Geomagnética Field (Gmf) and Plant Evolution: investigação dos efeitos dos Gmf Reversão sobre<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Desenvolvimento e Expressão Gênica

Resumo

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Resumo

Uma das observações mais estimulantes em evolução das plantas é uma correlação entre a ocorrência de campo geomagnético (GMF) reversões (ou excursões) eo momento da radiação de Angiospermas. Isto levou à hipótese de que as alterações no GMF polaridade pode desempenhar um papel importante na evolução da planta. Aqui, descrevemos um método para testar esta hipótese, expondo Arabidopsis thaliana para revertida artificialmente condições GMF. Foi utilizado um magnetómetro de três eixos e os dados obtidos foram utilizados para calcular a magnitude da GMF. Três fontes de alimentação DC foram conectados a três pares de bobinas de Helmholtz e foi controlada por um computador para alterar as condições GMF. As plantas cultivadas em placas de Petri foram expostas a ambos normal e invertida condições GMF. Experiências de exposição Sham também foram realizadas. Plantas expostas foram fotografados durante a experiência e as imagens foram analisadas para calcular o comprimento das raízes e área foliar. ARN total foi extraído de Arabidopsis e quantitativaTime-PCR real (qPCR) foram realizadas análises sobre a expressão gênica de cruciferina 3 (CRU3), protein1 transporte de cobre (COTP1), Redox Responsive Transcrição Factor1 (RRTF1), Fe superóxido dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal ascorbato peroxidase (TAPX), um ascorbato cytosolic Peroxidase1 (APX1) e NADPH / respiratória proteína explosão oxidase D (RbohD). Quatro genes de referência diferentes foram analisadas para normalizar os resultados da qPCR. O melhor dos quatro genes foi seleccionado e o gene mais estável para a normalização foi usada. Os nossos dados demonstram, pela primeira vez que a inversão da polaridade GMF utilizando bobinas triaxiais tem efeitos significativos sobre o crescimento da planta e a expressão do gene. Isso apóia a hipótese de que a reversão GMF contribui para induzir mudanças no desenvolvimento das plantas que possam justificar uma maior pressão seletiva, levando à plant evolução.

Introdução

O campo magnético da Terra (ou equivalente, o campo geomagnético, GMF) é um fator ambiental inescapável para todos os organismos vivos no planeta, incluindo plantas. A GMF sempre foi uma característica natural da Terra, assim que durante a evolução, todos os organismos vivos teve a sua ação. Um crescente corpo de evidências mostra que o GMF é capaz de influenciar muitos processos biológicos ^1. A GMF não é uniforme e existem diferenças locais significativas na sua magnitude e direcção à superfície da Terra. A GMF na superfície da Terra mostra uma ampla gama de amplitudes, que vão desde menos de 30 a cerca de 70 mT mT. A GMF protege a Terra e sua biosfera dos efeitos letais do vento solar, desviando a maioria de suas partículas carregadas através da magnetosfera ^2.

As plantas respondem aos estímulos do ambiente; e as respostas clássicas a fatores abióticos, como luz e gravidade ter sido thoroughly descrito, definindo as ditas respostas fototrópicos e gravitrópico. Muito pouco, ou nada, se sabe sobre os mecanismos de percepção e de respostas de plantas a campos magnéticos, apesar do grande número de trabalhos publicados sobre este tema e recentemente revisados ^​​1. Ao contrário do campo gravitacional, a GMF mudou de forma consistente durante a evolução de plantas representando, assim, um importante fator de estresse abiótico que tem sido considerado recentemente um potencial força motriz, eventualmente, contribuir para a diversificação plantar e especiação ^2. Inversões geomagnéticas (ou excursões) são alterações na polaridade da GMF. Durante a história da vida da Terra, reversões GMF ocorreu várias vezes. Estes exposto do planeta para períodos de redução da força GMF durante cada transição de polaridade. Alguns autores levantaram a hipótese de que essas transições períodos de baixa resistência GMF poderiam ter permitido radiação ionizante do vento solar para atingir a superfície da Terra, induzindo assim umestresse consistente para os organismos vivos, o que poderia ter sido forte o suficiente para induzir alterações genéticas acabou levando a plantar evolução ^2.

Uma análise detalhada das experiências que descrevem os efeitos dos campos magnéticos sobre plantas mostra um grande número de relatos conflitantes, caracterizados por uma escassez de mecanismos de interação biofísicos plausíveis. Muitas experiências são simplesmente irrealista, enquanto outros carecem de uma hipótese testável e, em última análise, não são convincentes ^3. Nos últimos anos, a evolução eo estado da investigação sobre o efeito de campos magnéticos na planta foi revisto ^2,4-11. Recentemente, o efeito de ambos campo magnético de baixa e alta tem sido exaustivamente discutido ^1, com um foco particular sobre o envolvimento de eventos de reversão GMF sobre evolução das plantas ^2.

O meio mais direto para fundamentar a hipótese de que a inversão GMF afetar a evolução das plantas é sintetizar um GMFreversão no laboratório testando a resposta das plantas à condições do campo magnético normais e inversas. Para testar a hipótese, que, por conseguinte, construída uma bobina de Helmholtz octogonal pares de campo magnético do sistema de compensação (triaxial triaxiais bobinas), que é capaz de reverter com precisão as condições GMF normais.

Utilizou-se de Arabidopsis thaliana como planta modelo e testou-se o efeito de revertida GMF na expressão do gene de alguns genes importantes: cruciferina 3 (CRU3), que codifica uma proteína de armazenagem 12S semente que é tirosina-fosforilada e o seu estado de fosforilação é modulado em resposta a ABA em sementes de Arabidopsis thaliana ^12,13; Transportes protein1 Copper (COTP1), que codifica uma proteína superfamília transporte heavy metal / desintoxicação com a função predominante na aquisição Cu do solo e desenvolvimento do pólen ^14; e Redox Responsive Factor1 Transcrição (RRTF1),que codifica um membro do FER (fator de resposta de etileno) da subfamília B-3 do FER / AP2 família fator de transcrição que contém um domínio AP2 que facilitar a co-activação sinérgica da expressão gênica vias e conferem tolerância cruzada para abióticos e bióticos salienta ^15.

Além disso, também analisadas cinco genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo: Fe superóxido dismutase1, (FSD1), que codifica uma enzima citoplasmática que enzimaticamente e rapidamente converte o anião superóxido _(O2 ^-) e água _(H2O) de peróxido de hidrogénio (H _{2 O 2)} e o oxigénio molecular _(O2) ^16; Catalase3 (CAT3), que codifica e que a enzima que catalisa a decomposição _de H 2 O ₂ em água e oxigénio ^17,18; Thylakoidal ascorbato peroxidase (TAPX), que codifica para uma peroxidase thylakoid cloroplasmático que elimina _H2O2 ^19; Ascorbato Peroxidase1 (APX1), que codifica uma peroxidase citosólica que elimina H _{2 O 2 e} representa um dos alvos potenciais de modificações pós-translacionais mediadas por moléculas de derivados ^NO-20; e NADPH-oxidase explosão respiratória proteína D (RbohD) que codifica uma enzima que gera _O2 ^- e desempenha um papel central na regulação do crescimento, desenvolvimento e respostas de stress em Arabidopsis ^21.

Nossa metodologia de reversão de campo fornece a primeira evidência de que a reversão GMF pode induzir uma mudança significativa na expressão gênica de morfologia e A. raízes e parte aérea thaliana. Este protocolo proporciona um meio inovador para avaliar o efeito de inversão GMF na morfologia da planta e a expressão de genes e pode ser usado para avaliar o efeito potencial de reversão GMF em outros aspectos do comportamento das plantas, e, assim, conduzir a discussão do role de reversão GMF sobre evolução das plantas.

Protocolo

1. Ajuste do Triaxial Bobinas

NOTA: A Figura 1 mostra as bobinas triaxiais utilizados para inverter a GMF.

