CA2 usando uma agulha G 32 dobrada. As propriedades de oscilação de corte em fatias não diferiram das fatias não cortadas (p = 0,85, e as fatias cortadas 6,16 ± 1,1 pontos, n = 6; não cortadas fatias 5,89 ± 0,8 pontos, n = 6), indicando que...

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Discussão

Um método robusto para gerar oscilações de CA1 γ em fatias cerebrais agudos está descrito. As oscilações geradas surgir a partir de um circuito local possibilitando uma melhor oportunidade para controlar e compreender a base neurofisiológica de oscilações da rede ^12. Os receptores de AMPA, receptores de GABA _A, I _h e de tipo T canais de Ca2 ⁺ são todos necessários para oscilações γ neste modelo. Enquanto as oscilações CA1 locais descritos aqui podem ser robust...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)	Sigma-Aldrich	Z3777
Biuculline	Sigma-Aldrich	14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)	Sigma-Aldrich	C127
Nickel	Sigma-Aldrich	266965
Carbamazepine	Sigma-Aldrich	C4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)	Tocris Bioscience	0105
Retigabine	ChemPacific	150812-12-7
Choline-Cl	Sigma-Aldrich	C1879-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-250G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 • 2H2O	Sigma-Aldrich	223506-500G
MgCl2 • 6H2O	Sigma-Aldrich	M2670-500G
Electrode glass	Harvard Apparatus	GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode	FHC	CBBPF75
Digital Isolator	Getting Instruments	Model BJN8-9V1
Model 1800 amplifier	A-M systems	Model 1800 amplifier
Digitizer	National Intruments	NI USB-6211
Vibrotome	Leica	VT1200s