Instilação e fixação métodos úteis no mouse Lung Cancer Research

Resumo

O objetivo deste artigo é descrever métodos simples que vai ajudar muito na configuração e análise dos pulmões do rato com câncer de pulmão ou outras patologias. Nós apresentamos 3 protocolos simples e confiável para realizar injeções de pulmão, fixação e medidas de volume pulmonar.

Resumo

A capacidade de incutir agentes vivos, células ou produtos químicos diretamente para o pulmão sem ferir ou matar os ratos é uma ferramenta importante na investigação do cancro do pulmão. Embora haja um certo número de métodos que foram publicados mostrando como a entubar ratinhos para medição da função pulmonar, nenhum é sem problemas potenciais para instilação traqueal rápida em grandes grupos de ratinhos. No presente trabalho, um método simples e rápida é descrito que permite que um investigador para realizar tais injeções de uma maneira eficiente. O método não requer ferramentas especiais ou de iluminação e pode ser aprendido com muito pouco prática. Trata-se de anestesia de um rato, fazendo uma pequena incisão no pescoço para visualizar a traqueia, e em seguida a inserção de um cateter intravenoso directamente. A pequena incisão é fechada rapidamente com adesivo de tecido, e os ratos são deixados a recuperar. Um estudante qualificado ou técnico pode fazer instillations a uma taxa média de 2 min / mouse. Uma vez que tele câncer é estabelecida, há freqüentemente uma necessidade de análise histológica quantitativa dos pulmões. Tradicionalmente patologistas normalmente não se preocupam em padronizar a inflação do pulmão durante a fixação, e as análises são muitas vezes baseadas em um sistema de pontuação que pode ser bastante subjetiva. Embora isso possa ser suficiente em algum momento adequado para estimativas grosseiras do tamanho de um tumor do pulmão, qualquer quantificação estereologia adequada de estrutura pulmonar ou células requer um procedimento de fixação e reprodutível de medição do volume pulmonar subsequente. Aqui nós descrevemos procedimentos confiáveis ​​simples para ambos, que fixa os pulmões sob pressão e, em seguida, medir com precisão o volume de pulmão fixo. O único requisito é uma balança de laboratório que é preciso ao longo de uma gama de 1 mg-300 g. Os procedimentos aqui apresentados, portanto, poderia melhorar significativamente a capacidade de criar, tratar e analisar os cânceres de pulmão em camundongos.

Introdução

Por uma série de razões, o câncer de pulmão não tem sido amplamente estudada no mouse. Uma razão para isto é que o acesso ao pulmão é muito difícil in vivo, e a análise quantitativa de pulmão fixo não é normalmente feito. Os métodos descritos neste artigo são projetados para remediar esta situação. Os objetivos aqui são para descrever métodos simples que vai ajudar muito na configuração e análise dos pulmões do rato com câncer de pulmão ou outras patologias. Embora nenhuma dessas abordagens são inteiramente novas, que não tenham sido apresentadas em conjunto como métodos autônomos na forma simplificada, tal como descrito aqui.

Tem havido um grande número de manuscritos que foram descritos métodos para a intubação do pulmão do rato principalmente com a finalidade de fazer a função pulmonar de repetição ou lavado bronco-alveolar em camundongos individuais em estudos longitudinais. Desde que o papel original, houve vários outros documentos que descrevem abordagens diferentes para mouse intubação ^{1 -9.} Apesar de todos esses métodos podem ser usados ​​com sucesso, eles geralmente exigem formação considerável, e não são muitas vezes sem uma taxa de falha não trivial. Além disso, a fim de efectuar as medições da função pulmonar, a cânula tem de se encaixar na traqueia força suficiente de modo que não há nenhuma fuga de ar. No entanto, um outro uso prático para a entubação é a entrega de agentes específicos (células de cancro ou outros insultos) ou fármacos terapêuticos directamente para o pulmão. Tal procedimento não requer uma cânula apertadas nem qualquer equipamento sofisticado de função pulmonar. A nova característica deste método mostrado aqui envolve um pequeno procedimento cirúrgico que permite que a intubação sem qualquer possibilidade de a cânula entrar no esófago. Esta abordagem simples permite intubação bem sucedida com relativamente pouco treinamento ou experiência. Como muitos como 30 ratinhos / h pode ser tratada usando esta abordagem com uma taxa de falha próximos de zero.

Uma vez que tele ratos estão prontos para serem sacrificados, os pulmões ou feridas cancerosas podem, então, ser removida para análise histológica e patológica. No entanto, a fim de quantificar adequadamente todas as variáveis ​​histológicas para comparação com outros pulmões, é essencial para padronizar os procedimentos de fixação e quantificar correctamente o volume de pulmão ^fixo 10. Este artigo descreve em detalhes os procedimentos simples que permitem que os processos de fixação padronizados, bem como uma maneira de medir o volume pulmonar fixa. O volume é uma métrica essencial na quantificação da histologia, uma vez que sem um tal determinação do volume, apenas densidades relativas pode ser medida ^10. Uma vez que o volume do pulmão é conhecido, no entanto, as medições absolutas de células e outras medidas estruturais no pulmão pode, então, ser quantificada.

Protocolo

O protocolo seguinte descreve um sistema que funciona bem em 20-35 g ratinhos. O método pode ser facilmente adaptável a ratinhos maiores ou menores simplesmente mudando o tamanho do cateter. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Johns Hopkins University Animal Care e Use.

1. A instilação pulmonar

1. Selecione um comercial de uma polegada de comprimento 20 g cânula intravenosa usar para a intubação.
2. Modificar a ponta do cateter dobra-lo manualmente para gerar uma ligeira curvatura na ponta como ilustrado na Figura 1.
3. Anestesiar o rato com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), injectada IP, e confirmar a anestesia pela ausência do reflexo do movimento. Aplicar pomada veterinária sobre os olhos imediatamente após a anestesia. Imediatamente após a anestesia aplicar pomada veterinária sobre os olhos e dar carprofeno (5-10 mg / kg SQ) para analgesia pós-operatória e instilação.
4. Coloque o mouse em decúbito dorsal sobre uma plataforma inclinada. Como mostrado na Figura 2, uma grande ligante escritório com laçadas da sutura gravado em funciona perfeitamente bem.
5. Raspar a parte ventral do pescoço e limpar e desinfectar a área do pescoço com álcool 70%. Com as novas luvas de latex e gratuitos a pó, usar instrumentos cirúrgicos desinfetados com álcool a 70%.
6. Usando uma tesoura afiada fazer uma pequena incisão cirúrgica no pescoço aproximadamente 12 mm abaixo do incisivo inferior.
7. Com uma pinça puxe a pele no pescoço caudalmente até que a parede da traqueia ventral pode ser visto.
8. Suavemente retrair a lingueta e inserir a cânula com a ponta dobrada inclinada para a superfície ventral do rato. Como em 1.4, puxe suavemente sobre a pele no pescoço, e inserir a cânula na traquéia.
   NOTA: Com um pouco de prática, o cateter será visível se movendo para baixo na traquéia. Se ele vai no esófago, então não haverá nenhuma observação visual do movimento do cateter. Não há incisõessão feitos na traqueia.
9. Uma vez que o cateter é visto na traqueia no pescoço, avançada que cerca de 5 mm a ser transmitido de forma fiável as cordas vocais, mas ainda bem acima da carina.
10. Prepare-se para incutir até 50 l de líquido injectando através do cateter com uma pipeta de ponta de carga gel. Coloque a ponta no hub luer, mas antes de injetar olhar cuidadosamente para observar o movimento do fluido na ponta síncrona com a respiração do mouse. Em seguida, injetar o instilado.
11. Com uma seringa de 1 ml, imediatamente fazer uma relativamente rápida inflação de 0,6 ml de ar para os pulmões através do cateter para ajudar a distribuir o líquido no fundo dos pulmões. Remover a cânula.
12. Remover a cânula.
13. Use uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato para fechar a pequena ferida cirúrgica, conforme as instruções bula para Vetbond. Coloque os ratos em gaiolas individuais e monitorá-los visualmente até que acordem e se comportar normalmente, sem qualquer indicação de discomfort.

2. Fixação Lung

NOTA: Uma vez que todos os procedimentos experimentais são feitas em um rato, os pulmões pode ser preparado para o processamento histológico pela fixação com formaldeído (ou qualquer outro fixador desejado).

1. Sacrifique o mouse com um procedimento IACUC aceitável. Para o rato representativo mostrado no vídeo, deslocamento cervical de um rato anestesiado é usado.
2. Executar uma traqueostomia (se não tiver feito), expondo cirurgicamente o lado ventral da traquéia, fazendo um pequeno corte, e inserindo uma agulha 18 G stub ponta na traquéia, e amarrando-o com fio.
3. Cuidadosamente abra o tórax com uma incisão na linha média, cortar o diafragma, e remover as paredes laterais de tórax para expor os pulmões.
4. Ligar a extremidade do luer da agulha para um reservatório de um suporte de anel contendo formaldeído. Veja a Figura 3.
5. Definir a superfície de topo do formaldeído a 25 cm acima do nível do mouSE. Veja a Figura 3. Em seguida verifique se não há ar na tubulação fixação executando fluido para fora no final de uma torneira. Ligar a extremidade do luer da cânula traqueal para o tubo do reservatório. Abra a torneira para inflar os pulmões com o formaldeído. Deixar os pulmões sob pressão para, pelo menos, 20 min.
6. Abra a torneira para inflar os pulmões com o formaldeído. Deixar os pulmões sob pressão para, pelo menos, 20 min.
7. Em seguida, amarre a traqueia para além do final da agulha topo. Ela pode ajudar a puxar para trás lentamente na agulha para expor mais da traquéia canulados. Quando amarrado com segurança, remova a torneira.
8. Dissecar cuidadosamente para fora dos pulmões.
9. Coloque os pulmões em formol durante a noite. Tempos mais longos são bons, e algumas manchas ou procedimentos podem especificar horários específicos. Além disso, quaisquer outros fixadores líquidos, tais como Z-fix pode ser utilizada para a instilação e imersão.
10. Antes de mais processamento histológico, mediro volume de pulmão fixo, como descrito a seguir.

3. A medição do volume pulmonar fixa

1. Medir o volume pulmonar utilizando o princípio de Arquimedes, conforme ilustrado na Figura 4. Remover o pulmão fixo a partir do formaldeído e dissecar o coração e qualquer outro tecido não-pulmonar.
2. Usar um simples dispositivo de suporte de arame caseiro previamente construído que é usada para manter os pulmões completamente debaixo de água.
   NOTA: Este dispositivo tem de ser compatível com qualquer saldo está sendo utilizado. Um dispositivo típico mostrado na Figura 5 é feita a partir de pipetas de plástico e finos (20 g) do fio. Este sistema funciona bem com o equilíbrio usado no vídeo, mas pode ser facilmente adaptado à maioria das balanças de laboratório.
3. Coloque um copo com ≈200 ml de água sobre o equilíbrio ea tara com a gaiola de apoio no lugar na água. Veja a Figura 6 Retire a gaiola de metal.; coloque o pulmão na superfície da água e pressione sob a águacom a gaiola.
4. Grave o peso na balança. Este número reflecte o volume de água deslocado e é assim uma medida directa do volume do pulmão. Tenha cuidado para garantir que o pulmão ou sutura ou qualquer parte da gaiola de arame não toca nos lados ou no fundo do copo.
5. Para maior precisão, repetir esta medição. Remover o pulmão a partir da água, e seca sobre um tecido. Convulsionou o copo com gaiola no lugar novamente e repita a medição do volume pulmonar. As duas medições de volume deve então ser calculada a média.
   NOTA: Se os pulmões são deixados no formalina para mais do que cerca de uma semana, o ar nos pulmões irá ser dissolvido no líquido. Quando isto acontece, o pulmão irá afundar-se, por isso, já não é necessária a utilização de qualquer dispositivo, tal como na Figura 5 para manter o pulmão submerso. Em tais casos, o volume pode ser medido por simplesmente segurando o pulmão por um dos fios de sutura, até que esteja completamente submerso tal como ilustrado na Figura 4.

Resultados

O procedimento descrever no primeiro protocolo não por si só levar a qualquer resultado generalizadas. Ele descreve somente um meio muito fiáveis ​​para incutir substâncias directamente na traqueia. A Figura 7 mostra um exemplo de um pulmão em que azul de tripano foi instilado com o método descrito aqui. Há ampla distribuição do corante, semelhante ao que foi observado com outros corantes ou marcadores dadas directamente na traqueia ou ratinhos ^11,12. Também têm utilizado este ...

Discussão

Os procedimentos descritos aqui têm várias vantagens. Primeiro, o equipamento necessário é simples e barata. Em segundo lugar, a intubação pode ser feito rapidamente, com poucos erros. Em terceiro lugar, a capacidade de fixar os pulmões a uma pressão constante, e, em seguida, medir o volume pulmonar fixo permite a quantificação adequada das estruturas ou células no pulmão ^10.

Uma possível desvantagem para a intubação é a pequena cirurgia. Isso pode limitar a capaci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors