Rotulagem celular e Segmentação com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas

Resumo

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Resumo

Entrega direccionada de células e agentes terapêuticos beneficiaria uma vasta gama de aplicações biomédicas, concentrando-se o efeito terapêutico no sítio alvo, enquanto minimizam os efeitos deletérios para locais fora do alvo. Segmentação célula magnética é uma técnica de entrega eficiente, segura e simples. Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (spion) são biodegradáveis, biocompatíveis, e pode ser sujeita a endocitose nas células para as tornar sensível aos campos magnéticos. O processo de síntese envolve a criação de magnetite _(Fe 3 O ₄₎ nanopartículas seguido por emulsificação a alta velocidade para formar uma poli (ácido láctico-co-glicólico) revestimento (PLGA). Os SPIONs PLGA-magnetita são aproximadamente 120 nm de diâmetro incluindo a cerca de 10 nm núcleo de magnetita diâmetro. Quando colocado em meio de cultura, são naturalmente SPIONs endocitose pelas células e armazenadas como pequenos aglomerados dentro de endossomas citoplasmáticos. Estas partículas conferem massa magnético suficiente para as célulaspara permitir o direccionamento para dentro de campos magnéticos. Numerosos separação de células e aplicações de segmentação são ativadas por prestar diversos tipos de células que respondem a campos magnéticos. SPIONs ter uma variedade de outras aplicações biomédicas, incluindo também o uso como um agente de contraste para imagiologia médica, a entrega de drogas ou gene alvo, ensaios de diagnóstico e geração de hipertermia local para terapia de tumor ou tecido de solda.

Introdução

Targeted delivery and capture of cells to specific sites within the body is desirable for a variety of biomedical applications. Delivery of neural stem cells to the brain by MRI-guided focused ultrasound has been proposed as a possible treatment option for neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and stroke¹. Mesenchymal stem cells are being studied for their ability to deliver anti-cancer drugs to tumors due to their natural tumor-tropic properties^2,3. Cardiac stem cells have been delivered to the heart as a possible treatment for myocardial infarction^4,5. Vascular stents have been developed with CD34 antibodies to capture circulating progenitor cells⁶. While promising, these cell targeting approaches present drawbacks including lack of cell specificity, inconsistent cell retention, and off-target cell delivery.

The overall goal of the current method is to enable magnetically directed targeting of cells for a variety of cell delivery and sorting applications. Magnetic targeting allows for controlled delivery of specific cells to a specific target site with minimal off-target effects⁷. The magnetic fields can be generated by implanted or external devices to safely direct the movement of magnetically-labeled cells within the body⁸. Numerous research efforts have focused on magnetically directed targeting of stem cells to injured tissues such as the heart^9-14, retina¹⁵, lung¹⁶, skin¹⁷, spinal cord^18,19, bone²⁰, liver²¹, and muscle^22,23 in order to improve regeneration outcomes.

Magnetic targeting of cells has also been studied extensively as a means to endothelialize implantable cardiovascular devices. A uniform and complete endothelium provides a barrier between the device and circulating blood elements to mitigate thrombosis and inflammation. Endothelial cells can be delivered to the device either prior to implantation or via the vascular system following implantation. In both cases, magnetic fields are used to capture cells to the surface of the device and retain the cells when subjected to the shear stress generated by circulating blood. Magnetic vascular stents^24-27 and vascular grafts²⁸ have both been fabricated and tested for this purpose.

Magnetic cell targeting requires a strategy for labeling cells with magnetic carrier particles. These particles can be bound to the surface of cells via antibodies or ligand/receptor pairs or they can be endocytosed into the cells. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and readily endocytosed by a variety of cell types²⁹. These particles effectively render a cell responsive to magnetic fields and are naturally degraded over time. SPIONs provide a straightforward and safe means of magnetically labeling cells in culture for a variety of magnetic targeting and sorting applications. A method for synthesizing SPIONs with a magnetite (Fe₃O₄) core and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) shell is provided. In addition, a method for labeling cells in culture with SPIONs is provided.

Protocolo

1. Síntese de magnetita Gel

1. Lave todos os vidros por meio de ácido clorídrico concentrado seguido por água desionizada seguido de álcool etílico. Deixar secar S / N, de preferência num forno de secagem.
   CUIDADO! ácido clorídrico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor; álcool etílico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal.
2. Utilize uma garrafa Dreschel para de-gás 500 ml de _H2O desionizada fazendo borbulhar suavemente _N2 gasoso durante 30 minutos.
3. Set-up do aparelho síntese magnetita dentro de um exaustor química.
   1. Coloque um frasco de fundo redondo ml com três gargalo de 500 dentro de um aquecedor de manta de aquecimento e garantir o centro pescoço usando uma pinça e stand.
   2. Instalar um septo de borracha em uma das gargantas laterais do balão de fundo redondo e condensador de refluxo com um septo de borracha para dentro do gargalo lado restante. Continuamente correr água fria através do condensador de refluxo.
   3. Punção the septo de borracha do balão de fundo redondo com uma agulha conectada a uma linha de gás _N2 e punção septo de borracha do condensador de refluxo com uma agulha conectada a uma linha de gás que funciona a um borbulhador (isto é, a garrafa com água) para visualizar saída de gás.
   4. Instalar uma pá lâmina no centro do pescoço do frasco de fundo redondo através de um adaptador de remo. Encaixar o eixo da pá de lâmina para um agitador de topo montado sobre um suporte.
4. Purgar o balão de fundo redondo com _gás N2 e deixar N ₂ gás que flui a uma taxa baixa mas detectável.
5. Remover o condensador de refluxo a partir do balão de fundo redondo e adicionar 1,000 g de ferro (III), cloreto de 0,6125 g de ferro (II) tetra-hidrato de cloreto, e 50 ml de desgaseificado _H2O
   CUIDADO! de ferro (III) e ferro (II) tetra-cloreto são prejudiciais - usar equipamento de protecção pessoal.
6. Substituir o condensador de refluxo e agita-se a 1.000 rpm, enquanto se aquecia a 50° C. A agitação sob estas condições produz nanopartículas de magnetite 10 nm de diâmetro.
7. Uma vez a 50 ° C, adiciona-se 10 ml de solução de hidróxido de amónio a 28% por injecção através do septo de borracha no frasco de fundo redondo, enquanto ainda se agitava.
   CUIDADO! hidróxido de amônio é nocivo - usar equipamento de protecção pessoal.
   NOTA: A solução de hidróxido de amónio é usado para precipitar a magnetite e a solução deve ficar preto.
8. Remover o septo de borracha e _N2 linha de gás a partir do balão de calor e de fundo redondo a 90 ° C para evaporar o amoníaco gasoso, enquanto ainda se agitava.
   NOTA: É opcional para manter o fluxo de N ₂ para o balão de fundo redondo através da perfuração do septo de borracha do condensador de refluxo, no entanto, a oxidação da magnetite de maghemite é insignificante durante este passo.
9. Uma vez a 90 ° C, adiciona-se 1 ml de ácido oleico para o balão de fundo redondo, enquanto ainda se agitava. O ácido oleico é utilizado para revestir a magnetita ndnoparticles para formar gel de magnetite.
   CUIDADO! ácido oleico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal.
10. Substituir o septo de borracha e _N2 linha de gás para o balão de fundo redondo e remover o condensador de refluxo.
11. Desligue o fogo e mexa a 500 rpm durante 2 horas.
12. Retirar o frasco de fundo redondo a partir da manta de aquecimento do aquecedor e decanta-se o líquido restante, enquanto utilizando um íman forte realizada contra o fundo do frasco para reter o gel de magnetite.
    CUIDADO! lidar com a forte ímã com extremo cuidado para evitar danos ou ferimentos.
13. Permitir que a O gel de magnetite seco ao ar / N (opcional).

2. Purificação de magnetita Gel

1. Adicionar 40 ml de hexano para o balão de fundo redondo para dissolver o gel de magnetite
   CUIDADO! hexano é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor.
2. Utilizar um funil separador com 40 ml de desgaseificado _H2O residual para remover H _{2 O} frosou a solução magnetite.
   1. Lentamente, deitar a solução de magnetite na _H2O no funil de separação e agitar suavemente o líquido de duas fases, durante 5 minutos.
   2. Escorra e descarte a fração aquosa inferior.
   3. Adiciona-se lentamente 40 ml de desgaseificado _H2O ao funil de separação de tal modo que se estabelece em baixo da solução de magnetite e agitar suavemente e drenar como antes.
   4. Repetir a lavagem para uma terceira vez.
3. Transferir solução magnetita para um Erlenmeyer, adicione algumas espátulas no valor de sulfato de sódio anidro, e agite para remover qualquer remanescente residual H _{2 O} a partir da solução de magnetita.
4. Filtrar a solução através de papel de filtro de magnetite 1 uM num funil de filtro para remover o sulfato de sódio residual e H _{2 O.}
   NOTA: É recomendável assistência de vácuo.
5. Transferir a solução para um balão de magnetite evaporação de 50 ml e usar um evaporador rotativo, para evaporar o hexano durante2 h, com as seguintes condições: velocidade de rotação moderado, vácuo aplicado, evaporando balão num banho de água a 50 C ° e 24 ° C de circulação de água através do condensador.
   NOTA: Opcionalmente, armazenar o gel magnetite antes do revestimento com PLGA.

3. Revestimento de magnetita com nanopartículas PLGA Shell

1. Dissolve-se 3,60 g de PLGA (75/25 mistura) em 240 ml de acetato de etilo, para se criar uma (m / v) de solução de 1,5%. CUIDADO: acetato de etilo é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor.
2. Dissolve-se 25,00 g de Pluronic F-127 em 500 ml de-gaseados de _H2O utilizando um agitador magnético para criar um (m / v) de solução de 5.0%.
   NOTA: o Pluronic F-127 é um copolímero em bloco anfifílico não iónico que actua como um tensioactivo biocompatível. Ele ajuda a estabilizar a emulsão de óleo-em-água no passo 3.3.2.
3. Usando um microspatula, recolher o gel de magnetita em seis 0,040 g alíquotas dentro de frascos de vidro ponderadas. Perform o seguinte processo de revestimento e de lavagem para cada alíquota.
   NOTA: As alíquotas são necessárias para garantir uma gestão eficiente e decantação magnética, que irá maximizar a pureza e rendimento, minimizando a degradação antes da liofilização na etapa 4.
   1. Adicionar uma alíquota de 0,040 g de gel de magnetite e 40 ml da solução de PLGA a um copo de plástico e sonicado num aparelho de limpeza de ultra-sons durante 10 minutos.
   2. Adicionar 80 ml da solução de Pluronic para o copo de plástico e emulsionar imediatamente com um misturador de laboratório para o nível mais alto durante 7 minutos para formar o revestimento de PLGA em que as nanopartículas de magnetite preparada como uma emulsão de óleo-em-água.
   3. Imediatamente diluir a solução spion em 1 L de _H2O desionizada e sonicado durante 1 h numa hote química para evaporar o acetato de etilo.
   4. Coloque um ímã forte ao lado da solução spion e mexa delicadamente para coletar SPIONs acastanhadas no ímã.
      NOTA: Pode ser necessário agitar de forma intermitente durante várias horass antes de a solução torna-se esbranquiçada indicando que a maioria das SPIONs foram recolhidos.
   5. Decantar a solução aquosa, mantendo as SPIONs no copo com o ímã.
   6. Lavar as SPIONs três vezes como se segue.
      1. Suspender os SPIONs em 1 L de H ₂ O. desionizada
      2. Sonicar a solução spion por 20 minutos.
      3. Coloque um ímã forte ao lado da solução spion e mexa delicadamente para coletar SPIONs acastanhadas no ímã. Pode ser necessário agitar intermitentemente durante várias horas antes de a solução se tornar clara, indicando que a maioria das SPIONs foram recolhidos.
      4. Decantar a solução aquosa, mantendo as SPIONs no copo com o ímã.
4. Recolher os SPIONs sintetizados a partir de cada um dos seis alíquotas de gel de magnetite em um único frasco de vidro ponderado, tal como uma suspensão aquosa. Opcionalmente decantar o excesso de água magneticamente, conforme necessário.

4. Congelamento-drying de SPIONs

1. Congelar a solução spion.
2. Liofilizar a solução spion O / N em um liofilizador.
3. Pesar os SPIONs liofilizados. SPIONs liofilizados podem ser armazenados à temperatura de -20 ° C até ser usado para a marcação de células.
   NOTA: O armazenamento a -20 ° C, reduz drasticamente cinética de degradação e aumenta a vida de prateleira.

5. Rotulagem de células com SPIONs

1. Suspende-se uma alíquota de SPIONs em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 40 mg / ml e sonicar durante 30 min.
2. Adicionar a solução para um balão spion quase confluente de células a uma concentração de 5 ul / ml de meio de cultura celular. Assegurar uma distribuição uniforme por balançando suavemente o frasco.
3. Incubam-se as células durante 16 horas a 37 ° C.
4. Suavemente aspirar meio de cultura e lavar as células duas vezes com PBS.
5. Coletar células magneticamente marcadas e usar para experimentos.
6. Solução spion não utilizados podem ser armazenados a 4 ° C e deve ser nósed dentro de alguns meses. Sonicar durante 30 minutos antes de cada utilização.

Resultados

Nanopartículas de magnetite são de aproximadamente 10 nm de diâmetro, como resultado da agitação de uma solução aquosa de ferro (III) e cloreto de ferro (II), cloreto de tetra-hidrato a 50 ° C e 1000 rpm (Figura 1). Estes resultados demonstram a síntese bem sucedida de nanopartículas de magnetite. É importante para verificar o tamanho e a forma de nanopartículas de magnetite tomadas a partir de uma pequena amostra do lote durante a tentativa para a síntese da primeira vez. A microscopia ele...

Discussão

Tal como acontece com qualquer protocolo de síntese de nanopartículas, a pureza dos produtos químicos reagentes é crítico para a consecução SPIONs de alta qualidade que terão efeitos citotóxicos mínimas. É, portanto, importante para adquirir reagentes muito puros, incluindo o ácido oleico (≥99%), ferro (II) tetra-hidrato de cloreto de (≥99.99%), ferro (III), cloreto de (≥99.99%), acetato de etilo (qualidade para HPLC, ≥99.9% ), hexano (grau HPLC, ≥97.0%), hidróxido de amónio (≥99.99%), e sulfat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis	Sigma-Aldrich	338818-100ML	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Dreschel bottle, 500 ml	Ace Glass	5516-16
Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9%	Sigma-Aldrich	650528-1L	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint	Sigma-Aldrich	Z515558	For use with rotoevaporator
Filter paper, 3 cm dia, grade 1	Fisher	09-805P	For use with glass filter funnel
Glass beakers, 1 L	Fisher	FB-101-1000	For washing SPIONs
Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL	Fisher	K954100-0344
Glass vial caps	Fisher	03-391-46	For use with glass vials
Glass vials, 2 ml	Fisher	03-391-44	For collecting magnetite gel & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC)	Sigma-Aldrich	34859-1L	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis	Sigma-Aldrich	380024-5G	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis	Sigma-Aldrich	451649-1G	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Isomantle heater, 500 mL	Voight Global	EM0500/CEX1
Laboratory mixer	Silverson	L5M-A
Lyophilizer	Labconco	7670520
Microspatulas	Fisher	21-401-25A	For transfering magnetite gel
NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in	Amazing Magnets	C1000H-M	Very strong magnet, handle with care
Oleic acid, ≥99% (GC)	Sigma-Aldrich	O1008-5G	Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment
Overhead stirrer	IKA	2572201
Overhead stirrer clamp	IKA	2664000	For use with overhead stirrer
Overhead stirrer H-stand	IKA	1412000	For use with overhead stirrer
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023
Plastic beakers, 250 ml	Fisher	02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend)	Purac	PDLG 7502	PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer
Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	P2443-250G
PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia	SciQuip	SP4018
PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle	Monmouth Scientific	PTFE Vessel Adaptor A480	For use with PTFE expandable blade paddle
Recirculating chiller	Clarkson	696613	For use with rotoevaporator
Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm	Ace Glass	5997-133
Rotoevaporator	Clarkson	216949
Rubber septa, fits 24/40	Ace Glass	9096-56
Separatory funnel with stopper, 250 ml	Fisher	10-438E
Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular	Sigma-Aldrich	239313-500G
Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml	Ace Glass	6948-16
Ultrasonic cleaner perforated pan	Fisher	15-335-20A	For use with ultrasonic cleaner
Ultrasonic cleaner, 2.8 L	Fisher	15-335-20
Vacuum controller	Clarkson	216639	For use with rotoevaporator (optional)
Vacuum pump	Clarkson	219959	For use with rotoevaporator