1. Ligue o magnetômetro de três eixos, cuja sonda é inserida nas bobinas triaxiais.
2. Ligue o computador e iniciar o software magnetómetro que permite que dados sejam coletados de magnetômetro de três eixos.
3. Use os valores dos componentes relatados pela magnetómetro para calcular a magnitude da GMF. Por exemplo, com os valores magnetômetro: Bx = 6.39 microTesla, por = 36,08 microTesla, Bz = 20,40 microTesla calcular uma força de campo de 41,94 microTesla usando a seguinte equação: B = B _GMF + B _adicional, onde B _adicional = (Bx ^{2 +} por ² + Bz ^{2) e meio} (isto é, 41,9 mT no exemplo).
4. Ligue as três fontes de alimentação DC (dual range: 0-8V / 5A e 0-20V / 2.5A, 50W) cada um ligado a três couplES de bobinas de Helmholtz e ligado a um computador através de uma ligação GPIB (Figura 1B).
5. Conjunto de tensões das fontes de alimentação para gerar o campo magnético desejado com um vector de campo magnético invertida. Por exemplo, com B _GMF como no passo 1.3 e com o tamanho da bobina da instrumentação descrita aqui, definir as voltagens para _V x = 0,00 V, V _Y = 30,52 V, V _z = 0,00 V, a fim de gerar um novo resultante B = B + B _{GMF bobinas triaxiais} = (6,38, -36,08, 20,39) microTesla. ie, um novo campo com a mesma magnitude B _GMF, mas apontando para uma direção diferente.
6. Verificar o novo campo com o software magnetómetro usando o procedimento descrito em 1.3.
7. Expor plantas a normal e revertida condições GMF usando placas de Petri como descrito na seção 2.
8. Realizar experiências de exposição sham, mantendo a magnitude do campo igual a | B _GMF | e manutençãoo componente vertical do campo igual ao da GMF, mas alterando a direcção (ou seja, "do Norte, Este ou Oeste") da componente horizontal do campo com correntes iguais nas bobinas triaxiais, em comparação com a condição de inversão de campo. Para fazer isso, alterando a tensão dos rolos conforme descrito em 1.5.
   Nota: Esta exposição sham exclui potencial de aquecimento sutil ou efeitos vibracionais de ambos os rolos próprios ou dos equipamentos eletrônicos usados ​​para controlar as bobinas.
9. Executar experimentos duplo-cegos, aplicando condições de campo cego desde o pessoal que executa o restante dos experimentos e / ou interpretação dos dados.

2. Preparação de plantas Materiais e condições para o crescimento de plantas

1. Use sementes de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia 0 (Col 0), em seguida, colocar num tubo de 1,5 ml e esterilizar por tratamento da superfície com um 5% (w / v) de solução de hipoclorito de cálcio e 0,02% (v / v) de Triton X-100 em 80% de etanol (EtOH), para 10-12 min a 25-28 ° C, com agitação contínua. Em seguida, lavar duas vezes com 80% de EtOH, lavar com EtOH a 100% e, finalmente, enxaguar com água destilada estéril.
2. Prepare 1 L de Murashige e Skoog ²² (MS) modificado por adição de meio: 2,297 g de MS (0,5 x MS basal Mistura de sal), 10 g de sacarose, água desionizada até 1 litro, pH 5,8-6,0 ajustado com KOH. Adicionar 16 g de ágar e autoclave durante 20 min, 120 ° C.
3. Antes da solidificação, verter 80 mL de meio em cada um (120 x 120 mm ²⁾ placas de Petri quadradas. Semeie trinta sementes estéreis na placa, em seguida, selar as placas com um filme ceroso.
4. Vernalize horizontalmente as placas no escuro a 4 ° C durante 2 dias para potenciar e sincronizar a germinação, e, em seguida, expor placas de Petri para normal ou invertida GMF.
5. Expor sementes num ambiente de clima controlado a 22 ° C numa posição vertical em experiências paralelas tanto no interior das bobinas triaxiais e fora das bobinas triaxiaissob uma programação fotoperíodo de 8 h escuridão e 16 horas de luz, utilizando lâmpadas de vapor de sódio (220 x ¹⁰ -6 E m ^{-2 s -1).} Use um filme de gelatina azul para holofotes para reduzir o componente vermelho de lâmpadas.
6. Expor as plantas por 10 dias antes da extração de RNA para ambos normal (controle) e inversão (tratamento) as condições GMF.
7. Após a exposição, tirar fotos de placas de Petri.
8. Use o software ImageJ para calcular áreas comprimento da raiz e da folha.
   1. Resumidamente, medir o lado da placa de Petri, em seguida, abra a imagem da placa de Petri e usando a opção de linha "reta" para desenhar uma linha que atravessa exatamente o lado da placa.
   2. No menu "analisar", selecione "escala set" e insira a distância real na caixa "distância conhecida" (por exemplo, 120 mm), em seguida, insira a unidade de comprimento (mm); finalmente, clique na opção "global" para fazer as configurações disponíveis para todas as medições.
   3. Para roocomprimento t, siga atentamente a forma da raiz, usando a ferramenta à mão livre. Meça o comprimento usando a opção "medida" no menu "analisar". Continue a medir todas as raízes na imagem e salve o arquivo para mais análises estatísticas.
   4. Para a área foliar, a partir do menu "Imagem" usar a opção e, em seguida, "limite de cor" ajustar. Selecione a folha individual e no menu "analisar", selecione "analisar partículas". Salve as medições individuais para análises estatísticas.

3. Extracção de RNA total de Arabidopsis, Quantitative PCR em Tempo Real (qPCR) As condições de reacção e os iniciadores para Arabidopsis

1. Recolha separadamente 30 brotos e raízes 30 e congelar imediatamente em nitrogênio líquido. Então moer em nitrogênio líquido com almofariz e pilão.
2. Isolar o ARN total utilizando um kit de purificação e kit de tratamento de DNase isenta de RNase usando FABRICAÇÃOinstruções de pronto-socorro.
3. Verificação da qualidade e quantidade da amostra, utilizando um kit de ARN a electroforese capilar em gel nano e de acordo com as instruções do fabricante. Confirme a quantificação do RNA por espectrofotometria.
4. Use 2 ug de ARN total e iniciadores aleatórios, utilizando um kit de transcrição reversa para ADNc obter ADNc de primeira cadeia de acordo com as recomendações do fabricante.
5. Executar todas as experiências em um Real-Time System usando SYBR I verde com ROX como um padrão de carga interno.
6. Realizar a reacção com 25 ul de mistura que consiste em 12,5 ul de 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 ul de ADNc e os iniciadores 100 nm. Use os iniciadores listados na Tabela 1. Inclua na controlos controlos não-RT usando RNA total (sem transcrição reversa para monitorizar a contaminação de ADN genómico) e controlos sem molde (molde em vez de água).
7. Calcular iniciador eficiência para todos os pares de iniciadores que utilizam a normamétodo da curva ^23.
8. Use as seguintes condições de PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 30 seg a 58 ° C, e 30 seg a 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 20 seg a 57 ° C, e 30 seg a 72 ° C.
9. Leia fluorescência após cada fase de hibridação e extensão. Para todas as corridas, executar uma análise de curva de fusão a partir de 55 até 95 ° C, incluindo o segmento de dissociação no perfil térmico. Use a tela curva de dissociação, acessado através da aba resultados para exibir o perfil de dissociação (enredo da fluorescência em função da temperatura). Certifique-se que o conjunto de dados recolhidos durante o segmento de dissociação do experimento é selecionado para análise utilizando o ecrã Análise / Setup.
10. Determinar a linear gama de concentração modelo de ciclo de valor limiar (valor Ct) através da realização de uma série de diluições de dez vezes (de 1 a 10 ³ fold) utilizando cDNA de três extrações de RNA independentes analisadas em três repetições técnicas ^24,25.
11. Analisar todas as parcelas de amplificação com o Real-Time PCR software instrumento para se obter valores Ct. Calibrar e normalizar os níveis de ARN em relação com o nível dos melhores genes de manutenção da seguinte forma: 3.11.1) Acesse a tela Amplification Plots através da guia Resultados, selecione a rampa ou planalto para o qual os dados devem ser analisados ​​por meio de tela / Configuração da Análise Seleção, e, em seguida, selecione o dRn (com correção de linha de base de fluorescência normalizada) a partir do menu de fluorescência no painel de comando. Acesse a placa da tela Valores de exemplo através da guia Resultados para exibir valores Ct para os poços amostrados.
12. Use quatro genes de referência diferentes [por exemplo, citoplasmática gliceraldeído-3-fosfato, (GAPC2), especi ubiquitinaIC protease 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) e o factor de elongação 1B subunidade alfa-2 (eEF1Balpha2)] para normalizar os resultados da PCR em tempo real. Selecione o topo do ranking gene usando um software de análise de ^26; e utilizar o gene mais estável para normalização.
    1. Resumidamente, organizar os dados de entrada em uma folha de Excel com a primeira coluna que contém os nomes de genes e primeira linha contendo os nomes de amostra. Em seguida, selecione o software de análise a partir do menu-bar. Use a caixa de diálogo para selecionar os dados introduzidos.
    2. Em seguida, verifique os campos de nomes de exemplo, nomes de genes e saída simples apenas. Clique no botão Ir para realizar a análise. Escolha do topo gene classificados (que tem o valor menor estabilidade) como gene candidato mais estavelmente expressas.
13. Os dados do gráfico, mostrando a expressão mudança vezes diferencial em ambos os brotos e raízes.

4. Análise estatística

1. Expresse dados como valores médios ± erro padrão. Compare o control e os grupos de tratamento através da realização de análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey com Bonferroni e Dunn-Sidak teste Probabilidade Ajustado (0,95% de confiança).

Resultados

O objectivo do presente protocolo é o de proporcionar um método para avaliar se a inversão do campo geomagnético (GMF) pode afectar o desenvolvimento da planta e a expressão de genes de Arabidopsis thaliana ecotipo Col 0. bobinas triaxiais, como mostrado na Figura 1A são usados ​​para reverter a GMF quando conjunto com as tensões de accionamento apropriados (Figura 1B), obtido como descrito no passo 1.5 do protocolo. As dimensões das bobinas são triaxiais ~ 2 x 2 x 2 m ^3, o que permitiu que o espaço suficiente com condições GMF invertidas para acolher várias placas de Petri. Os controlos foram cultivadas nas mesmas condições ambientais e em valores GMF normais. Após 10 dias de exposição ao normal e invertida condições GMF, o fenótipo de plantas apresentaram alterações morfológicas evidentes. Como mostrado na Figura 2, as plantas de controlo (isto é, cultivadas em condições normais GMF) mostrou significativamente com comprimentos de raiz (Dunn-Bonferroni Sidak e ajustado Prob <0,001;T de Student = 10,68, df = 31) os valores mais elevados (29,41 mm; EPM = 1,04; N = 32) no que diz respeito às plantas expostas à invertida GMF (17,53 mm; EPM = 0,58; N = 36). Em plantas GMF-invertidas, a morfologia dos rebentos também foi alterada, mostrando um desenvolvimento reduzido de expansão folheto. Plantas expostas a condições normais mostrou uma área foliar média de 4,95 ^mm2 (SEM 0,025, N = 54), enquanto as plantas expostas a condições GMF invertidas mostraram significativamente (Dunn-Sidak e Bonferroni ajustado Prob = <0,001; t de Student = 31,32, df = 53) inferior da folha valores de área (3,71 milímetros ^2; SEM = 0,032; N = 54). Portanto, a exposição de Arabidopsis a condições GMF invertidas induziu uma redução no comprimento de raiz e área foliar.

Expansão foliar e crescimento da raiz são dependentes ambos da divisão eo alongamento das células ^27. Portanto, o desenvolvimento da planta, produtividade e condicionamento físico geral são dependentes de uma shoot- e sistema radicular arquitetura ideal ^{28. O tamanho reduzido comprimento das raízes e folhas das plantas expostos a condições GMF invertidas indicar a presença de um sistema de detecção capaz de não só perceber variações na intensidade de campo magnético, mas também para responder a alterações do campo magnético "sentido" em comparação com a gravidade. A hipótese de que a reversão GMF pode afetar o crescimento da planta encontra provas convincentes em nossos experimentos, que demonstram que as condições de reversão GMF pode afetar significativamente o desenvolvimento da planta.}

As alterações morfológicas foram também acompanhada por alterações na expressão de genes. Entre os genes de manutenção, o gene mais estável foi o factor de alongamento 1B subunidade alfa-2. O primeiro grupo de genes (CRU3, COTP1, RRTF1) mostrou uma alteração dramática na expressão do gene (Figura 3). Disparar expressão de todas as três genes foi significativamente aumentada (P <0,05) por cerca de 2.5 vezes, em plantas expostas a reservad condições GMF. Raiz de expressão CRU3 foi regulada positivamente nas raízes em plantas expostas a condições GMF normais, mas foi significativamente (P <0,05) regulada negativamente em condições GMF invertidas. O oposto foi encontrado para COTP1 e RRTF1, que foram regulados negativamente em condições normais e regulada positivamente na presença de reversão GMF (Figura 3).

Cruciferina (uma globulina 12 S) é a proteína mais abundante no armazenamento das sementes de A. thaliana e outras crucíferas e é sintetizada como um precursor no retículo endoplasmático rugoso. Em seguida, é transportada para os vacúolos de armazenamento ¹³ proteína. Germinação de plântulas requer a ruptura da cruciferina, que é utilizado como uma primeira fonte de azoto. Down-regulação da cruciferina degradação reduz o desenvolvimento de embriões, ao alterar as estruturas celulares ou componentes celulares de desenvolvimento ^29,30. Nossos resultados mostram que a regulação alta de CRU3 correlaciona-se comuma folha inferior de expansão e um comprimento de raiz reduzida, indicando, assim, que este gene é sensível à reversão GMF e que a sua sobreexpressão pode contribuir para a redução do desenvolvimento da planta. Além disso, a reversão GMF induz uma regulação negativa significativa de CRU3 em raízes, o que se correlaciona com um comprimento de raiz reduzida. O cobre é um co-fator essencial para os processos-chave em plantas, mas exerce efeitos prejudiciais quando em excesso; assim, superexpressão de transporte cobre compromete o crescimento da planta. O efeito da reversão GMF era uma superexpressão significativa de COTP1 em ambos os brotos e raízes, o que explica o baixo crescimento da planta. Ion estresse prejudica o metabolismo dos cloroplastos, que está firmemente ligada ao estado redox da célula. Na Arabidopsis o factor de transcrição RRTF1 é importante para a expressão de genes associados à capacidade para se adaptarem às alterações redox ^31. Por isso, quando as plantas são expostas aos estímulos externos capazes de alterar o seu desenvolvimento fisiológico eprogramas de al uma superexpressão deste fator de transcrição importante é esperado. Reversão da GMF induziu uma superexpressão significativa de RRTF1 em ambos os brotos e raízes, indicando, assim, maiores respostas ao estresse oxidativo de plantas a condições GMF invertidas.

Resultados interessantes são obtidos através da análise dos cinco genes envolvidos no stress oxidativo. Em geral, todos os genes extraídos e analisados ​​na parte aérea não apresentou diferenças significativas (P> 0,05) quando as plantas foram cultivadas em condições normais ou revertidas GMF (Figura 4 e Figura 5). No entanto, uma regulação negativa significativa foi sempre observada em raízes de plantas expostas a condições GMF invertidas. Em particular, mostrou CAT3 a regulação negativa mais elevada (Figura 5), seguido em ordem de regulação negativa por APX1, FSD1, RBOHD e TAPX (Figura 4).

Tolerância cruzada a umstress biótico e biótico é fornecido pela activação de diferentes genes envolvidos em várias vias bioquímicas. factor de transcrição RRTF1 facilita a co-activação sinérgica da expressão de genes destas vias de ^15,31, e pode ser potencialmente envolvidos no stress oxidativo ^32. Portanto, a regulação positiva de RRTF1 é esperado quando a eliminação de oxigénio é reduzida. Regulação negativa de enzimas eliminadoras de raiz correlaciona-se com a regulação positiva de RRTF1, que age em resposta ao aumento do estresse oxidativo. A regulação baixa dramática da raiz CAT3, APX1 e TAPX indica a capacidade reduzida de células das raízes para limpar H _{2 O 2,} que é acompanhado pela redução da capacidade para dismutar o ânion superóxido por regulação negativa da FSD1. As respostas ao estresse oxidativo é maior nas raízes, que parecem ser o principal sítio de percepção GMF revertida.

Figura 1. Geomagnetic sistema de campo de Compensação. (A) (triaxiais bobinas que compreendem um par de bobinas para cada octogonais de três eixos perpendiculares) usado para inverter o vector de campo geomagnético. (B) Uma fonte de alimentação controlado por computador é ligado a cada par de bobinas de Helmholtz. (As tensões estes números são arbitrários) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Efeito da inversão geomagnética em Arabidopsis campo morfologia. Após dez dias de exposição, as plantas de controlo (ou seja, aqueles expostos a condições normais GMF) mostram uma significativamente maior comprimento de raiz e mais expanfolhetos ded em comparação com as plantas que foram expostos a condições GMF invertidas. Bar Metric = 18 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Efeitos da reversão campo geomagnético na expressão do gene Arabidopsis. Depois de dez dias de exposição, o RNA total de controlo e as plantas tratadas foi extraído e analisado por PCR em Tempo Real para análise de expressão. O efeito da reversão da GMF era induzir uma mudança drástica na expressão gênica de todos os genes que foram testados CRU3, cruciferina 3;. COTP1, Cobre Transportes protein1; RRTF1, Redox Responsive Factor1 Transcrição. As barras indicam o erro padrão; asteriscos indica (P <0,05) diferenças significativas entre plformigas expostas a condições GMF revertida e normais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Efeito da reversão campo geomagnético sobre a expressão gênica relacionados com antioxidante Arabidopsis. Depois de dez dias de exposição, o RNA total de controlo e as plantas tratadas são isolados e utilizados para análise de expressão de genes utilizando PCR em tempo real. O efeito da reversão da GMF era induzir alterações significativas na expressão gênica filmagem; no entanto, uma regulação baixa drástica foi observada na expressão gênica radicular das plantas cultivadas sob condições GMF invertidas TAPX, Thylakoidal peroxidase do ascorbato;. APX1, Ascorbate Peroxidase1; FSD1, Fe Superoxide dismutase1; RbohD, NA. DPH / Respiratory explosão oxidase proteína D barras indicam o erro padrão; asteriscos indica (P <0,05) diferenças significativas entre as plantas expostas a condições GMF invertidas e normais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Efeitos da inversão geomagnética em Arabidopsis campo catalase 3 (CAT3) a expressão do gene. Depois de dez dias de exposição, o RNA total de controlo e as plantas tratadas são isolados e utilizados para análise de expressão de genes utilizando PCR em tempo real. O efeito da reversão da GMF era induzir alterações significativas na expressão gênica filmagem; No entanto, uma regulação negativa drástica foi observada na expressão do gene da raiz de plantas crescidas sob condições GMF invertidas. As barras indicam Erro padrãor; asteriscos indica (P <0,05) diferenças significativas entre as plantas expostas a condições GMF invertidas e normais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nós recentemente mostrou que existe uma correlação surpreendente entre reversões GMF eo momento em que o desvio da maior parte das linhagens familiares Angiospermas ocorreu ^2. No entanto, apesar das hipóteses estimulante e a pletora de estudos sobre o efeito de intensidades variadas GMF, a hipótese de que a inversão GMF pode-se induzir mudanças significativas na expressão de genes de plantas e morfologia nunca foi demonstrada. Aqui mostramos pela primeira vez, um método que utiliza uma bobina de Helmholtz octogonal triaxial para inverter GMF no nosso laboratório, e que a reversão do campo magnético ambiente pode causar mudanças fenotípicas e modulação da expressão génica em plantas.

A fim de obter reversão GMF (ou modificação) ao longo de um volume suficiente para as experiências de crescimento de plantas (2 x 2 x 2 m ^3), foi construído um sistema de bobinas de Helmholtz octogonal. Este sistema não está disponível comercialmente (bobinas de Helmholtz são geralmente em forma de anel e menor)e os custos de construção foram consideráveis. É importante ressaltar que este sistema oferece robusta modificação campo, com excepcional tempo estabilidade e homogeneidade nos campos magnéticos modificados.

O sistema é concebido e construído para reduzir o valor da GMF a um milésimo de as condições normais ou para reverter qualquer das três dimensões do campo magnético. No entanto, o desenho das bobinas não permite gerar uma força de campo magnético de alta. Portanto, este instrumento, na presente forma não é adequado para experiências concebidas para avaliar os efeitos de alta intensidade de campo magnético sobre as plantas ou outros organismos.

No laboratório, a alteração da GMF semelhantes aos descritos neste método foi obtido por métodos diferentes, incluindo blindagem por em torno da zona experimental por meio de placas metálicas ferromagnéticas com elevada permeabilidade magnética, que se desviem campos magnéticos e concentrá-las dentro do próprio metal. ºe vantagem do uso de bobinas de Helmholtz é que o sistema permite que as plantas a ser exposto a condições mais naturais (luz, a circulação do ar, etc), tornando-o ideal não só para os estudos in vitro (tal como com a utilização de pratos de Petri) mas também in vivo para o crescimento das plantas e as experiências de desenvolvimento. As dimensões do nosso sistema de criar um espaço que permite uma supressão até <1/1000 da GMF natural, ao longo de um 25 x 25 x 25 cm ³ de volume esférico (ver Figura 1A), permitindo assim a realização de vários placas de Petri ou algum pequeno potes para o crescimento das plantas.

O método aqui apresentado foi aplicada ao estudo da biologia das plantas; No entanto, o sistema permite que uma vasta gama de experimentação, incluindo microbiologia e virologia, bem como estudos sobre nematóides (por exemplo, Caenorhabditis elegans), artrópodes e pequenos animais (incluindo ratinhos e ratos). Por conseguinte, os testes de hipótese de que a inversão da GMF é capazpara induzir alterações morfológicas e de transcrição também poderia ser estendida a muitos outros sistemas vivos, em última análise, talvez até mesmo para as células humanas.

A GMF está mudando constantemente e flutuante. Portanto, nas nossas experiências é um desafio importante para proporcionar uma compensação constante da GMF, a fim de obter os novos valores GMF desejados. Isso só pode ser alcançado por um controle contínuo de valores de campos magnéticos através da leitura de valores magnetômetro e compensação de tensão. Portanto, o sistema pode compensar a parte de variação lenta do GMF, mas ele não faz nada para flutuações de frequência mais elevada.

Em conclusão, a utilização de bobinas triaxial para inverter o vector GMF foi fundamental para demonstrar que esta inversão do vector GMF é capaz de induzir modificações morfológicas das plantas e expressão diferencial de genes. Os resultados obtidos com o método apresentado proporcionar uma evidência convincente em suporte da hipótese de que a re GMFversals poderia ter sido uma das forças motrizes para a evolução das plantas em escalas de tempo geológicas ^2.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three-axis magnetometer	Bartington	Mag-03MC	triaxial fluxgate magnetometer
Magnetometer power supply	Bartington	Mag-03PSU	triaxial fluxgate magnetometer
Magnetometer software	Bartington	Mag03DAM	triaxial fluxgate magnetometer
DC power supply	Agilent Technologies	E3642A
Calcium hypochlorite	Sigma	211389
Triton X-100	Sigma	X100
Ethanol	Sigma	2860
GroLux Sodium vapor lamps	OSRAM Sylvania	600W
RNeasy Plant RNA kit	Qiagen	74903
RNase-Free DNase	Qiagen	79254
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2938B
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific	not available
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
Mx3000P	Agilent Technologies	401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix	Fermentas International, Inc	K0221
Parafilm	Sigma	P7793-1EA
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Petri dish square (120 x120 mm2)	Sigma	Z692344