Protocolos para Robust Teste de resistência a herbicidas em diferentes espécies de plantas daninhas

Resumo

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Resumo

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

Introdução

Os herbicidas são a medida controle de plantas daninhas mais amplamente utilizado, sendo responsável por até 50% do mercado global de proteção de plantas ^1. Eles são ferramentas relativamente baratas, evitar práticas de cultivo do solo e demorado de trabalho intensivo, e, finalmente, resultar na produção de custo-eficaz, segura e rentável comida ^2. No entanto, a grande variabilidade genética fenológico e presente em muitas espécies de plantas daninhas, em conjunto com um excesso de confiança no uso de herbicidas, freqüentemente resulta na seleção de populações de plantas daninhas resistentes a herbicidas. A introdução de herbicidas selectivos com um alvo metabólica muito específico ^3-5 aumentou dramaticamente o número de casos de resistência ao longo dos anos. Até o momento, 240 espécies de plantas daninhas dicotiledôneas (140 e 100 monocotiledôneas) no mundo todo desenvolveram resistência a diferentes herbicidas Sites de Ação (SoA) ^4. Esta é uma grande preocupação para manejo de plantas daninhas e mais em geral, para a produção agrícola sustentável.

e_content "> A detecção precoce da resistência, com base em testes confiáveis, freqüentemente realizados em casa de vegetação, é um passo fundamental para manejo de ervas daninhas resistentes a herbicidas. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas de acordo com os objectivos, necessário nível de precisão, o tempo e os recursos disponíveis, como bem como as espécies de ervas daninhas considerados ^12/06. No entanto, quando é requerida a confirmação do estado de resistência de um novo biótipo de ervas daninhas (isto é, um grupo de indivíduos que partilham várias características fisiológicas, incluindo a capacidade de sobreviver a um ou mais herbicidas pertencentes a um grupo particular utilizado a uma dose que normalmente controlá-los), uma planta inteira robusta bioensaio tem de ser realizada num ambiente controlado, ^{4, 11.}

Um biótipo raramente é resistente a apenas um herbicida. Cada biótipo é, portanto, caracterizada por um determinado padrão de resistência, isto é, o número e tipo de SOA dos herbicidas é resistente a, e por uma dada resistêncianível de cada herbicida ^13. A determinação precoce e confiável do padrão de cruz ou resistência múltipla ^{5, 14} é importante para o manejo da resistência de campo.

Vale ressaltar que a resistência a herbicidas tem nada a ver com a tolerância natural que algumas exposições de plantas daninhas em relação a alguns herbicidas, por exemplo, espécies dicot vs. herbicidas inibidores da ACCase, espécies monocotiledôneas vs. 2,4-D, Equisetum arvense vs. glifosato.

Este artigo apresenta uma abordagem robusta para testar biótipos resistentes a herbicidas putativo amostradas em campos onde mau controle por herbicida (s) haviam sido relatados. Variantes relevantes para os protocolos padrão em relação às espécies de plantas daninhas envolvidos são apresentados. As vantagens sobre as técnicas alternativas / protocolos baseados em inteiros quer bioensaios vegetais utilizando apenas uma dose de herbicida ^15, ou o tratamento de sementes em placas de Petri de ⁸ estão relacionados com a maior reliability e inferir a possibilidade de o nível de resistência devido à inclusão de duas doses do herbicida nas experiências. No entanto, para o teste de resistência de rotina, os mesmos métodos podem ser aplicados no apenas uma dose do herbicida, assim reduzindo os custos.

Bem como permitindo a confirmação do estado de resistência, a informação obtida pode ser usada para optimizar tanto as seguintes etapas de pesquisa e / ou a concepção de estratégias de gestão da resistência de som.

Protocolo

1. As sementes de amostragem e armazenamento

1. Monitorar campos cultivados para injustificada mau desempenho herbicida, ou seja, não devido a condições climáticas desfavoráveis ​​ou a tratamentos herbicidas de baixa qualidade.
2. Coletar uma amostra de sementes de uma espécie de cada vez e atribuir um código único. As sementes maduras são geralmente recolhidos antes da colheita das culturas de plantas que haviam sobrevivido ao tratamento (s) herbicida. Monitor de oportuna para observar se as sementes são derramadas por planta mãe quando maduro.
3. Preencher um formulário para cada amostra, indicando o código único atribuído, o nome da espécie, data da coleta, coordenadas GPS, município, nome do fazendeiro, tamanho do campo, nível de infestação, colheita, herbicida (s) utilizados durante a temporada e registros históricos do campo .
4. Coletar sementes de pelo menos 30 plantas selecionadas aleatoriamente, que sejam representativas da infestação campo. Certifique-se de que a amostra de sementes contém pelo menos 5.000 sementes maduras. Para um obrigatórios de cruzamento espécies de plantas daninhas(Por exemplo, Lolium spp. Ou Amaranthus spp.), Reduzir o número de plantas a 10-15, mantendo-se o número total de sementes em torno de 5000 ^11.
5. Sub-provar o campo se manchas de ervas daninhas estão espalhados em grandes áreas (mais de um hectare) como diferentes biótipos resistentes a herbicidas são selecionados.
6. Armazene sementes em sacos de papel sem lacre marcados com o código único atribuído.
7. Permitir que a umidade evapore, mas não exponha sementes a alta temperatura (isto é, evite deixá-los em um carro sob o sol) ou a flutuações extremas de temperatura para evitar a indução de dormência secundária.
8. Limpo (remover palha, sementes de-casco, etc.) e armazená-los à temperatura ambiente em um quarto seco. Após a realização dos testes de resistência primeiros, armazenar as sementes por longos períodos de tempo em um quarto escuro a 4 ° C, de preferência em selado a vácuo sacos de plástico. Em desta forma preservar a sua viabilidade das sementes por um tempo significativamente maior.

2. Semente quebra de dormência

NOTA: dormência das sementes fornece um mecanismo flexível e eficiente que permite que as ervas daninhas se adaptar e persistem em agro-ecossistemas. Para quebrar a dormência e permitir a germinação de sementes, protocolos diferentes têm de ser utilizados dependendo das espécies de ervas daninhas, isto é, o tipo de dormência ^16.
Existem três maneiras principais para remover dormência:

1. Vernalização
   NOTA: Para obter germinação e emergência das plântulas em simultâneo, um período de vernalização semente que varia de alguns dias a uma semana é necessária para remover dormência fisiológica de muitas espécies.: Por exemplo, Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fátua, persicaria Polygonum , Phalaris paradoxa ^17-19. É necessário um longo período de até 15 dias para rhoeas, difformis Cyperus e Ammania coccinea e até 30 dias para Schoenoplectus mucronatus 20.
   1. Coloque um pouco de água deionizada em pratos de plástico. Corte duas camadas de papel de filtro e mergulhe-os em água, retire todo o excesso. Coloque as sementes secas ao ar no papel. Transferir as placas de plástico para um frigorífico a 4 ° C durante o período de tempo requerido.
2. Escarificação
   NOTA: Algumas espécies de plantas daninhas são mais recalcitrante a germinação do que outros devido a dormência mecânica, ou seja, características do revestimento de semente, e exigir a utilização de uma escarificação química usando ácido sulfúrico a germinar ^21.
   1. Prepara-se uma proveta com ácido sulfúrico concentrado (95-98%). Prepare um copo cheio de água. Coloque as sementes num envelope de tecido não-tecido.
   2. Soak, por exemplo, Echinochloa spp. Sorghum halepense ou sementes durante 20 minutos ou 5 minutos, respectivamente, em ácido sulfúrico concentrado.
   3. Pegue o envelope para fora do copo usando um par de pinças e colocá-lo no copo cheio de água. Abra oenvelope, coloque as sementes em um pequeno coador e lave-os com água corrente.
   Variante: A. plantago-aquatica precisa de um protocolo diferente ^{de 22, 23}
   1. Embeber as sementes durante 2 min em clorofórmio. Lave as sementes com água deionizada e seque-os com papel absorvente. Húmido das sementes em ácido sulfúrico 80% durante 5 min.
   2. Coloque as sementes em um pequeno coador e lave-os com água corrente.
3. Maturação das sementes pós-colheita
   NOTA: Sementes de outras espécies de plantas daninhas não germinam em tudo por alguns meses após o vencimento, independentemente do método utilizado para quebrar a dormência.
   1. Armazenar as sementes por um período de, pelo menos, 3-4 meses à temperatura ambiente e baixa umidade e siga os protocolos acima para quebra de dormência (por exemplo, Oryza sativa var. Sylvatica ou P. rhoeas).

A germinação 3. Semente

1. Coloque as sementes de ser germinadas em plastic pratos contendo 0,6% (v / m) de ágar com nitrato de potássio a 0,1% (KNO ₃₎ adicionado:
   1. Prepara-se uma solução de agar a 0,6% + 0,1% de KNO ₃ usando água desionizada. Dissolve-se o ágar em um forno de microondas.
   2. Despeje a solução agar em pratos de plástico. Arrefecer o substrato e, em seguida, colocar nas sementes.
   Variante: O solo pode também ser utilizado como um substrato em pratos de plástico. Esta prática é particularmente eficiente para Echinochloa spp., S. halepense e Lolium spp.
2. Coloque pratos de plástico em uma câmara de germinação por cerca de uma semana com luz e temperatura condições, dependendo das condições óptimas para cada espécie de erva daninha. Para a maioria das espécies de inverno, a temperatura é 15/25 ° C dia / noite e 12 horas de fotoperíodo com tubos de néon proporcionando uma densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) de 15-30 mol m ^-2 s ^-1. Para muitas espécies de verão, a gama de temperaturas é de 15/30 ° C dia / noite.
   Variante: Some espécies, tais como S. halepense, precisa de um tratamento térmico. Portanto, após a escarificação, as sementes de S. halepense são submetidos às seguintes condições: ciclos de 4 horas a 45 ° C e 20 h a 24 ° C durante três dias no gabinete de germinação, e, em seguida, três dias em condições normais.

4. das mudas e Crescimento

1. Transplante de quinze a vinte mudas em bandejas plásticas (325 x 265 x 95 mm) carregada com uma mistura padrão de envasamento (60% solo franco silty, 15% de areia, 15% e 10% agriperlite turfa - por volume).
   NOTA: O transplante, em vez de sementeira directa, permite um suporte uniforme de plantas, na mesma fase de crescimento a ser obtido, que é um importante pré-requisito para optimizar o rendimento do tratamento com herbicida.
2. Identificar cada bandeja com um código de barras, incluindo todas as informações para a identificação única: Código população, herbicida que está sendo testado, replicar número e número da bandeja progressiva <./ Li>
3. Coloque as bandejas em uma aquecida com efeito de estufa e água plantas como necessários para manter o substrato em ou perto de capacidade de campo.
   NOTA: A temperatura de crescimento varia dependendo das espécies de ervas daninhas. Muitas vezes, os testes são feitos durante o outono / inverno / primavera, para que a luz é completada utilizando lâmpadas de 400 W halógenas, que fornecem uma PPFD de cerca de 150 mol m ^-2 s ^-1 e fotoperíodo de 12 h ^{24, 19} espécies de plantas daninhas. Verão com C ₄ ciclo fotossintético geralmente exigem maior intensidade de luz e, portanto, os testes são feitos no final de primavera-verão ou a intensidade da luz é completada cerca de 400 mol m ^-2 s ^-1 com um fotoperíodo de 14 horas.
4. Use um protocolo diferente para algumas espécies de plantas daninhas que infestam o arroz em casca, por exemplo, A. plantago-aquatica, S. mucronatus e C. difformis, tal como descrito em ^22.
   1. Transplante as mudas em bandejas de poliestireno com 24 células redondas (55 mm de diâmetro, 64 mm de profundidade) filliderou com 60% solo franco silty, 30% de areia e 10% de turfa (em volume).
   2. Definir as bandejas 12 centímetros em recipientes de plástico cheios de água profundas e battened para baixo por hastes de aço inoxidável para impedi-los aparafusadas flutuante (Figura 1).
   3. Manter o nível de água nos recipientes em 1-2 cm abaixo do nível da superfície do solo e adicionar 1,5 g de sulfato de cobre para cada recipiente (que contém 10-12 L de água) para evitar a proliferação de algas.

5. tratamentos herbicidas

1. Os tratamentos com herbicidas pré-emergentes:
   1. Após cerca de três dias na câmara de germinação, conforme descrito na seção 3, transplantar as sementes germinam em bandejas plásticas contendo substrato descrito acima e cubra com uma camada de solo (cerca de 1 cm). Este é um passo crítico para assegurar que as plantas não vão emergir devido ao efeito herbicida em vez de uma profundidade de enterramento excessiva.
   2. Leve o substrato para o campo capacidade, colocando os tabuleiros, que têm alguns furos na parte inferior, sobre discos cheios de água.
   3. Um dia após o transplante, tratar as bandejas com o herbicida pré-emergência ^25.
   4. Manter o substrato na ou perto da capacidade de campo por adição de água conforme necessário, tanto a partir de cima e abaixo, por capilaridade a partir do disco. Este procedimento favorece a permanência do herbicida na profundidade apropriada (isto é, onde as sementes em germinação são) para uma boa eficácia do tratamento.
2. Os tratamentos com herbicidas pós-emergentes:
   1. Spray de plantas quando atingem a fase de 2-3 folhas (isto é, fase de crescimento 12-13 da escala de crescimento BBCH estendida ^26).
   2. A partir do dia após o tratamento, defina o sistema de irrigação de acordo com as necessidades de água das espécies de plantas daninhas e da época (por exemplo, para Echinochloa spp. Que fornece água para 3 min 4 vezes por dia, em intervalos regulares, das 9 horas às 9 pm). A água é disbuído usando um sistema de irrigação por aspersão automática.
      Variante: glifosato é aplicada na planta fase BBCH 14-21.
3. Preparação herbicida e distribuição.
   NOTA: Todos os herbicidas (pré e pós-emergência) são aplicadas como formulações comerciais com surfactantes recomendadas em duas doses, dose recomendada campo (1x) e três vezes que (3x).
   1. Se necessário, preparar a solução de agente tensioactivo em massa de acordo com as instruções do rótulo; a concentração final é normalmente expresso como uma percentagem do volume final (por exemplo, 0,3%) ou como o volume a ser distribuído por unidade de área (por exemplo, 1 L ha ^-1).
   2. Utilizar a solução de agente tensioactivo, como solvente para a solução de herbicida (soluto) de modo a manter a concentração correcta do ingrediente activo. Preparar a solução herbicida mais concentrada primeiro (3x). Calcular a quantidade do produto comercial para ser dissolvido na solução de agente tensioactivo (ou em água desionizada se umtensioactivo não é necessário) usando a seguinte equação:
      Dose _erva = [(Dose Dose _campo x _max) x V _aleta] / V _del
      Onde: Dose _erva = dose de herbicida (ml), de dose Dose _campo = campo herbicida (ml ha ^-1), Dose _Max = dose máxima entregue, V _fin = volume final da solução (l), V _del = volume entregue pela Pulverizador banco (L ha ^-1).
   3. Diluir (2: 1, v / v) a solução 3x herbicida para preparar o menos concentrada (1x). Este procedimento reduz a chance de cometer erros quando pesagem ou pipetando os herbicidas. Concentração da solução herbicida é expressa como o volume a ser distribuído por unidade de área (L ha ^-1).
   4. Iniciar a sequência de tratamento com a dose de herbicida inferior (1x). Desta forma não há necessidade de lavar o armário de pulverização entre dois tratamentos com o mesmo herbicida.
   5. Distribua o solutio herbicidan, usando um pulverizador de banco precisão entregar 300 L ha ^-1 (± 1%), a uma pressão de 215 kPa e uma velocidade de 0,75 m ^seg-1, com um braço equipado com três ventoinha plana (faixa estendida) bicos hidráulicos .
   6. Lave o gabinete de pulverização duas vezes quando o herbicida é alterada utilizando água sanitária 1% (v / v) e depois enxaguar.
      Variante: glifosato é aplicado com um volume de calda de 200 L ha ^{-1 27.}
      NOTA: Particular atenção tem de ser pago quando herbicidas altamente biológicos, como o sulfometuron sulfoniluréias ou flazasulfuron, são usados. Neste último caso, fazer uma lavagem com uma solução alcalina e um outro com amónia (2,5% v / v), seguido de uma lavagem cuidadosa com água.

