Geração de escalável e de alto-Aspect Metallic nanocompósitos índices, em um Biológico Líquido Médio

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para sintetizar novos, de alta relação de aspecto biocompósitos condições biológicas e em meio líquido. Os biocompósitos escala de nanómetros a micrómetros de diâmetro e de comprimento, respectivamente. Nanopartículas de cobre (CNPS) e sulfato de cobre combinados com a cistina são os componentes chave para a síntese.

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever a síntese de duas novas biocompósitos com estruturas de relação de aspecto de alta. Os biocompósitos composto de cobre e cistina, quer com nanopartículas de cobre (CNPS) ou sulfato de cobre contribuindo o componente metálico. A síntese é levada a cabo no estado líquido sob condições biológicas (37 ° C) e sob a forma de compósitos auto-montada após 24 h. Uma vez formados, estes compostos são altamente estáveis ​​em ambos os meios líquidos e em uma forma seca. Os compósitos escala nano a partir do micro- gama de comprimento, e de alguns microns a 25 nm de diâmetro. A microscopia electrónica de varrimento com emissão de campo espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX), demonstrou que o enxofre estava presente nas estruturas lineares NP-derivados, que não foi encontrada a partir do material de partida CNP, confirmando assim cistina como a fonte de enxofre nos nanocompósitos finais . Durante a síntese destes nano e micro-compósitos lineares, uma variada gama de comprimentos de structures é formada no reactor de síntese. A sonicação da mistura líquida após a síntese foi demonstrado para ajudar a controlar a dimensão média das estruturas, diminuindo a duração média com o aumento do tempo de sonicação. Uma vez que as estruturas formadas são altamente estáveis, não se aglomeram, e são formadas na fase líquida, centrifugação, também podem ser utilizados para auxiliar na concentração e segregar compósitos formados.

Introdução

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

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Protocolo

1. Planejamento de Experimentos

1. Determinar o volume de nanocompósitos de cobre necessário para a síntese. Nessa base, escolha um número de frascos de pequeno volume (25 ^cm2), ou frascos maiores, como indicado a seguir na preparação de materiais.
2. Para esta síntese, utilizar uma temperatura de 37 ° C incubadora com 5% de CO ₂ e, pelo menos, 40% de humidade. Assegure-se que uma tal incubadora está disponível e que não será perturbado repetidamente ao longo do período de síntese (aproximadamente 24 horas).
   CUIDADO: abertura e fecho repetido da incubadora certamente irá causar flutuações de temperatura que podem resultar na síntese de alteração das estruturas nanocompósito.

2. Preparação de Materiais

1. Prepare todos os materiais frescos antes do início de uma experiência, através da adição de materiais sólidos para solventes direita antes da síntese é para começar. Manter as soluções concentradas de cistina e cobre materiais de partida em líquido por longos vezes bntes a experiência não é recomendado e pode levar a resultados variáveis. Uma vez aberta a partir do fornecedor, continuo materiais secos envolvendo a parte superior do recipiente com Parafilm partida.
   Nota: O protocolo seguinte é utilizado como um exemplo para a reacção, em 25 ^cm2 de frasco de cultura de células utilizando 7 ul de cistina, 6643 uL de água estéril, e 350 ul de CNPs.
2. Prepare a / ml solução 2 mg de nanopartículas de cobre pesando, pelo menos, 2 mg de CNPs. Usar luvas descartáveis, durante este passo para evitar possível contato de CNPs com a pele. Coloque as nanopartículas em um frasco vazio estéril 16 ml de vidro.
   1. Para o frasco contendo CNPs, adicionar água desionizada estéril no volume apropriado para produzir uma solução 2 mg / ml e a solução vortex durante 20 segundos para proporcionar dispersão das nanopartículas, antes do início de síntese (pelo menos 1 ml de volume total é recomendado). Não encha o mais de meio caminho frasco com água, pois isso irá inibir a mistura em vórtice. CNPs will rapidamente se depositar no fundo do frasco e aparece de cor escura (cinza ao preto).
   2. Sonicar a solução CNP por 17 minutos à temperatura ambiente para proporcionar dispersão máxima de CNPs antes do início da síntese. Verifique periodicamente para se certificar de que CNPs estão misturando devido a sonicação. Após uma sonicação bem sucedida, CNPs permanecem suspensas na solução durante pelo menos 30 min e a solução será de cor escura.
3. Pesar massa suficiente de cistina para produzir uma solução / ml 72,9 mg para a síntese. Desde cistina não é diretamente solúvel em água, coloque o cistina pesava um recipiente de pesagem antiestática.
   1. Para a pesagem recipiente que contém cistina, adicionar um volume suficiente de NaOH 1 M estéril, de modo que a cistina dissolve-se completamente. Por exemplo, dissolve-se 7,29 mg de cistina completamente em 100 ul de NaOH 1 M, para fazer um / ml de solução 72,9 mg.
   2. Para manter condições estéreis, realizar esta etapa em um tecido fluxo cultura capô estéril.
      CUIDADO: NaOHem 1 M concentração é cáustico, por isso use luvas descartáveis, durante este passo para evitar o contato da pele com NaOH concentrado
4. Trabalhando numa cultura de tecidos hote estéril, adicionar 7 ul de cistina com 6643 uL de água estéril para a síntese balão estéril em primeiro lugar, e deixar incubar durante 30 minutos na incubadora a 37 ° C, com a tampa do frasco ventilado (solta) para fornecer eficaz de mistura. Ressuspender o CNP solução de 2 mg / ml em vortex durante 30 segundos, uma vez que terá CNPs liquidados após o passo de sonicação.
   1. Adicionar solução CNP no balão de síntese (utilizando uma técnica estéril) para manter as proporções dos componentes seguintes: combinar uma partes cistina, 50 partes CNPS, e 949 partes de água estéril num frasco de cultura de célula de 25 ² cm, para iniciar a síntese. Por exemplo, para um volume de 7 ml de síntese, combinar 7 uL da solução de cistina, 350 ul de CNPs, e 6,643 mL de água estéril. Substituir a tampa no frasco de apertar e de modo que é secure.
   2. Depois de combinar todos os componentes para a síntese, misture delicadamente no frasco agitando 4-5 vezes. Colocar o balão na incubadora de CO ₂ e ventilar o frasco, desapertando o tampão de modo que não haverá permuta de gás dentro e para fora do frasco durante a síntese.
5. Permitir síntese para executar na incubadora por aproximadamente 24 horas. Durante a síntese, pode-se observar, com microscopia e por olho, formação de compósitos altamente lineares.
   Nota: O processo de formação das estruturas pode acontecer de repente no sentido em que as estruturas são inicialmente difícil de detectar, em seguida, aparência procede rapidamente a uma densidade crescente. A formação pode, portanto, ocorrer antes de 24 horas. O processo também pode ser observada a olho nu uma vez que as estruturas se tornam maiores e os seus aumentos de densidade. Embora a geração de estruturas pode ser observado ao longo do tempo sob o microscópio e pelo olho em pontos de tempo posteriores, interrompendo continuamente as condições de síntese e temperatura irá levar a um mauresultados de síntese.
6. Terminar a síntese de biocompósitos por firmemente o balão de síntese de nivelamento e de armazenar o recipiente no frigorífico (4 ° C). Estruturas, uma vez gerados, permanecer estável nesta forma durante pelo menos um ano. Rotular o frasco com condições de síntese, incluindo componentes utilizados, a data de síntese, e o tempo de incubação da síntese antes da terminação.

3. Síntese Usando sulfato de cobre

1. Realizar a síntese de auto-montagem, substituindo CNPs com sal sulfato de cobre. Utilizando uma técnica estéril, dissolver, pelo menos, 2 mg de sulfato de cobre em um volume suficiente de água desionizada estéril para fazer uma solução / ml 2 mg. Os cristais de sulfato de cobre ir facilmente em solução a esta concentração, mas vortex do frasco, se necessário, e inspeccionar por olho para assegurar que todos os cristais são dissolvidos.
2. Após a preparação do sulfato de cobre, realizar a síntese como descrito anteriormente, mas substituindo CNPs com o sulfato de cobre.
   Nota: nanocompósitos auto-montadas usando sulfato de cobre como um material de partida, verificou-se ser muito mais consistente na forma final do que para estruturas sintetizadas a partir CNPs.
3. Terminar a síntese de biocompósitos sulfato de cobre como para os compósitos CNP (passo 2.6) e armazená-las a longo prazo, a 4 ° C.

4. Caracterização e Manuseio de Biocompósitos Pós-síntese

1. Caracterizar biocompósitos derivados de CNPs e de sulfato de cobre por microscopia de luz branca ⁹ e por microscopia eletrônica de ^9.
   1. Para a caracterização e inspecção de biocompósitos pós-síntese por microscopia de luz branca, usar um microscópio invertido, como compósitos vai assentar a superfície inferior do balão dentro de poucos minutos após a postura do balão plana, e, em seguida, pode ser trazida para o foco. Utilize a definição de campo claro no microscópio para maximizar o contraste entre biocompósitos e o meio líquido. Composites derivados de CNPs e policialpor sulfato serão ambos parece claro a opaco na cor, mas agregados CNP não reagiram aparece muito escuro na cor.
      1. Use uma câmera digital conectada ao microscópio para capturar imagens dos compósitos. Uma gama de comprimentos para as estruturas individuais serão observadas.
   2. Para a caracterização e inspecção de biocompósitos pós-síntese e depois da armazenagem a 4 ° C, para permitir frascos vir até à temperatura ambiente durante pelo menos 15 minutos como tubos vai formar condensação inicialmente após a remoção do frigorífico, o que irá obscurecer eficaz de focagem durante a realização de microscopia de imagem. Depois de permitir o equilíbrio à temperatura ambiente, limpar as superfícies de topo e de fundo do balão com uma toalha de papel limpa para maximizar a qualidade de imagem de microscopia.
   3. Ao trabalhar com ou de imagem compósitos que foram armazenados a longo prazo, vortex o frasco durante 30 segundos para dissociar aglomerados de compósitos que formam enquanto na geladeira. Depois de vórtex, inspecionar as estruturas com um microfone invertidoroscope para assegurar que os agregados foram dissociadas, e repetir vórtice, conforme necessário.
   4. Use microscopia de luz branca invertida para avaliar a eficácia da síntese para uma dada experiência utilizando CNPs. Por exemplo, documentar a presença ou ausência de que não reagiu CNPs em frascos de síntese utilizados para biocompósitos CNP-derivadas a partir de frascos com diferentes parâmetros tais como o tempo de síntese.
      Nota: Pessoa CNPs são demasiado pequenos para observar com um microscópio de luz, mas que não reagiu CNP agregados aparece como-forma redonda e objectos escuras, em contraste com os CNP-compósitos sintetizados com sucesso, que terá uma relação de aspecto elevada, forma linear, e terá uma gama de diferentes comprimentos. Evitar a realização de síntese para demasiado longo de um período de tempo antes da rescisão, como isso irá resultar em muito ramificados estruturas do tipo "urchin", que são difíceis de dispersar em estruturas individuais, uma vez formados.
   5. Use microscopia de luz branca invertida para avaliar a eficáciada síntese para um dado experimento usando sulfato de cobre. Desde sulfato de cobre vai plenamente em solução usando este protocolo, a solução aparece menos escura do que a solução de síntese usando CNPs. Documentar o tamanho ea extensão de compósitos de sulfato de cobre, comparando frascos com diferentes condições de síntese, tais como o tempo de síntese antes da rescisão.
      Nota: compostos sintetizados com sucesso vai mostrar uma gama de diferentes comprimentos. Evitar a realização de síntese para demasiado longo de um período de tempo antes da rescisão, como isso irá resultar em agregados altamente ramificados de compósitos, alguns dos quais serão "ouriço-like" na estrutura, e que são difíceis de dispersar em estruturas individuais, uma vez formados .
2. Para concentrar biocompósitos pós-síntese, as soluções de compostos de centrifugação num tubo de centrífuga. Adicionar 6 mL quer de estruturas derivadas do CNP ou estruturas derivadas de sulfato de cobre para um tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar durante 10 mina 500 xg à temperatura ambiente para formar um pelete. Para volumes menores, adicione 500 mL de estruturas em solução a 0,6 ml tubos porte. Centrifugar a 2000 xg à temperatura ambiente durante pelo menos 10 minutos para formar uma pelete.
   1. Após centrifugação durante tempo suficiente (pelo menos 10 min para microfuges), guardar o sedimento observável na parte inferior do tubo, onde as estruturas são concentrados por remoção cuidadosa do líquido sobrenadante acima da pelete. Estruturas biocomposite derivados de sulfato de cobre aparecem na cor azul e estruturas derivadas CNPs são mais escuras (cinza ao preto).
   2. Adicionar mais compósitos para este tubo e repetir o processo no mesmo tubo para concentrar estruturas se desejado. Para dispersar os peletes concentradas, adicionar o volume desejado de solução para o tubo, e vortex durante 10-30 seg.
3. Sonicar estruturas, uma vez formada, para mover o tamanho da população média (comprimento) das estruturas para valores mais baixos. Estruturas coloque em água deionizada estéril e sonicate por pelo least 10 min. Usando este processo, ao longo do tempo, as estruturas tornam-se fragmentado e menor no comprimento médio (ver figura 6 do texto). Alterações do documento em tamanhos compósitos com diferentes tempos de sonicação utilizando um microscópio invertido luz branca e câmera digital.

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Resultados

A Figura 1 mostra um fluxograma esquemático dos passos de síntese, para formar os biocompósitos lineares descritas neste trabalho. CNPs ou sulfato de cobre como materiais de partida são combinados com água esterilizada para formar uma solução / ml 2 mg, esta solução é misturada e sonicada para fornecer uma mistura uniforme, e esta solução de cobre é, em seguida, misturados na seguinte proporção para a síntese de: 949 partes estéril água: 50 partes de mistura de cobre: ​​1 parte de ...

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Discussão

Ao avaliar os potenciais efeitos tóxicos de nanomateriais incluindo CNPs, observou-se que, a longo prazo, CNPs foram transformados a partir de uma distribuição de partículas mais inicialmente dispersa para uma forma maior, agregados (Figura 2). Em alguns casos, essas formações altamente agregados que foram produzidos na placa de cultura de células, sob condições biológicas, formado projeções altamente linear a partir do centro de agregado, que relembram a cobre anteriormente descrito contend...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique