Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para infligir a cabeça fechado traumatismo crânio-encefálico (TCE) em Drosophila. Este método oferece um portal para investigar os mecanismos celulares e moleculares que estão na base patologias TCE, utilizando a vasta gama de ferramentas experimentais e técnicas disponíveis para as moscas.

Resumo

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) afeta milhões de pessoas a cada ano, causando comprometimento da saúde física, cognitiva e funções comportamentais e morte. Estudos utilizando Drosophila têm contribuído importantes avanços na compreensão de processos neurológicos. Assim, com o objetivo de compreender a base celular e molecular de patologias TCE em humanos, foi desenvolvido o dispositivo de Trauma de Alto Impacto (HIT) para infligir cabeça fechada TBI em moscas. Moscas submetidos aos fenótipos visor do dispositivo HIT consistentes com TBI humano, tais como incapacidade temporária e neurodegeneração progressiva. O dispositivo HIT usa um mecanismo baseado em mola para impulsionar moscas contra a parede de um tubo de ensaio, provocando danos mecânicos ao cérebro mosca. O dispositivo é barato e fácil de construir, a sua operação é simples e rápida, e que produz resultados reprodutíveis. Por conseguinte, o dispositivo de HIT pode ser combinada com as ferramentas experimentais existentes e técnicas de moscas para tratar fundamentaisdúvidas sobre TCE que podem levar ao desenvolvimento de diagnósticos e tratamentos para o TCE. Em particular, o dispositivo HIT pode ser usado para realizar telas genéticos em grande escala para compreender a base genética de patologias TBI.

Introdução

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é definida como lesão no cérebro de uma força mecânica externa. Mais vulgarmente, a partir de resultados de TCE forças de cabeça fechada, como forças rombas e aceleração inércia e forças de desaceleração que causam o cérebro para atingir o interior do crânio. Nos Estados Unidos, estima-se que 50.000 pessoas morrem a cada ano de TBI e 2,5-6.500.000 indivíduos estão a viver com as consequências do TCE, incluindo debilitante físico, cognitivo e problemas de comportamento ^1,2. As conseqüências do TCE não são apenas devido a lesões mecânicas primárias para o cérebro, mas também a lesões celulares e moleculares secundários para o cérebro, bem como outros tecidos que ocorrem ao longo do tempo ^3-5. O desenvolvimento de abordagens para diagnosticar e tratar o TCE tem provado ser difícil porque o TCE é um processo de doença complexa. A natureza variável de lesões primárias, fisiologia humana e fatores ambientais resulta em i secundário heterogêneonjuries e patologias. Factores variáveis ​​subjacentes incluem a gravidade da lesão primária, o tempo entre as lesões primárias repetitivas, e da idade e do genótipo do indivíduo. A compreensão de como cada fator variável contribui para as conseqüências de TBI é susceptível de ajudar no desenvolvimento de abordagens para diagnosticar e tratar TBI ^6,7.

Aqui nós descrevemos um método para infligir TBI cabeça fechada em Drosophila melanogaster (mosca da fruta) que pode ser usado para delinear a contribuição de fatores variáveis ​​para as consequências do TCE. O método baseia-se na observação inicial de que intensamente que bate no lado de um frasco de cultura mosca contra a palma de uma mão causada moscas do tipo selvagem para ficar temporariamente incapacitada, uma consequência provável da TBI. Assim, construímos o dispositivo High-Impact Trauma (HIT) recapitular as forças de aceleração e desaceleração a partir da ação de bater a mão. Um filme de alta velocidade mostra que um único golpe doHIT dispositivo faz com que voa para entrar em contato com a parede do frasco várias vezes com a cabeça eo corpo ^8. Em certa medida, todos os contatos são susceptíveis de fazer com que o cérebro da mosca a ricochetear e deformar contra a cápsula cabeça, semelhante ao que acontece com os seres humanos em quedas e acidentes de carro ^9. Assim, moscas tratados com os fenótipos visor do dispositivo HIT consistentes com lesão cerebral, incluindo a incapacidade temporária seguido por ataxia, a recuperação gradual da mobilidade, alterações de expressão gênica na cabeça, e neurodegeneração progressiva no cérebro ^10. Assim, o dispositivo de HIT torna possível estudar TBI utilizando o enorme arsenal de ferramentas e técnicas desenvolvidas para moscas experimentais.

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Protocolo

1. Construção do Dispositivo HIT

1. Fixe a mola para a placa utilizando dois grampos e quatro parafusos (Figura 1A). Centralize os grampos em relação à largura da placa e Butt-los uns contra os outros com o flush braçadeira exterior com a borda da placa. Antes de fixar os grampos, dobre-os usando um alicate para caber firmemente sobre a primavera.
   NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter descrições dos materiais necessários para a construção do dispositivo de HIT. A extremidade apertada da mola deve ser de 1/8 de polegada (3,2 mm) a partir da borda da placa, ea extremidade livre deve estender-se sobre a placa por 3/4 de polegada (19 mm). Ajustar a mola de modo que ela se encontra em paralelo com o comprimento do bordo.
2. Enrole a extremidade livre da mola em torno de uma vez com a fita adesiva de loops de velcro. A borda externa do velcro deve estar nivelada com a extremidade da mola. O Velcro é importante porque é usado para proteger o frasco para a mola por CREAting um encaixe de compressão apertado. O velcro permite também uma fácil ligação e remoção de tubos de ensaio, permitindo que muitos frascos a serem processados ​​num curto período de tempo.
3. Coloque a tampa do balde de gelo de cabeça para baixo, centrado, apertado contra a placa de madeira. Orientar a região elevada da tampa balde de gelo de modo a que a borda é paralelo ao longo da largura do tabuleiro. Note-se que a região elevada do balde de gelo é de 1/2 polegada (13 mm) maior do que a placa de madeira, de modo que quando um frasco é ligado à mola a mola não vou mentir plana no tabuleiro.
4. Deslize todo o dispositivo contra um objeto fixo, como uma parede, de modo que a tampa balde de gelo está encravado entre o conselho eo objeto e não se move.
5. Tape o transferidor de papel para o fundo de um cartão voar bandeja frasco e coloque na borda contra a extensão do tabuleiro de modo que a marca de 90 ° está alinhado com a primavera, quando ele é puxado de volta para uma posição perfeitamente vertical.

2.O funcionamento do dispositivo HIT

1. Lugar entre 1 e 60 CO ₂ -anesthetized voa em um frasco vazio e tapar o frasco usando uma bola de algodão apertada.
2. Confinar as moscas para a parte inferior de 1 polegada (2,5 cm) do frasco, empurrando a bola de algodão para dentro do frasco até que seja de 1 polegada (2,5 cm) a partir do fundo. É útil para desenhar uma linha no frasco na marca de 1 polegada (2,5 cm). Note-se que as moscas para confinar regiões maiores ou menores do frasco pode afectar a gravidade dos fenótipos.
3. Esperar 5 min para as moscas para recuperar a mobilidade do CO _2. Note-se que não se sabe se 5 min é suficiente para eliminar completamente os efeitos de CO _2.
4. Inserir a extremidade da mola para dentro do frasco até que a extremidade interior do Velcro é nivelada com o topo do frasco (Figura 1B). Quando a primavera está deitado, de 1 polegada (2,5 cm) do frasco para injectáveis ​​deve sobrepor-se a região elevada da tampa do balde de gelo. Os frascos podem ser reutilizados mqualquer hora.
5. Ao sentar-se, mantenha o frasco a região de Velcro usando o polegar eo dedo indicador de sua mão esquerda. Segure a placa firmemente à bancada usando sua mão direita. Como alternativa, use C-braçadeiras para segurar a placa apertada para a bancada.
6. Puxe a mola perfeitamente em linha reta de volta para o ângulo desejado. Solte a primavera. Permitir que a primavera chegar a uma paragem completa.
7. Retire o recipiente da primavera e permitir que as moscas se recuperar para ≥5 min. Apresentar as moscas para outra greve ou transferir as moscas para um frasco com alimentos mosca.
   NOTA: Uma variedade de ensaios pode ser utilizada para avaliar os efeitos fenotípicos de ataques do dispositivo HIT. Por exemplo, os efeitos sobre a longevidade pode ser determinada através da análise da percentagem de moscas que sobrevivem às vezes após a lesão, os efeitos na morfologia do cérebro pode ser determinada por análise histológica da cabeça, e os efeitos sobre a expressão do gene pode ser determinada por análise quantitativa dos níveis de ARNm ^10.
8. Determine efeitos do procedimento que não são devido a greves, tratando de forma idêntica moscas de controle que não são sujeitos a ataques. Usar protecção auricular, porque o impacto do frasco contra a cobertura balde de gelo produz um ruído alto.

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Resultados

Estamos interessados ​​em entender por que as moscas morrem logo após a lesão primária. Para quantificar a morte, determinou-se o Índice de mortalidade às 24 horas (MI _24), que é a percentagem de moscas que morreram dentro de 24 horas da lesão primária. Moscas sujeitos a ataques do dispositivo HIT foram incubadas a 25 ° C num frasco com comida mosca, e o número de moscas mortas foi contado após 24 horas. Utilizou-se esta abordagem para identificar os factores que afectam a MI ₂₄ e de...

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Discussão

O método dispositivo HIT se distingue de outros métodos que infligem lesões traumáticas em moscas pelo fato de que ele faz com que a cabeça fechado, em vez de penetrar TBI ^11. Além disso, o método de dispositivo HIT leva menos tempo, esforço e habilidade para infligir TBI em muitas moscas, por isso, o método é mais favorável do que outros métodos para telas genéticos de grande escala. Por fim, o facto de as lesões primárias infligidos pelo dispositivo HIT não estão limitados ao cérebro é ao...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)