Asymmetric Passagem: A Novel de Ensaio Comportamental de Estudos de Asymmetric Locomotion

Resumo

Here, we present a protocol to quantify precise stepping in rodents. Cortical and the spinal central pattern generator signals are required for precise foot-placement during obstructed locomotion. We report here the novel constrained walking task that directly examines precise stepping behavior.

Resumo

Ensaios comportamentais são comumente usados ​​para a avaliação da insuficiência sensório no sistema nervoso central (SNC). Os métodos mais sofisticados para quantificar deficiências locomotoras em roedores é medir distúrbios de marcha sem restrições overground hora (por exemplo., Pontuação BBB manual ou automatizado passarela). No entanto, as entradas corticais não são necessários para a geração de locomoção base produzidos pelo gerador de padrão central espinal (CPG). Assim, as tarefas de passeio sem restrições testar deficiências locomotoras devido ao comprometimento cortical motor só indiretamente. Neste estudo, propomos um romance, tarefa locomotora pé-posicionamento preciso que avalia entradas corticais para a CPG espinhal. Um peg-way instrumentado foi utilizada para impor tarefas locomotoras simétricos e assimétricos que imitam déficits movimento lateralized. Demonstramos que mudanças de comprimentos inter-stride equidistantes de 20% produzem mudanças nas características de fase postura forelimb durante a locomoção com prefcomprimento do passo errado. Além disso, propõe-se que a passagem assimétrica permite medições de resultados comportamentais produzidos por sinais de controlo corticais. Estas medidas são relevantes para a avaliação do prejuízo após o dano cortical.

Introdução

Morbidade pós-AVC na população sobrevivendo inclui deficiências motoras graves que representam um desafio para a avaliação quantitativa em ambos os seres humanos postar modelos de AVC e animais de comprometimento neurológico ^1. Na situação clínica, essas deficiências motoras são medidos usando critérios subjectivos que são mais sensíveis à deficiência grave em vez de moderada exibiram pela maioria dos pacientes. Da mesma forma, essas avaliações subjetivas de comportamento motor pós-lesão em animais são comuns, por exemplo., A Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) ​​escala locomotora método ^2,3. Embora estes métodos de avaliação subjetivos estão ajudando a tradução entre os estudos de reabilitação da marcha em modelos animais quadrúpedes e os seres humanos, os detalhes de déficits motores associados à atividade de grupos musculares distintos não são avaliados. Além disso, a avaliação da contribuição cortical motor para locomoção, como o culpado putativo de déficit motor em um acidente cerebrovascular,só pode ser obtido indiretamente mesmo usando os mais novos métodos quantitativos automatizados ^4,5, como eles confiam em campo aberto ou tarefas de passeio lineares. Estas tarefas não requerem contribuição cortical e pode ser realizado por mecanismos neurais da medula espinal, animais ou seja, o gerador padrão central (CPG) de rede que é poupado na maior parte dos modelos animais de lesão neural, por exemplo, spinalized ^{6 -. 8.} . Cortical contribuição essencial para estes mecanismos espinais foi experimentalmente implicado em tarefas que requerem previstos ajustes posturais ⁹ e atingindo ^10, bem como ¹⁰ precisa pisar.

Além disso, a maioria dos danos neurológicos é assimétrico; por exemplo, acidente vascular cerebral provoca hemiparesia, ou seja, fraqueza em um lado do corpo, o que resulta em uma marcha assimétrica ^{11 -. 14.} A assimetria da marcha hemiplegia é produzido por spatiotempor assimétricaativação muscular al manifestado de forma mais significativa no encurtamento da fase de apoio associadas ao extensor e o alongamento da fase de balanço associada ao flexor do ciclo de passo no lado parético ^15,16. Esta tendência ainda não foi explorado através de uma gama de velocidades de locomoção em animais saudáveis ​​ou paréticos. No estudo actual, se a análise das características de duração da fase ¹⁷ que descreve a relação entre a duração das fases de batente ou postura como uma função da duração do ciclo em cada passo. O modelo de regressão linear obtida foi depois adicionalmente descrito com uma análise de assimetria em todos os membros.

Nós relatamos um método de baixo custo romance para avaliar a atividade de descer entradas corticais no sistema motor de animais quadrúpedes com base em uma tarefa precisa pisar locomotor. Esta tarefa é projetado para desafiar o córtex motor, impondo exigências de colocação dos pés sobre uma área natural de velocidades de locomoção. Além, Os requisitos de pé-de colocação são manipulados para desafiar preferencialmente o lado esquerdo ou direito do sistema motor. Em uma tarefa locomotora semelhante, Metz & Whishaw (2009) examinaram as taxas de falhas, o número de passos perdidas na passagem degrau irregular, em ratos. Nosso método é gratuito para este estudo anterior, e detalhes do tipo de controlo na fase de "bem-sucedida" ¹⁸ passos.

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Protocolo

O seguinte paradigma formação emprega a análise de ajustamentos de fase do adulto médio rato Sprague-Dawley. Por favor, garantir que o protocolo aqui descrito está de acordo com as diretrizes de cuidados de animais institucionais. Todos os procedimentos deste estudo foram realizados em conformidade com o Cuidado e Uso Comitê de animal Institucional (IACUC) e Instituto de Laboratório Animal Welfare (OLAW) da Escola de Medicina da Universidade de West Virginia e age de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde para a utilização de experimental animais.

1. Preparação do Equipamento

1. Construir a passarela assimétrica como uma caixa de plástico open-top se preparou com alumínio suporta em cada canto medindo 155 cm x 104 cm (Figura 1). Prepare as bordas superiores da caixa com barras de alumínio com ranhuras em ambos os lados para permitir a colocação do cavilha alternativa, ao longo do perímetro da caixa, de modo que cada PEG consecutiva do mesmo lado define o comprimento da passada.
2. Coloque uma 20 cm x 20 cm em cada canto da plataforma (quatro no total) que separa as condições representadas em cada lado. Esta distância deve ser suficiente para a inclusão da distância percorrida por um único ciclo de passo de rato.
   1. Use cavilhas feitas de alumínio com as dimensões de 20 cm x 1 cm x 0,5 cm. Curvatura da parte superior de cada cavilha de 2,5 cm da ponta para a produção de uma plataforma de colocação dos pés.
   2. Prenda os pinos para as barras estriadas utilizando suportes de deslizamento no interior através de buracos usinados à mesma distância para garantir a nível do posicionamento horizontal. Ajuste posições usando uma chave de fenda e uma régua. Usar uma largura de 1 cm PEG que corresponde aproximadamente ao tamanho médio da pata de rato; cavilhas mais finas ou mais largas ou são desconfortáveis ​​ou aumentar a variabilidade colocação do pé.
3. Manipular a colocação peg em cada lado para produzir uma das três condições precisas desafio stepping.
   1. Produzir uma tarefa locomotora simétrica com um comprimento de passada 15 cm (SL15), definindo a esquerda inter-stride comprimento (l ISL) e direito comprimento inter-passo (r ISL) à metade do comprimento do passo (7,5 cm).
   2. Impor uma condição adicional simétrica (SL12) alterando comprimentos l ISL ISL e r a 6,0 cm.
   3. Produzir as tarefas assimétricos, alterando a distância entre as cavilhas nos lados esquerdo e direito, denominado o comprimento inter-passo. Para desafiar o sistema motor de forma assimétrica, mudar o l e r ISL ISL em 20% para impor comprimentos inter-stride curto quer do lado esquerdo (condição L6R9) ou à direita (L9R6) colaterais. Os 1,5 cm perturbações impor uma l ISL de 6 cm e r ISL de 9 cm para a condição L6R9, ou um l ISL de 9 cm e uma ISL r de 6 cm para a condição L9R6
4. Para os ratos, manter o comprimento do passo para todas as condições, exceto para SL12 em uma preferenciais 15 cm.
5. Por conveniência, atribuir cada lado longo da passarela uma condição assimétrica favorecendo a esquerda ou a rlado ight do assunto, reservando os dois lados curtos para a condição de controle simétrico.
6. Configuração de uma câmara de alta definição com uma taxa de amostragem de, pelo menos, 60 Hz, de modo que a colocação de membros em cavilhas é desobstruída com câmara aponta perpendicularmente para a passagem com o campo de visão que abrange cerca de 7 passos. Os primeiros e últimos passos na proximidade de plataformas são ignorados.

2. Formação sobre Aparelho

1. Por favor, use os recursos de treinamento padrão, por exemplo., Formação NIH em Biomethodology Basic for laboratoriais Rats, para se familiarizar com a formação geral do comportamento dos roedores.
2. No início do treinamento, aclimatar assuntos, colocando e recompensando-os na plataforma cm 20 x 20 para, pelo menos, 5 min. Em seguida, orientar os animais em todo um arranjo peg com um 1 cm de comprimento inter-passo para a próxima plataforma pela apresentação de uma recompensa alimentar. Recompense animais verbalmente e com carinho para alcançar a plataforma.
3. After 5 corridas de treinamento, espaço os pinos um extra de 1 - 2 cm de distância e executam os próximos 5 corridas de treinamento. O número de repetições aqui listada é suficiente para produzir o tamanho da amostra estatisticamente apropriado (20 - 35 passos).
   1. Se o animal adquire a tarefa mais lentamente como julgado por consistência de stepping (sem parar) e postura (costas arqueadas), então o foco de treinamento sobre o reforço destas competências nos comprimentos stride curtas (S12) antes de retomar a formação sobre as longas passadas ( S15), eventualmente, aproximando-se do comprimento do passo desejado.
   2. Se o novo espaçamento induz ansiedade ou desconforto com a tarefa, reajustar as estacas para a configuração anterior e repetir o paradigma de formação.
   3. Prossiga com esse treinamento até que os comprimentos inter-stride apropriados sejam alcançados para os quatro condições e padrões locomotores são cumpridos. Em nossa experiência, os ratos respondem bem ao estímulo vocal como pistas para iniciar um julgamento. O teste pode ser feito no mesmo dia como a formação fornecidaos indivíduos são motivados para executar a tarefa.
      Nota: Os padrões locomotores são os seguintes: a caminhada é consistente e não envolve paradas ou passos em falso; cabeça-sacudir-se é mínimo; a volta é arqueado ea cauda é levantada durante a locomoção; cada membro é claramente visível a partir de uma vista ortogonal da passarela no início e término da fase de apoio. Esse processo de seleção é essencial que o presente estudo se concentra apenas em uma caminhada ao invés de outro comportamento trote.