6. Coleta e análise dos dados

1. Através de um leitor de código de barras, que identifica automaticamente cada bandeja, gravar o número de plantas que sobreviveram ao tratamento, bem como a biomassa Visual estimado (VEB). As plantas são assEssed como sendo mortos se eles não mostram o crescimento ativo independentemente da cor ou outra aparência.
   1. Faça a avaliação de três ou quatro semanas após o tratamento (WAT), dependendo dos herbicidas testados (por exemplo, três WAT para os inibidores de ACCase e quatro WAT para os inibidores de ALS ou glifosato).
   2. Avaliar a eficácia do tratamento geral, incluindo uma população suscetível (verifique S) em todos os experimentos, ou seja, uma população coletada em um site que nunca ou raramente tratado com herbicidas era.
   3. Expresso de sobrevivência das plantas, como percentagem do número de plantas tratadas, contado imediatamente antes do tratamento herbicida, e calcular o erro padrão (EP) por valor médio (valor das duas repetições média).
   4. O VEB é obtido através de uma comparação visual de biomassa vegetal entre tratados e não-tratados de verificação da mesma população ^{25, 28.} Um escore, variando de 10 para as plantas não afetadas pelo herbicida (em comparação com o check-tratados não) para 0 quandoas plantas são claramente morta, é dada a cada bandeja tratada.
2. Populações atribuir a quatro categorias com base nos resultados obtidos a partir dos tratamentos com duas doses de herbicida: S, quando menos do que 5% das plantas sobreviveram os 1x dose do herbicida, quando SR sobreviventes variou de 5% a 20% em 1x dose do herbicida, quando mais do que R 20% das plantas sobreviveram os 1x dose do herbicida e RR sobreviventes quando são mais do que 20% na dose de herbicida 1x e mais do que 10% na dose de herbicida 3x ^17.

Resultados

Para avaliar o estado de resistência de uma população resistente putativo, é fundamental para incluir um controlo susceptível no ensaio, a fim de verificar a eficácia do herbicida. Os resultados de um teste de rastreio realizados em P. populações rhoeas, uma erva daninha infestante campos de trigo, são relatados na Figura 2, onde a eficácia de quatro herbicidas em pós-emergência sobre um cheque suscetível (09-36) e sobre a suspeita de um resistente (10-91) são apresentado...

Discussão

Várias medidas no âmbito dos protocolos são críticos para uma avaliação bem sucedida de resistência a herbicidas em uma população: 1) sementes devem ser coletadas quando madura a partir de plantas que sobreviveram ao tratamento (s) herbicida. Maturação das sementes na planta mãe é crucial para evitar dificuldades na germinação das sementes mais tarde; 2) É recomendado o armazenamento adequado das sementes para evitar a proliferação de fungos que possam impedir a germinação; 3) mudas devem ser tratada...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper bags	Celcar SAS
Plastic dishes	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparent plastic
Sulfuric acid 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Non-woven fabric	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Weight 17 g m-2
Chloroform >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Potassium nitrate >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
Plastic containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Plastic trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyrene trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)
Copper sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas	AGRI100
Peat	Blu Agroingross sas	TORBA250
Germination cabinet	KW	W87R
Nozzles	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	The second type of nozzles are used only for glyphosate
Barcode generator	Toshiba TEC	SX4
Labels with barcode	Felga	TT20200	Stick-in labels with rounded corners
Barcode reader	Cipherlab	8300-L	Portable data terminal
Bench sprayer			Built in house
Herbicides included in the results:
Commercial product	Active ingredient	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact to be used with Hussar WG
Dash		BASF	Surfact to be used with Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyphosate	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact to be used with Granstar and Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro