Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

Resumo

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Resumo

Teste de susceptibilidade antimicrobiana (AST) é realizada para avaliar a actividade in vitro dos agentes antimicrobianos contra várias bactérias. Os resultados da AST, que são expressos em concentrações inibitórias mínimas (MICs) são usados ​​em pesquisas para desenvolvimento antimicrobiana e acompanhamento do desenvolvimento de resistência e no contexto clínico para orientação terapêutica antimicrobiana. Dalbavancin é um lipoglycopeptide semi-sintético agente antimicrobiano que foi aprovado em Maio de 2014 pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da pele e da estrutura da pele infecções bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos. A vantagem de dalbavancin sobre terapias anti-estafilococos actuais é a sua longa meia-vida, o que permite uma dosagem de uma vez por semana. Dalbavancin tem atividade contra Staphylococcus aureus (incluindo tanto sensível à meticilina S. aureus [MSSA] e resistente à meticilina S. aureus [MRSA]), estafilococos coagulase-negativo, Streptococcus grupo anginosus, estreptococos β-hemolíticos e os enterococos sensíveis à vancomicina. Tal como outros agentes lipoglycopeptide recentes, a optimização de métodos de ensaio e de caldo de susceptibilidade do CLSI ISO inclui o uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente quando se preparam soluções de reserva e de polissorbato 80 (P80) para aliviar a adesão do agente de plástico. Antes dos estudos clínicos e durante o desenvolvimento inicial de dalbavancin, estudos de susceptibilidade não foram realizados com a utilização de P-80 e os resultados de MIC tendiam a ser 2-4 vezes mais elevada e da mesma forma superior MIC resultados foram obtidos com o método de diluição em ágar susceptibilidade. Dalbavancin foi incluída pela primeira vez no CLSI tabelas metodologia caldo de microdiluição em 2005 e alterada em 2006 para esclarecer o uso de DMSO e P-80. O procedimento de microdiluição de caldo (DMO) mostrado aqui é específico para dalbavancin e está de acordo com os métodos do CLSI e ISO, com detalhe passo-a-passo e foc-nos sobre os passos críticos para maior clareza.

Introdução

Dalbavancin é um lipoglycopeptide semi-sintético que foi aprovado pela FDA em Maio de 2014 no tratamento da pele e da estrutura da pele infecções bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos ^1. O principal objetivo de detalhar esse método em um formato de vídeo é fornecer uma orientação clara para os cientistas de laboratório e de pesquisa clínica para testes e relatórios de resultados precisos e reprodutíveis dalbavancin suscetibilidade.

A determinação de um agente antimicrobiano MIC por métodos comerciais é realizada rotineiramente em laboratórios clínicos para a avaliação da atividade in vitro de um agente contra bactérias patogênicas. O método descrito aqui é o método de microdiluição do caldo como recomendado pelo CLSI e ISO ^2,3,4. Desde dalbavancin métodos de suscetibilidade comerciais não estão disponíveis no momento (no momento desta publicação) e de difusão de disco e métodos de diluição de agar não são atualmente recomendadas fou dalbavancin, métodos de diluição de caldo de referência são as atuais opções disponíveis ^12,14. Como este método de referência não é um comercial e FDA apuradas in vitro método de diagnóstico, laboratórios de análises clínicas nos EUA que usar este procedimento para testes paciente deve respeitar os requisitos regulamentares para um teste de laboratório desenvolvido (LDT). Prevê-se que como a utilização dalbavancin aumenta, mais laboratórios terá uma necessidade de testar este composto. Vancomicina teste como um substituto para a determinação da susceptibilidade de S. dalbavancin aureus foi validado ^5. No entanto, dalbavancin podem ser activos contra vancomicina S. intermediário aureus (VISA) e, portanto, os médicos podem solicitar resultados dalbavancin MIC. Além disso, pode ser requerida resultados de MIC para as outras espécies bacterianas.

O ponto de interrupção suscetível FDA para dalbavancin contra S. aureus foi estabelecida em ≤0.12 ug / ml. FDA atribuído apenas uma suscepticategoria ble por causa da falta de dados sobre os isolados resistentes. A distribuição normal de MIC entre tipo selvagem S. aureus é entre 0,03-0,12 ug / ml, com uma MIC modal clara de 0,06 ug / ml. Uma ligeira variação nos resultados de MIC, devido ao método de diferença, para além da variação de DMO inerente de ± uma diluição, poderia potencialmente ter um impacto significativo sobre as taxas de susceptibilidade. ⁶ À semelhança de outros agentes lipoglycopeptide, testes de susceptibilidade dalbavancin pode ser um desafio, como resultado de solubilidade e a dimensão relativamente grande da molécula e as suas propriedades de ligação ^7,8,9. O método DMO referência aqui descrito inclui dois passos específicos que são únicas para agentes insolúveis e / ou agentes lipoglycopeptide: (1) a utilização de DMSO, para preparação de soluções de reserva e (2) adição de 0,002% de P-80 no painel MIC definitiva diluições. O objetivo desta publicação de vídeo é fornecer clareza para o método BMD dalbavancin e specifically focar essas etapas-chave, para garantir resultados precisos e reprodutíveis MIC.

Protocolo

Nota: Consulte a documentação do CLSI M7-A10 e M100-S25 e / ou ISO / FDIS 20776-1 Para maiores detalhes sobre o método de referência de microdiluição para susceptibilidade aos antimicrobianos ^{2, 3, 4} Os métodos de referência para permitir opções em alguns dos arquivos. Procedimentos específicos para a preparação do inóculo e painel MIC produção para alcançar o mesmo resultado final. O método descrito aqui refere-se a um agente antimicrobiano, dalbavancin, e alguns dos passos representam uma das várias maneiras potencialmente o procedimento de referência pode ser feito. Precauções de segurança apropriado (consistentes com o nível de biossegurança 2) deve ser utilizado ^10. O formato do painel de MIC usado para os fins da presente publicação de vídeo é mostrado na Tabela 1.

1. Loja Dalbavancin Pó

1. Após o recebimento do diagnóstico pó dalbavancin grau, armazenar a -20 ^{° C} em um ambiente desidratado num congelador non-descongelamento. Antes da utilização, o pó deve equilibrar aRT chegar antes da abertura.

2. Preparar diluições do painel MIC

1. Prepara-se uma solução de reserva não maior do que 1.600 ug / mL de dalbavancin em DMSO puro (puro) em vidro ou plástico tubos estéreis, e utilizar no mesmo dia da preparação ou armazenar a -20 a -60 ^{° C} ou abaixo para utilização futura em um freezer não-descongelamento. Leve em consideração a potência de dalbavancin conforme previsto na documentação recebida com o pó, quando pesando o pó (ver Equação 1, por exemplo, 800 mg / ml de preparação de estoque).
2. Dilui-se a diluição da similar ao esquema como se mostra na coluna 1 ("Concentração Fonte") na Tabela 2 com DMSO puro em vidro ou plástico tubos estéreis. Use uma pipeta para medir diluente e outra pipeta para adicionar o estoque inicial dalbavancin ao primeiro tubo. Para cada concentração estoque dalbavancin posterior usar uma pipeta nova.
3. Prepare 100X última concent painel MICdiluições de racionamento (concentrações intermediárias) com DMSO puro. Como é mostrado nas colunas 2-4 da Tabela 2, combinar volumes apropriados de fonte e DMSO para atingir a concentração desejada (intermediário volumes a serem utilizados dependerá do número de painéis de MIC a ser efectuada).
4. Prepare a 0,004% P80: Prepara-se uma solução fresca de estoque de trabalho de 2% P80 por adição de 0,1 ml de P80 a 4,9 ml de dH ₂ O. Esterilizar por passagem através de uma solução de filtro de 0,22 micron e a utilização, no mesmo dia da preparação. Prepare a 0,004% P80 diluente, fazendo uma diluição 1: 500 de 2% P80 (por exemplo, 0,3 ml de 2% P80 para 149,7 mL de CAMHB).
5. Diluir as concentrações intermédias preparado no passo 2.2 a 1: 100 em catião ajustado caldo de Mueller Hinton (CAMHB), suplementado com 0,004% (v / v) de polisorbato-80 (-80 P) P-80 e / ou LHB (para estreptococos) adicionou com o dobro da concentração final por causa da adição de inoculo (passo 4.3) vai resultar em uma diluição de 1: 2. Ver colunas 6 e 7 do quadro 2 .

3. Prepare Painéis MIC

1. Dispensar 50 ul de cada solução dalbavancin preparado no passo 2.3 em poços apropriados de painel de MIC e incluem meios de num único poço (controlo de crescimento bem). Uma pipeta de multi-canal com pontas estéreis podem ser utilizadas para este passo.
2. Use painéis imediatamente ou selo com filme plástico, coloque em sacos de plástico e colocar imediatamente em um freezer não-descongelação à ≤-20 ^{° C} (de preferência a ^≤-60 o C) até que seja necessário. Se forem utilizados painéis congelados, remover os selos e colocar painéis individuais em bancada de laboratório durante 15-30 minutos (até que o conteúdo bem são descongelados), antes de prosseguir para o painel inoculação.

4. Inocular Painéis MIC, Execute Pureza e Colony Setup Contagem

1. Seleccione várias colónias bem isoladas a partir de um agar de sangue de 18-24 h ou outra placa de agar não selectivas. Toque no topo de cada colônia com uma ansa estéril ou cotonete e transferência para 1-5 ml CAMHB ou sAline até turvação é equivalente a um padrão McFarland 0,5. Avaliar turbidez por comparação visual ao 0,5 McFarland ou com um dispositivo de medição fotométrica.
2. Dentro de 15-30 minutos de preparação, dilui-se o inoculo de 1: 100 em CAMHB (100 ul para 10 ml CAMHB). Para a maioria das bactérias testadas contra dalbavancin, com excepção de S. pneumoniae, esta diluição irá proporcionar uma concentração final do poço de 5 x 10 ⁵ CFU / mL (intervalo aceitável é de 2-8 x 10 ⁵ CFU / mL). Para S. pneumoniae, concentração bacteriana com base na comparação de turbidez McFarland 0.5 para um é tipicamente consideravelmente menor, por conseguinte, diluir a 1:25 inoculo (400 ul em 10 ml de CAMHB + 10% + LHB).
3. Dentro de 15 minutos após a preparação do inóculo, transferir 50 ul do inoculo final a cada poço (com excepção do controlo de esterilidade bem) do painel MIC preparado no passo 3. Uma pipeta multi-canais usando pontas estéreis podem ser utilizadas para este passo.
4. Executar uma verificação de purezapor transferência e espalhamento de uma alíquota de 1-10 ul de controlo positivo de crescimento bem utilizando uma ansa estéril para um meio de ágar não selectivo (por exemplo, ágar de tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha).
5. Configuração do número de colónias, removendo 10 ul do controlo de crescimento bem com uma única ponta de pipeta estéril e canal e transferência para 10 ml de solução salina (1: 1000 de diluição). Misturar e transferir 100 ul com uma única pipeta de canal e ponta estéril para um meio adequado, não selectivo de agar (por exemplo, agar de tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha) e distribuídos por toda a superfície do agar com um lacete estéril, repetindo duas vezes em direcções diferentes para assegurar uma distribuição uniforme do inoculo (diluição 1:10).

5. Painéis Incubar MIC, Contagem Colony e Pureza Plates

1. Selar cada painel MIC ou pilha de não mais de 4 painéis em um saco plástico, com uma fita de plástico ou com uma capa de plástico apertada antes da incubação. Alternativamente, coloque o painel MIC vazio na top da pilha de não mais de 4 painéis de CIM, coloque uma toalha de papel úmido em um recipiente de plástico, painéis de CIM lugar no recipiente de plástico e perto recipiente com tampa de forma segura.
2. Incubar painéis MIC em uma incubadora de ar ambiente a 35 ° C ± 2 ° C durante 16-20 hr (estafilococos e enterococos) e 20-24 h (estreptococos) dentro de 30 min de inoculação. Incubar a contagem de colónias e placas de pureza nas mesmas condições excepto estreptococos Incubar em _5% de CO2.

6. Leia o MIC e Colony Contagem placas; Verifique Pureza Placa

1. Leia a MIC como a concentração mais baixa que inibe completamente o crescimento bacteriano nas cavidades como detectadas pelo olho nu.
2. Contagem das colónias na placa de contagem de colônias. Multiplicar cada colónia pelo factor de diluição (1: 10.000) (por exemplo, 50 colónias é equivalente a 5 x 10 ⁵ CFU / mL). Um intervalo aceitável é de 20-80 colónias (2-8 x 10 ⁵ CFU / ml) e é usado como um aproorientação ximate.
3. Verifique placa de pureza. Se todas as colónias são semelhantes para as colónias usados ​​no passo 4.1, em seguida, o inoculo pode ser considerado puro. Se existem quaisquer outras colónias presentes, então há potencial para um contaminante para estar presente no painel de MIC e o ensaio deverá ser repetido.

7. Verifique Resultados controle de qualidade.

1. Consulte a Tabela 3 para intervalos esperados de cepas de controle de qualidade CLSI. Apenas relatar resultados de teste isolados, se os resultados de CIM dalbavancin para organismo (s) de controle de qualidade estão dentro do intervalo esperado.
2. Se uma MIC de ≥0.25 ug / ml é obtida por qualquer S. clínica aureus isolado, repetir os testes MIC dalbavancin e / ou enviar para um laboratório de referência para a verificação.

Resultados

Métodos MIC padronizados são necessários a fim de acompanhar o desenvolvimento de resistência, um objetivo importante de vários programas de vigilância antimicrobianos. Dalbavancin resultados de MIC para isolados recolhidos na Europa e EUA em 2011-2013 eram <0,25 ug / ml para 99,9% de S. aureus e 100% de estreptococos (Tabela 4).

Para avaliar a importância do uso de fresco (selado) DMSO, testes triplicado de MICs BMD dalbavancin para QC estirpes S. aureus ATCC 29213, e E. faecalis ATCC 29212 e duplicação de ensaios para S. pneumoniae ATCC 49619 foi realizada utilizando (1) de DMSO a partir de ampolas selados, (2) de DMSO a partir de um frasco de 1 L que estava dentro da data de expiração e que tinha sido utilizado anteriormente para 2 anos e (3) uma alíquota de DMSO a partir do mesmo de 1 L garrafa (amostra 2) que foi deixada em repouso num copo aberto durante 72 h antes da utilização. Dalbavancin resultados MIC usando painéis feitos com todas as três amostras de DMSO foram semelhantes e Within as gamas aceitáveis ​​QC (Tabela 5).

A perda de actividade dalbavancin após a exposição da solução de estoque de plástico e sem a adição de P-80 tem sido bem documentada ^7. Em 2 estudos adicionais, a adição de P-80 para as soluções iniciais e intermédios banco (Tabela 6) e a utilização de tubos de vidro ou de plástico para a preparação das soluções stock iniciais e intermédios (Tabela 7) não tem um efeito sobre os resultados dalbavancin microfone. Também não houve efeito no resultado do MIC dalbavancin quando polipropileno e poliestireno placas de três fabricantes foram utilizados (Tabela 7).

A presença de sangue de cavalo lisado nos meios de caldo para testes de estreptococos foi demonstrado que possuem uma actividade surfactante semelhante, comparável à P-80 ^{7, 8.} O método de referência dalbavancin para Streptococcus não incluem o cavalo de sangue P-80 e lisadas ,No entanto, ao contrário de estafilococos e enterococos, dalbavancin resultados de MIC para estreptococos são semelhantes (dentro de +/- 1 de diluição) com e sem a adição de P-80.

Tal como foi apresentado anteriormente e mostrado na Figura 1, diluição de agar dalbavancin (AD) MICs são tipicamente 2-8 vezes mais elevada em comparação com a corrente de referência DMO ^{12, 13, 14.} Ao contrário de BMD, a adição de 0,002% de P-80 não faz AD afetam dalbavancin MIC resulta ^12.

Equação 1: Exemplo de Dalbavancin solução Stock Preparação etapas de preparação para 25 ml de 800 mg / ml solução dalbavancin..

Figura 1. Comparação de Dalbavancin e Vancomicina BMD para AD. Os resultados do estudo que comparou dalbavaNCIN e vancomicina BMD e AD MIC resultados para selecionar isolados bacterianos Gram-positivas. Médio (A) Dalbavancin e (B) Vancomicina de microdiluição em caldo e ágar de diluição MIC resulta em ug / ml para 15 Staphylococcus aureus, 8 coagulase negativa estafilococos (SNC), 5 Enterococcus faecalis e 14 Streptococci (Grupos A, B, e C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

UMA

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL; 0.06

DAL 0,12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

B

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL 0,06

DAL 0,12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

C

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL 0,06

DAL0,12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

D

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL 0,06

DAL 0,12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

E

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL 0,06

DAL 0,12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

F

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL 0,06

DAL 0,12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

G

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL 0,06

DAL 0,12

DAL 0,25

DAL 0.5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

H

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Dal 0,03

DAL 0,06

DAL 0,12

DAL 0,25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Pos Ctrl.

DAL

Dalbavancin

As concentrações são expressas em ug / ml depois de 50 ul / poço a inoculação

Tabela 1. MIC Formato de placa. O formato de placa de 96 mostrando a localização de diluições dalbavancin e poços de controlo positivo utilizado como um exemplo na presente publicação vídeo

1	2	3	4	5	6	7	8
Fonte Conc. (ug / ml)	Fonte Volume (ml)	DMSO Volume (ml)	Conc intermediário. em DMSO (ug / ml)	Volume Intermediário Conc. (ml)	Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml)	2X Conc. Depois de diluição 1: 100 em CAMHB (ug / ml)	Final Conc Panel. Após a inoculação (ug / ml)
800	1.0	1.0	400	0,02	1.98	4	2
400	0,5	0,5	200	0,02	1.98	2	1
400	0,5	1,5	100	0,02	1.98	1	0,5
400	0,5	3,5	50	0,02	1.98	0,5	0,25
50	0,5	0,5	25	0,02	1.98	0,25	0,125
50	0,5	1,5	12,5	0,02	1.98	0,125	0.06
50	0,5	3,5	6.25	0,02	1.98	0.06	0,03
6.25	0,5	0,5	3.13	0,02	1.98	0,03	0,015
6.25	0,5	1,5	1,5	0,02	1.98	0,015	0,008
6.25	0,5	3,5	0,8	0,02	1.98	0,008	0,004
0,8	0,5	0,5	0,4	0,02	1.98	0,004	0,002
Este quadro foi modificado a partir do CLSI M100-S25, Tabela 8B 3

Tabela 2. Esquema de Preparação de diluições de Agentes Antimicrobianos insolúvel em água para ser usado em Caldo diluições Suscetibilidade Testing. Os volumes de soluções de trabalho dalbavancin e diluentes para a preparação do MIC definitivasoluções dalbavancin de 0,002-2 ug / ml.

Estirpe de controlo de qualidade	Esperado Dalbavancin MIC (ug / ml)
S. aureus ATCC 29213	0,03-0,12
E. faecalis ATCC 29212	0,03-0,12
S. pneumoniae ATCC 49619	0,008-0,03

Tabela 3. Resultados Esperados Dalbavancin MIC para controle de qualidade Estirpes ^{3, 11.} CLSI resultados de controlo de qualidade para as estirpes sugeridas a ser testado juntamente com isolados clínicos, a fim de verificar a metodologia adequada

Tabela 4. Distribuição de Dalbavancin Resultados MIC (Número de cada MIC) dos EUA e Europeia 2011-2013 Surveillance Study ^15. Dalbavancin resultados de MIC de um estudo publicado de isolados clínicos recentes como um indicador de corrente dalbavancin actividade in vitro.

Isolar #	Dalbavancin MIC (ug / ml)
	DMSO 1	DMSO 2	DMSO 3
S. aureus ATCC 29213	0,12	0.06	0.06
	0,12	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
E. faecalis ATCC 29212	0.06	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
S. pneumoniae ATCC 49619	0,015	0,015	0,015
	0,03	0,015	0,015
DMSO 1 = chama Unopened selado ampolas de 10 ml
DMSO 2 = 1L garrafa aberta Frequentes
DMSO 3 = 1L garrafa aberta frequentes - sentou-se no banco no copo descoberto durante 72 horas

Tabela 5. Resultados Dalbavancin CIM (ug / ml) utilizando DMSO e da Intermediate diluições Preparação com DMSO a partir de 3 Sources. Os resultados de um estudo que comparou MIC dalbavancin efeito do uso de diferentes solventes DMSO na preparação do estoque dalbavancin e diluições intermediárias.

Isolar Número	Número replicar	Dalbavancin MIC (ug / ml)
		DALB w / P80 em DMSO	DALB w / o P80 em DMSO
S. aureus ATCC 29213	1	0.06	0.06
	2	0.06	0.06
	3	0.06	0.06
	4	0.06	0.06
S. aureus DP80-002SA clínica	1	0,03	0,03
S. aureus ATCC 700699	1	0,5	0,5
S. pneumoniae ATCC 49619	1	0,03	0,015
	2	0,03	0,015
	3	0,03	0,015
	4	0,03	0,015
S. pyogenes clínicos:
DP80-004PY	1	0,015	0,015
DP80-005PY	1	0,03	0,03
DP80-006PY	1	0,03	0,015
DP80-007PY	1	0.06	0,03
DP80-008PY	1	0,03	0,015
S. agalactiae clínica:
DP80-009AG	1	0.06	0,12
DP80-010AG	1	0.06	0,03
DP80-011AG	1	0.06	0.06
DP80-012AG	1	0.06	0.06
S. dysgalactiae clinical DP80-013DY	1	0,03	0,03
S. pneumoniae clínica:
DP80-014SP	1	0.06	0.06
DP80-015SP	1	0,03	0,03
DP80-016SP	1	0,03	0,03
DP80-017SP	1	0.06	0.06

Tabela 6. Resultados Dalbavancin MIC utilizando DMSO e da Intermediate diluições Preparação com e sem 0,002% P-80. Resultados de um estudo que comparou MIC dalbavancin efeito da adição de 0,002% P-80 para dalbavancin estoque e diluições intermediárias.

Isolar	Número replicar	Diluição da Tubes				Microplaca (Tipo de plástico)
						Poli-propileno, Greiner	Poliestireno
		Vidro	Plástico	1hr plástico	1hr plástico / 1hr Intermediate		Greiner	Corning	Nunc
S. aureus ATCC 29213	1	0.06	0,03	0,03	0,03	0.06	0,03	0.06	0,03
	2	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0.06
	3	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03
E. faecalis ATCC 29212	1	0.06	0.06	0.06	0.06	0,03	0,03	0.06	0,03
	2	0.06	0.06	0.06	0.06	0,03	0,03	0.06	0,03
	3	0.06	0.06	0.06	0.06	0,03	0,03	0.06	0,03
S. pneumoniae ATCC 49619	1	0,015	0,015	0,015	0,015	0,008	0,008	0,008	0,008
	2	0,015	0,015	0,015	0,015	0,008	0,015	0,008	0,008
Vidro = estoque inicial feita em garrafa de vidro, usado imediatamente para tornar a concentração intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer diluições caldo.
Estoque de plástico = inicial feita em tubo de centrífuga de plástico, usado imediatamente para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer diluições caldo.
1 hr = estoque inicial de plástico feito em tubo de centrífuga de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer concentrações em caldo.
1 hr Intermediário 1 hr = estoque de plástico / inicial feita em tubo de centrífuga de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer as concentrações em caldo.

Tabela 7. Resultados Dalbavancin MIC utilizando diluições da preparação em plástico e vidro Tubos e MIC tipos de chapas de plástico. Resultados ofa dalbavancin estudo MIC que, em comparação efeito do uso de tubos de plástico ou de vidro na preparação das soluções de reserva e também efeito da utilização de diferentes fontes e tipos de plástico para placas de microtitulação.

Discussão

Os seguintes detalhes do método são apresentados para considerações adicionais quando se preparava para testes dalbavancin MIC. O design do painel de MIC dependerá do número de agentes antimicrobianos para ser testado (isto é., Dalbavancin sozinho ou vários agentes) e as espécies de bactérias a ser testado. As concentrações dalbavancin deve englobar os pontos de quebra de interpretação para todas as espécies bacterianas a serem testados e toda a gama de diluições esperada para pelo menos uma estirpe de CQ. A série de diluição antimicrobiana podem ser organizados em linhas ou colunas, dependendo do número de agentes anti-microbianos e / ou isolados / placa e método de inoculação. O volume de dalbavancin pó e caldo deve ser calculado para assegurar que quantidades ideais são produzidos e dos resíduos é mínima. Para o exemplo utilizado na presente publicação, os volumes são baseados na preparação de dois painéis de MIC. Cátion ajustado caldo Mueller Hinton deve ser preparado e autoclavado de acordo com homeminstruções e esterilidade dos meios de comunicação de ufacturer verificada. MIC painéis pode ser feito e utilizado na preparação do mesmo dia, ou podem ser testadas com os organismos de controlo de qualidade adequados e os painéis validados armazenado congelado para uso futuro. É importante a utilização de técnicas de esterilidade durante todo o procedimento.

Não há critérios estritos para a verificação da concentração de inóculo com contagem de colônias. Contagens de colónias pode ser verificado inicialmente para cada espécie testada e / ou periodicamente para validar o passo de diluição realizada no passo 4.2. É importante que a validade do padrão 0,5 de McFarland também é verificado rotineiramente com E. coli ATCC 25922, utilizando um procedimento semelhante ao passo 4.5. Se os resultados não são equivalentes a 1-2 x 10 ⁸ CFU / ml, um novo padrão de 0,5 McFarland deve ser obtida. Se as contagens de colónias a partir de poços de CIM estão fora da gama aceitável (2-8 x 10 ⁵ resultados UFC / mL e de MIC para o isolado clínico (s) pode variar de the esperado distribuição normal (ex. 0,03-0,12 ug / ml para S. aureus) e / ou resultados de MIC para o isolado de controle de qualidade (s) estão fora dos limites esperados, o teste de validação é necessário e modificação método pode ser garantido. Sugere-se que um padrão McFarland 0,5 validado é utilizada para repetir a contagem (s) de colónias e se os resultados são mais uma vez fora dos resultados esperados, a diluição do inoculo, realizada no passo 4.2 deve ser ajustado em conformidade e a MIC repetido. Note-se que uma verificação de pureza é necessário, mesmo se um número de colónias é realizada porque o procedimento de contagem de colónia utiliza um volume diluídos que podem não ser necessariamente detectar concentrações mais baixas de organismos contaminantes.

Para um teste MIC seja considerado válido, o crescimento aceitável deve ocorrer no controle do crescimento bem. Para a maioria das bactérias que irá ser testados contra dalbavancin (isto é., Os estafilococos, estreptococos e enterococos, o crescimento irá ser visto como um botão (tipicamente> 2 mm) e menos frequently, o crescimento pode aparecer como turbidez no poço. Ao contrário de alguns agentes antimicrobianos que podem apresentar fuga efeito que as concentrações de aumentar, endpoints dalbavancin são tipicamente bem definido. Existem vários dispositivos de visualização, destinadas a facilitar a leitura testes de microdiluição, que podem ser usados ​​para ler dalbavancin placas contendo desde que não há nenhum compromisso na capacidade de discernir o crescimento nos poços.

Os passos críticos dentro do protocolo estão relacionadas com as partes do procedimento que estão relacionados com a solubilidade do dalbavancin e adição de P80. É importante que a concentração máxima de dalbavancin utilizada não é maior do que 1.600 ug / ml, que o DMSO é utilizado como um solvente e que as concentrações intermédias são preparadas em DMSO, antes de fazer as diluições de caldo de modo a que a concentração final de DMSO no MIC painel poços não é maior do que 1%. DMSO é higroscópico e, por conseguinte, a utilização de garrafas mais velhos de DMSO foi de um consideratíon que diz respeito à dalbavancin solubilidade. No entanto, não enquanto um estudo BMD pequeno com cepas de controle de qualidade tem mostrado que isso seja uma variável importante (ver secção Resultados), é uma boa prática para usar garrafas novos ou recentemente abertos de DMSO. É também importante que P80 é adicionado ao caldo no passo final da preparação de diluição da droga e é a uma concentração final de 0,002% na MIC bem.

O processo da DMO incluído aqui utiliza preparação de painéis de MIC utilizando 50 ul / poço em dalbavancin e P-80 concentrações, duas vezes a concentração final e da adição de inoculo com 50 ul / poço de modo a que o volume final / poço é 100 ul. Este método permite a um formato de painel MIC a ser produzida para o ensaio de ambos S. aureus e S. pneumoniae, porque o sangue de cavalo lisado pode ser adicionado ao inoculo. Métodos alternativos para a preparação de painéis de MIC utilizando 100 uL / ​​poço com a adição de até 10 ul / poço são descritos naCLSI e ISO procedimentos.

O ponto de interrupção suscetível dalbavancin para S. aureus é ≤0.12 ug / ml (FDA folheto informativo). Como é mostrado na vigilância recente, a maioria dos isolados são inibidos por dalbavancin em níveis de 0,06 ug / ml ^15. Com um ponto de interrupção suscetível perto do MIC modal, qualquer variação de MIC como resultado de diferenças de método pode afetar as taxas de susceptibilidade. Porque o procedimento de BMD para dalbavancin inclui alguns passos únicos (especificamente, o uso de DMSO na preparação de estoque e diluições do fármaco intermédios e 0,002% de P80 na MIC bem, é imperioso que o método é seguido exactamente. O organismo S. aureus QC (ATCC 29213), com uma muito clara MIC dalbavancin modal de 0,06 mg / ml, tem sido um bom indicador de variação método e deve ser usado rotineiramente para validar o método de BMD. Se os resultados MIC estão com o intervalo esperado de 0,03-,12 ug / ml, mas são tendências, quer ao baixo ou high lado desta gama, é garantido uma validação adicional do método.

A adição de 0,002% de P80 é recomendada para todos os organismos relevantes Gram-positivo (staphylococcci, enterococos e estreptococos.) No entanto, é de notar que foi demonstrado que lisadas sangue de cavalo age semelhante a P-80 relativamente ao seu anti-obrigatório capacidade e que a adição de P-80 de CAMHB + LHB não tem qualquer efeito suplementar sobre os resultados de MIC dalbavancin estreptococos.

Não há atualmente nenhum método de difusão em disco para testes dalbavancin e por causa da fraca correlação da DMO e os resultados AD, testes de susceptibilidade de dalbavancin usando o método AD não é recomendada ^{12, 14.} O método de BMD devem ser utilizados para a avaliação futura do dalbavancin susceptibilidade e como um padrão-ouro para o desenvolvimento de testes comerciais de susceptibilidade aos antimicrobianos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dalbavancin	Metrics, Inc.	Greenville, NC	BI-397
Vancomycin	Sigma-Aldrich	St. Louis, MO	C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth	Becton Dickinson	Sparks, MD	212322
Lysed horse blood	Cleveland Scientific	Bath, OH
Dose-it peristaltic pump	Integra Biosciences	Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II)	Integra	Hudson, NH	4164
12 channel pipet (Matrix)	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µl - 100 µl)	VistaLab	Brewster, NY
96 well microplate	Greiner Bio-one	Monroe, NC	650161
50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16x125 mm disposable glass tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
12x17 mm snap cap, polystyrene tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16 ml centrifuge tubes	BioExpress	Kaysville, UT	C-3394-2
Reagent reservoirs	Integra Biosciences	Hudson, NH	4312
Disposable sterilelLoops (1 µl & 10 µl)	Biologix	Lenexa, KA	65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood	Becton Dickinson	Sparks, MD
Incubator (ambient)	Sanyo
Incubator (5% CO2)	Sanyo
Analytical balance	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Gloves	Kimberly-Clark		52817
Lab coats