3. Teste e Análise de Dados

1. Os animais de teste em tarefas S12, S15, L9R6, e L6R9 (descritos no ponto 1.3) usando o design sessão randomizado. Use pausas para evitar adaptação dentro de uma tarefa.
2. Grave sessões com câmera de alta definição com uma taxa de amostragem de pelo menos 60 Hz. Importação gravações de vídeo sem re-amostragem em software de edição de vídeo e selecione somente as lutas de passeio para análise posterior.
3. Mark inícios e remissões de fases cinemáticasem gravações de vídeo de cada assunto.
4. Aqui, utilize o chamado Vídeoa software personalizado escrito em Matlab para identificar manualmente o tempo de início postura e deslocamento para cada membro em uma base quadro-a-quadro, onde início posição é indicada pela perda de borrão de movimento associado com a colocação dos membros em uma estaca, e postura offset, que ocorre no início do membro lift-off, é indicada pela primeira evidência de borrão de movimento.
5. Calcule a duração da fase de balanço como o tempo restante entre dois inícios postura cinemáticas consecutivos. Excluir qualquer comportamento não é consistente com o andar quadrúpede overground, por exemplo., Quando marcha contém uma fase oscilante duplo (ambos os membros ou membros posteriores do chão), a partir de análises de processo.
6. Traça-se a duração de cada fase, em função da duração do ciclo de passo correspondente. Capture a relação com o modelo de regressão linear (Tphase = B1 + B2 * Tc) obtidos para cada membro, onde Tc é a duração do ciclo, e é TphaseTe postura ither relacionados com extensor ou Tf, que é o balanço relacionadas com flexor, e B1 e B2 são constantes empíricas (offset e inclinação) do modelo de regressão.
   Nota: O declive (B2) representa o valor da mudança na duração da fase com a mudança de velocidade de locomoção.
7. Use Equações 1 e 2 (Figura 2C) para cada membro, para calcular o índice de assimetria (IA). Ambas as equações têm a mesma forma de uma razão simples que normaliza a diferença de dois valores para a sua soma.
   1. Usando a Equação 1, calcule a diferença horizontal (AI _h) que usa a diferença entre encostas de modulação posição esquerda (l) e direita (r) nos membros. Da mesma forma, calcular a assimetria vertical (AI _v) usando os declives da frente / anterior (A) e de volta / posteriores (p) membros. O resultado da aplicação dessas duas equações é o conjunto de dados de 4 pontos xy correspondentes a 1), membro anterior assimetria AAI _h; 2) assimetria dos membros posteriores, pAI _h; 3) deixou assimetria forelimb-hindlimb, Lai _v; 4) assimetria forelimb-membro posterior direito, Rai _v.
   2. Traçar estes valores como um patch (Figura 2B) para a representação visual de assimetria em todos os membros.
8. Calculam índices diagonalidade (DI) para avaliar acoplamento diagonal entre parâmetros de um membro anterior e membro posterior contralateral sua (Equação 3, Figura 2C).
9. Teste o DI, assim como a diferença de quatro AIs entre as condições de opor assimetria (ΔAI = | AIL9R6 - AIL6R9 |) para significância estatística usando uma ANOVA de uma via com a comparação post-hoc de meios de análise ¹⁹

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Resultados

A Figura 2 mostra a análise de assimetria durante as tarefas locomotoras para um único objecto representativo. Os valores foram calculados para todas as condições usando a equação 1 e 2 a partir de todos os sujeitos individualmente (Figura 2) e a partir de dados compósitos de 8 ratos fêmea Sprague-Dawley (250 - 400 g, a Figura 3). Geralmente, a modulação da fase de apoio do membro anterior foi menor para o lado...

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Discussão

The rationale for this study was to develop a behavioral task that quantitatively assesses the changes in precise control of asymmetric locomotor behaviors. The existence of the spinal CPG has been functionally demonstrated for some time²⁰, but the anatomical and functional characteristics that describe its mechanism as well as its modulatory inputs from descending or sensory feedback pathways have not been characterized until the past decade^6,21,22. The current consensus is that the intrinsic spina...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB® R2013a	MathWorks		Design platform for custom videoa video annotation software
Sony HDR-CX380/B High Definition Handycam	Sony	27-HDRCX330/B	Video acquisition device.
Jif Creamy Peanut Butter - Gluten Free 454 g	J.M. Smucker Company		Food reward stimulus.
Sucrose Tablet - Chocolate 1800 g	TestDiet	1811256	Food reward stimulus.
Manzanita Wood Gnawing Sticks	BioServe	W0016	For presentation of food reward stimulus.