Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

Resumo

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Resumo

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

Introdução

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features^1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality^1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane^4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy⁷. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity^8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems^2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.

To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases². To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations^16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms^17,18, and identify novel therapeutic strategies^12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers²⁰. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens²¹, a valuable method for the identification of novel therapeutics^22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation²⁵ and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence²⁶, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.

We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence²⁷. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases^8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje^15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

Protocolo

1. Preparação de Agar placas de injeção (Tempo: 45 min)

1. Ferver 2% a 3% de agarose em meio E3 e permita que a solução arrefecer ligeiramente no banco. Nota: O número de placas de injecção a ser preparado dita a quantidade de agarose necessária. Cada placa de injecção necessita de cerca de 35 ml da solução de agarose.
2. Depois de ferver, permitir que a agarose a arrefecer até a temperatura desejada seja atingida (por exemplo., 45 ^° C) de acordo com as instruções do fabricante do molde de injecção.
3. Pour cerca de 35 ml de agarose a arrefecido em um prato de 100 mm.
4. Coloque uma extremidade do molde de injeção preferido na solução, em seguida, estabelecer restante do molde sobre solução de agarose (isso vai ajudar a reduzir a ocorrência de bolhas de ar).
5. Permitir que a solução de agarose para solidificar quer à TA ou ^a 4 ° C durante aproximadamente 30 min.
6. Usar uma espátula para separar uma extremidade do molde a partir da agarose sólida. Lentamente remover o restante do m velho.

2. Preparação de Evans Blue Dye (EBD) Injeção Mix (Tempo: 30 min)

1. Adicione um estoque de 1% de CAE em solução de 1X Ringer (NaCl 155; KCl 5 mM; _CaCl2 2 mM; _MgCl2 1 mM; 2 mM de Na ₂ HPO _4; HEPES 10 mM; glucose 10 mM; pH a 7,2), que pode ser armazenado à temperatura ambiente.
2. Adicione uma solução de reserva de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -dextrano MW 10.000 kDa a 25 mg / ml em solução e armazenamento de 1X Ringer a ^-20 ° C.
3. Preparar a mistura de injecção através da diluição para 0,1% CAE directamente na solução estoque de estoque de FITC-dextrano (isto é, para um volume de trabalho de 100 uL finais:. Misturar 10 ul de 1% CAE em 90 ul de estoque de dextrano FITC).
4. Misture bem injeção vórtice (que deve ficar verde) e manter fora da luz direta envolvendo injeção de tubo de mistura em papel alumínio.

3. Preparação Injeção EBD (Tempo: Cerca de 30 min)

ent "> Nota: protocolo funciona melhor com larvas de 3-7 dias após a fertilização (DPF).

1. Placa de injecção pré-aquecer a RT.
2. Configure aparelho de injecção, organizando micromanipulador na placa de metal e ficar ao lado do microscópio que está sendo usado para a injeção. Ligue controlador de microinjeção ar conduzido. Nota: O sistema de injeção preferido irá variar em laboratório e não deve alterar resultado da análise.
3. Voltar encher agulha de injecção com cerca de 2-4 ul da mistura EBD.
4. Calibrar volume de injeção de cerca de 5 nl de mix EBD. Nota: Injecção de calibragem de volume dependerá método de calibração. Uma injecção de êmbolo accionado directamente pode ser definido para um determinado volume de injecção ao passo que os injectores de gás de pressão terá o volume de injecção de bolus por via do volume calibrado com a utilização de um micrómetro.
5. Placa de injecção molhada com solução de Ringer 1X e remover o excesso de poços.
6. Larvas pré-prazer, com 0,04% de acetato de 3-aminobenzoato de sal metanossulfonatot (tricaina) diluídos em solução de Ringer 1X para imobilizar larvas antes do início da injecção. Nota: Garantir larvas são completamente immotile é importante como uma injecção adequada é difícil com qualquer movimento residual.
7. Coloque larvas anestesiados nos poços das placas de agar utilizando injecção de uma pipeta de vidro. Certifique-se de que as larvas são completamente dentro do poço e deitado sobre seu lado. Nota: O número de larvas por poço é até o experimentador.
8. Depois de larvas são colocadas nas cavidades, remover excesso de solução de Ringer para minimizar o movimento larvas dentro do poço. Deixar uma quantidade residual de solução para que as larvas não desidratar.

4. Injeção Pericárdica de Zebrafish larvas com EBD (Tempo: Dependente do número de larvas de injecção, estima 1-3 hr)

1. Colocar a placa de injecção contendo as larvas em um escopo de dissecação onde as injecções serão realizados.
2. Posicione a agulha pipeta de injeção contendoCAE misturar mais de um larvas do peixe.
3. Reposicionar a placa de injecção através da rotação de modo que a agulha de injecção está próximo do coração do larvas e cerca de 45 ^° ventralmente em relação ao eixo ântero-posterior.
4. Inserir a agulha de injecção na veia cardinal comum (CCV) na região da veia na porção anterior da gema quando a veia está inicialmente rodar na direcção dorsal (Figura 1). Nota: A ampliação de até 40x pode ser útil para ver claramente o CCV.
5. Injectar 5 nl de mix EBD e manter agulha de injeção na posição para 5-8 segundos para minimizar a perda imediata do mix EBD. Nota: Uma boa injecção terá corante coloração visto nas câmaras do coração (Figura 1). Se EBD mistura não é observada no coração e, em seguida injectando um adicional de 5 nl mistura EBD pode ser suficiente para induzir a absorção do corante. Alternativamente, o embrião pode ser descartado.
   Nota: Em algumas situações, o coração pode parar de bater. Se este óccurs, continuar a acompanhar as larvas de 20-40 seg. Tipicamente, o coração recomeça a bater como o corante se move através do sistema circulatório.
6. Passar para a próxima larvas e repita.
7. Identificar embriões injectados com sucesso mediante a observação da presença de FITC-dextrano na vasculatura imediatamente após a injecção (Figura 2).

5. Incubação e EBD Captação (Tempo: 4-6 hr)

1. Após o número desejado de larvas são injectados, larvas injectadas retorno para a solução de Ringer 1X sem tricaina em placas de 100 mm.
2. Mantenha pratos embrulhados em papel alumínio. Nota: Manter larvas injetadas no escuro aumenta significativamente as taxas de sobrevivência e garante a maior consistência na intensidade do sinal. Embalagem em folha de alumínio é especialmente importante durante o período de tempo que as larvas estão fora da incubadora.
3. Permitir que as larvas incubar a 28,5 ^{° C durante} 4-6 horas para assegurar a aceitação EBD suficiente.

6. Visualização da EBD no músculo (Tempo: Dependente do número de larvas e de injecção tipo de microscopia, estimados 0,5-3 hr)

1. Antes de imagiologia, anestesiar as larvas com 0,04% tricaina para impedir o movimento.
2. Ver larvas sob fluorescência vermelha para determinar se está a ocorrer EBD captação no músculo esquelético (Figura 3).

Resultados

A mistura de injecção EBD foi injectada na CCV de mutantes homozigóticos sapje e irmãos de tipo selvagem no 3 dpf. As injecções que encheu as câmaras do coração (Figura 1B) foram então analisadas por injecção bem sucedida por meio da visualização de FITC-dextrano na vasculatura sob fluorescência verde (Figura 2).

Após um período de incubação de 4 h, EBD absorção foi examinada a nível somito utilizando microscopia de fluorescência. Irmãos de tipo selvagem exibiram nenhuma fluorescência EBD dentro de quaisquer fibras musculares visíveis (Figura 3A), ao passo que os mutantes homozigóticos sapje EBD mostrou absorção, indicando os danos para a membrana muscular ¹⁵ (Figura 3B).

Figura 1. Injectar EBD mix injeção na veia cardinal comum (CCV) de um peixe-zebra embryo. Embrião (A) não injectado. Seta indica a localização ideal para a injeção CCV. (B) injecção bem sucedido para a CCV. O corante entra nas câmaras do coração (seta) e começa a ser bombeado através da vasculatura. (C) Uma injeção vencida CCV irá resultar em alguns ou todos do corante entrar no saco vitelino do embrião (seta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Os embriões podem ser classificadas para injeção de sucesso, observando distribuição FITC-dextrano sob fluorescência verde em toda a vasculatura imediatamente a seguir à injecção e antes da EBD captação.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: EBD será retomada por fibras com membranas danificadas irmãos (A) do tipo selvagem mostrando ausência de fluorescência EBD nas fibras musculares.. (B) Sapje ​​mutante homozigótica com fluorescência EBD dentro múltiplas fibras musculares (setas). Todas as larvas foram injectados com a mistura de injecção CAE e analisados ​​após um período de incubação de 4 horas a 3 dpf. Irmãos e mutantes foram ordenados por fibra muscular destacamento antes da injeção CCV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Zebrafish estão emergindo como uma poderosa ferramenta para o estudo de ^2,29 doença neuromuscular. Até à data, o sistema de peixe-zebra foi utilizado para validar causadores de doenças musculares nova mutações ^16,17,30, elucidar novos patomecanismos ^18, e potencialmente identificar novas drogas terapêuticas ^12,24. Estes esforços coletivos estabeleceram a utilidade do peixe-zebra para modelar doenças neuromusculares humanas. No entanto, apesar dos avanços feitos com modelos de peixe-zebra e mamíferos, há opções limitadas de tratamento para pacientes dentro do amplo espectro de condições neuromusculares. Portanto, existe uma grande demanda para o desenvolvimento de terapia para esse grupo de doenças devastadoras. Em paralelo a essa demanda por terapêutica é a correspondente necessidade de inovação experimental em curso, bem como uma análise rigorosa para verificar novos modelos animais e estratégias terapêuticas putativos.

Análise EBD é comumente usado em modelos de ratos paratecido estudo e danos celulares no cérebro, coração, músculo esquelético e ^27,31. Mais notavelmente, EBD é amplamente utilizado em modelos de ratos com vários subtipos de distrofia muscular para mostrar a gravidade da membrana muscular instabilidade e danificar ^8. O uso de CAE para revelar danos membrana muscular é um parâmetro de suporte que estabelece semelhanças entre o modelo animal para o estado de doença humana ^9. O poder da EBD no rato levou vários laboratórios, inclusive o nosso, para desenvolver e aplicar EBD para modelos de peixe-zebra de doença neuromuscular. Devido à aplicabilidade da análise EBD, esta técnica está ativamente sendo implementadas para corroborar os modelos de peixe-zebra para o estado de doença humana ^{11,15,22,24,32.} Larvas com as membranas musculares danificadas terá captação EBD e fluorescência vermelha, portanto, dentro de fibras musculares. A fluorescência observada no espaço entre as fibras, mas não nas fibras musculares individuais podem também ser informativo de fibras destacados do porão em t membranaele ausência de dano à membrana, fornecendo detalhes úteis de diagnóstico. Análise EBD tem potencial de aplicação para além validação do modelo animal. Os esforços do nosso laboratório demonstraram recentemente que a análise EBD é benéfica na validação de medicamentos terapêuticos potencialmente novos ^24. Determinar se os potenciais tratamentos terapêuticos reduzir ou abolir a captação EBD em modelos de doenças neuromusculares podem significar ação terapêutica relevante ^8. Este tipo de análise pode ajudar a estabelecer o mecanismo (s) de terapêuticas e expande a aplicação da análise EBD.

Tal como acontece com muitas técnicas, análise EBD tem muitos cuidados a serem observados durante a concepção e prática experimental. Por exemplo, pode ser um desafio para identificar o CCV devido ao espessamento do tecido com a idade. Além disso, é fácil de danificar larvas em preparação antes e durante a injecção do pericárdio, reduzindo a contagem experimentais e aumentando a necessidade de preparar um grande número de larvas.Além disso, os danos físicos causados ​​ao larvas durante o manuseio e de injecção pode resultar em falsos positivos como músculo danificado pode levar até EBD. A fim de ultrapassar alguns destes obstáculos, descrevemos uma estratégia de co-injecção neste artigo de vídeo que permite a identificação fácil e fiável das larvas com infusão de corante sucesso imediatamente após a injecção e antes da análise subsequente. O FITC-dextrano controlos co-injecção para a injecção bem sucedido, permitindo a confirmação de CAE na vasculatura antes da sua absorção pelas fibras musculares. Isto pode ser particularmente útil como EBD fluorescência torna-se altamente difusa em larvas após várias horas, se não recolhidos nas fibras musculares; como tal, pode ser difícil de detectar. Além disso, a falta de CCV e injectando EBD na gema ou cavidade corporal pode, após a incubação, resultam em fluorescência vermelha difusa semelhante para controlar embriões, ainda com a probabilidade reduzida de absorção pelas fibras musculares danificadas. Coletivamente, estas cavernaats sugerem injeção EBD requer paciência e prática para alcançar resultados consistentes e confiáveis.

Ao todo, nós descrevemos um método prático e simples para realizar a análise EBD em larvas do peixe. Até à data, a utilização de peixe-zebra como um sistema modelo, especialmente como um modelo da doença humana, tem vindo a expandir-se rapidamente. Esta expansão é parcialmente devido ao contínuo desenvolvimento e modificação de técnicas experimentais que melhoram sobre as vantagens atuais do sistema peixe-zebra. A técnica de injeção EBD fornece uma ferramenta adicional e poderosa para arsenal do pesquisador para a validação e estudo de modelos de doenças músculo de peixe-zebra. A implementação em curso e modificação desta técnica tem o potencial de ajudar a descobrir novas estratégias terapêuticas, bem como mecanismos que causam doenças.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000	Sigma	FD10S
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040
100 mm Petri dish	Fischerbrand	FB0875712	Injection mold base
Thin wall glass capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4	For Injection needle
Agarose	Bioshop	AGA001	Injection mold
Microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	Injection mold
Sodium chloride	Bioshop	SOD001	Ringer's solution
Potassium chloride	Bioshop	POC888	Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate	Sigma	M2670	Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Ringer's solution
HEPES	Sigma	H4034	Ringer's solution
Glucose	BioBasic	GB0219	Ringer's solution
Calcium chloride	Sigma	C1061	Ringer's solution