A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico

Resumo

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Resumo

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis^13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.

Introdução

O cérebro humano compreende um número estimado de 85 mil milhões de neurónios e mais 85 mil milhões de células não neuronais, incluindo as células da glia ^1. Para a maior parte dos últimos 100 anos os neurocientistas têm focado predominantemente na população de células neuronais, acreditando células gliais ser pouco mais do que as células passivas de apoio que forneceram suporte estrutural para os neurônios - daí a etimologia grega da "glia" traduzido para o Inglês como "cola". Recentemente, no entanto, tornou-se cada vez mais evidente que as interacções neuronais-glial pode ser muito mais fundamental para aspectos básicos da neurobiologia, neurofisiologia, ea gênese e progressão de várias doenças neurodegenerativas. Células do cerebelo granulares (CTC), a população neuronal homogênea mais abundante no cérebro humano, dominar o cerebelo e tornar-se mais de 90% dos seus constituintes celulares. Por conseguinte, estas células têm sido extensivamente usados ​​in vitro, como um sistema modelo para o tele estudo do desenvolvimento neuronal, função e patologia ^2-6.

No entanto, as culturas CGC ainda conter outros microglia e as células da glia em proporções significativas, sem dúvida. Como resultado, os dados que indicam CGC putativamente respostas neuronais directos para tratamentos diferentes de células podem, de facto surgir - em parte ou no total, - a partir da resposta secundária indirecta de células gliais vizinho na cultura. Para avaliar isto, eliminada selectivamente da microglia CGC de culturas neuronais, com o auxílio de éster metílico de L-leucina (LME). LME é um agente lysomotropic originalmente usado para destruir selectivamente macrófagos ^7, e uma vez que tem sido utilizada para esgotar a microglia também selectivamente a partir neural, astrócitos, e culturas gliais mistas ^8,9,10. LME é internalizado pelos macrófagos e microglia, em que ele provoca perturbações lisossômico e apoptose subseqüente ^13,14. Macrófagos e microglia são caracteristicamente rica em lisossomos, fazendo com que sejam particularly vulnerável após a exposição ao tratamento LME. Este protocolo fornece uma maneira poderosa, mas simples e fácil de determinar a contribuição de microglia em experimentos que utilizam outros sistemas de cultura neuronal / CGC e gliais.

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Protocolo

Todos os experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com o Reino Unido Animais (Scientific Procedures) Act, de 1986.

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos

1. Prepare duas tesouras de aço inoxidável laboratório de dissecação e duas pinças de laboratório de aço inoxidável. Autoclave todos os instrumentos e lugar em uma capa de cultura O / N sob luz ultravioleta (UV) para a esterilização.
2. Adicione 500 ml de meio essencial (MEM), meio mínimo de cultura (10% de Soro Bovino Fetal [FBS], KCl 20 mM, 25 mM de NaHCO _3, 30 mM de D-glicose, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 6 ug / ml de ampicilina) e esterilizar filtro. Armazenar a 4 ° C durante meses.
3. Prepare placas de cultura de 24 poços contendo 14 milímetros, número um lamelas de espessura. Autoclave as lamelas e revestimento em 100 mg / L de poli-d-lisina (PDL) como previamente descrito ^3. Luz UV esterilizar O / N.

2. Preparação de Soluções CGC Cultura

1. Prepare 'Uma solução de' (100 ml) em autoclave, a luz UV tratada, estéril dH ₂ O contendo 250 mg de glucose, 300 mg de albumina de soro bovino [BSA], 955 mg de fosfato salino tamponado [PBS] (Ca ²⁺ e Mg ⁺ livre), e 1 ml de 3,8% MgSO ₄ · 7H ₂ O.
2. Prepare a 'solução B' (10 ml) contendo 1 ml de 5 mg / ml de tripsina diluída em 9 ml de solução A.
3. Prepare a 'solução C »(10 ml) contendo 1000 unidades de ADNase, 0,5 mg de inibidor de tripsina de soja, 100 ul de 3,8% MgSO ₄ 7H ₂ O ·, diluída para 10 ml com solução A.
4. Prepare a 'solução D' (20 ml) contendo 3,2 ml de solução C, diluída para 20 ml com solução A.
5. Preparar a solução de BSA / de Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS) contendo EBSS, NaHCO ₃ 25 mM, 3 mM MgSO ₄ · 7H ₂ O, e4% de BSA, pH 7,4, conforme anteriormente descrito ^3.
6. Prepare LME adicionando ácido clorídrico puro LME em 5 ml de meio de cultura MEM para dar uma concentração final de 150 mM de LME, voltar a solução a pH 7,4 usando um medidor de pH de bancada, e filtro de esterilização usando uma sulfona de poliéter 28 milímetros (PES) de 0,2 um seringa filtro.

3. Cultura das CGCs

1. Recolha cerebella 4-7 dias de idade filhotes de ratos, como descrito anteriormente ^3. Colocar imediatamente em placa de Petri contendo 5 ml de solução A em gelo.
2. Deitar fora o excesso de solução de cerebelo e local de tecido na tampa placa de Petri.
3. Pique finamente tecido com uma lâmina de barbear bem-inflamado em pelo menos três direções diferentes.
4. Adicionar tecido picado à solução B (enxaguar placa de Petri com solução de assegurar tecido limitada é perdido), e colocados no banho de água a 37 ° C durante 5 min. Agitar suavemente a cada dois minutos.
5. Adicionar a solução D (20 ml) para o tubo para neutralizar a tripsina, a vibração e centorifuge a 65 xg durante 5 min.
6. Deitar fora o sobrenadante.
7. Ressuspender em 4 ml de solução C. Tritura-se bem (aproximadamente 10 vezes cada) com três pipetas de vidro ardido de diâmetro decrescente, até que a suspensão é mais homogénea possível.
8. Lentamente e suavemente adição de algumas gotas de este homogeneizado no topo da BSA / EBSS. Se ele começa a afundar através do BSA / EBSS, triturar mais e / ou adicionar um pouco mais de solução C. O homogeneizado deve sentar-se em uma camada em cima da BSA / EBSS. Não agite. Gire a 100 g durante 5 min.
9. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento (mole) em 1 ml de meio MEM.
10. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e a placa a 800.000 células / lamela em 500 ul de meio MEM. Colocar numa incubadora a 37 ° C com 6% de CO _2.
11. Mudar o meio do dia seguinte (24-36 horas após a preparação). Adicione uma solução de meio MEM contendo 10 uM do inibidor do ciclo celular arabinofuranosil citidina (AraC).
    1. Para cadalamela, reter 250 ul do meio de idade, em uma nova placa de 24 poços, aspirar o resto, adicione 250 mL de meio MEM normal e aspirar este para lavar as células, em seguida, adicione os 250 mL de meio antigo de volta para as células e top-up com 250 ul de meio contendo AraC.
       Nota: As células podem ser utilizadas a partir de 6 dias in vitro (DIV).

4. seletivamente empobrecem a Microglia (realizada em 6 DIV)

1. Adicionar LME puro para 5 ml de uma alíquota separada de meio MEM para dar uma concentração final de 150 mM LME.
2. Retorne a solução para pH 7,4 e filtro de esterilizar utilizando um polietersulfonas 28 milímetros (PES) filtro de seringa de 0,2 um.
3. Diluir solução a uma concentração de 50 mM (2 x LME) em meio MEM e colocar num banho de água a 37 ^{° C} durante 10 minutos juntamente com meio normal MEM para culturas de controlo.
4. Remover metade (250 ul) a partir de culturas de meio MEM CGC e reter a 37 ° C.
5. Tratar célulascom meio MEM contendo 2 x LME (250 ul), isto é, diluída 1: 1, dando assim uma concentração de 25 mM, ou com meio de pré-aquecido MEM sem LME (250 ul) para culturas de controlo.
6. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 6% de CO ₂ durante 1 h.
7. Lave as células duas vezes em meio de pré-aquecido fresco MEM para remover LME contendo mídia, e, em seguida, substituir o meio de cultura retido e um volume igual de meio de pré-aquecido fresco MEM aos poços correspondentes.
8. Culturas e volta para a incubadora (humidificado com 6% de _CO2 a 37 ° C) e deixar em repouso durante 24 horas antes de qualquer tratamento adicional.

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Resultados

A capacidade desta técnica para eliminar selectivamente a partir CGC microglia e / ou culturas mistas baseia-se na capacidade subsequente do investigador para identificar com precisão e diferenciar microglia das suas células vizinhas. Isto pode ser alcançado utilizando uma máquina de células específicas de microglia, tais como isolectina-B4, tal como ilustrado na Figura 1. Tal como demonstrado na Figura 2, não há alterações observáveis ​​para astrócitos e densidade neur...

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Discussão

Os passos mais importantes para garantir a eliminação seletiva de sucesso de microglia do CGC e / ou culturas mistas são: 1) a manutenção de uma cultura CGC estéril e saudável; 2) filtro de esterilização a forma LME contendo e voltando a solução para pH 7,4; 3) manter os meios de comunicação CGC retidos e LME contendo media a 37 ° C para evitar choque térmico; e 4) a trabalhar rapidamente para reduzir o tempo de células são mantidas fora da incubadora.

Utilizou-...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Sigma-Aldrich	F4142	The curved end facilitates removal of the cerebellum
Micro-dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146	Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection
L-leucine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS solution	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coat coverslips 1 day before use
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T6414
Mouse anti-ED1 antibody	Abcam	ab31630