Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Resumo

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Resumo

Manipulação e cultura de embriões de rato é um poderoso contudo largamente subutilizadas tecnologia aumentando o valor deste sistema modelo. Por outro lado, a cultura de células tem sido amplamente utilizado em estudos de biologia do desenvolvimento. No entanto, é importante para determinar se as células cultivadas in vitro realmente representam em tipos de células in vivo. A enxertia em embriões de células, seguido por uma avaliação da sua contribuição durante o desenvolvimento é um método útil para determinar o potencial de células cultivadas in vitro. Neste estudo, descrevemos um método de enxerto de células para um local definido de embriões de ratos após a implantação inicial, seguida por cultura ex vivo. Apresentamos também um método de electroporação optimizado que utiliza capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a localização precisa e ajustamento do número de células que receberam ADN exógeno com tanto alta eficiência de transfecção e da morte celular baixo. Estas técnicas, que não necessitam de qualquer spequipamentos ecialized, render manipulações experimentais da gastrulação e organogénese embrião de rato em fase de arranque possível, permitindo a análise de compromisso em subpopulações de células cultivadas e o efeito de manipulações genéticas in situ na diferenciação celular.

Introdução

A cultura de células tem sido amplamente utilizado em estudos de biologia do desenvolvimento. Mouse células estaminais embrionárias (CES) e de células estaminais (EpiSCs epiblast) pode diferenciar-se em todas as três camadas germinais in vitro e são um modelo útil para a diferenciação de células de mamífero na embriogénese precoce. A derivação destas linhas celulares, abriu uma oportunidade para a manipulação in vitro e investigação detalhada dos eventos localizada sinalização e redes de transcrição que operam durante a modelagem embrionária precoce. No entanto, continua a ser importante para determinar a relevância in vivo de quaisquer manipulações realizadas em cultura. O potencial in vivo de rato CES derivadas de embriões pré-implantação foi avaliada através da introdução-los de volta em embriões pré-implantação (mórulas ou blastocistos) ^1. No entanto, EpiSCs que representam as células do epiblasto em embriões postimplantation não pode integrar de forma eficiente em embriões pré-implantação ^2,3. Nossa previonos resultados demonstraram que EpiSCs pode gerar de forma eficiente quimeras e contribuir para todas as camadas germinativas, quando enxertados em embriões postimplantation ^4. Assim, a melhor maneira de avaliar as células cultivadas in vitro é apresentá-los ao seu ambiente in vivo correspondente.

A electroporação é um método amplamente utilizado para entregar moléculas exógenas em células alvo em tanto in vivo como em experiências in vitro. A energia eléctrica pode gerar um grande número de poros na membrana celular, o que permite que o ácido exógeno desoxirribonucleico (ADN) ou de ácido ribonucleico (ARN) para entrar nas células. Um dos maiores desafios para esta técnica é combinar viabilidade celular ideal com alta eficiência electrotransfection ^5,6. Por electroporação de ácidos nucleicos em tecidos embrionários, banhados a ouro eléctrodos foram mais comumente utilizado, permitindo que a segmentação das células em uma ampla gama espacial ^7-9. Para conseguir um mais locatransferência de genes lized, um eléctrodo em forma de agulha tem sido utilizada para obter um campo eléctrico focal ^10,11. Usando este método, os autores demonstraram que, após a electroporação, células a cerca de 30-60 tinha tomado a construção de ADN ^11. No entanto, parece que ajustar com precisão o número de células electroporadas permanece difícil, com um eléctrodo de largura fixa. A técnica de electroporação capilar foi usado para entregar os plasmídeos para células individuais ^12-14. No entanto, esta técnica não foi aplicada para electroporating plasmídeos aos embriões ex vivo. Mais recentemente, um microdispositivo foi relatado para alguns localmente electroporar células distais viscerais endoderme (menos de 4 células) em embriões de ratinho após a implantação precoce ^15. No entanto, ainda não se sabe se este dispositivo pode eficientemente alvo ectoderma e mesoderma ex vivo.

Neste estudo, descrevemos dois novos métodos para avaliar a função celular e gênica em pós cedo-implantation embriões. Nós primeiro demonstrar como enxertar células cultivadas in vitro em locais definidos em embriões de rato para avaliar seu potencial in vivo. A integração das células enxertadas e seus descendentes, todas marcadas por uma marcação genética (por exemplo, uma proteína fluorescente verde (GFP), podem ser adicionalmente examinados por imunocoloração de proteínas específicas de tecidos ^4. Em segundo lugar, descreve-se um método aperfeiçoado para entregar precisamente ADN a locais localizados no embrião através de electroporação. Em vez de utilizar um eléctrodo em forma de agulha, que inserido um fio fino dentro de uma ponta fina capilar de vidro, e demonstrar que esta modificação pode entregar o ADN a um pequeno número de células com elevada eficiência e limitada morte celular. Além disso, mostramos que utilizando capilares de vidro com diferentes tamanhos de abertura, podemos controlar o número de células electroporated. Portanto, acreditamos que este método pode ser de grande utilidade para estudar a modelagem embrionária precoce envolvendo um pequeno número océlulas f.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com os Regulamentos do Reino Unido Escritório conforme especificado nas Animais (Scientific Procedures) Act (1986) sob o número 60/4435 Projeto de licença. Para a coleta de embriões em estágios específicos de desenvolvimento, acasalamentos cronometrados foram criadas O / N. Meio-dia no dia de encontrar um rolhão vaginal foi designado dia embrionário (E) 0.5.

1. Dissecando o E7.5 ou E8.5 pós-implantação de embriões para Ex Cultura Vivo

1. Sacrificar os ratos fêmeas grávidas por deslocamento cervical.
2. Isolar o útero usando uma tesoura, segurando-o com uma pinça e coloque em um prato de 30 milímetros preenchido com meio M2.
3. Retire com cuidado para além do miométrio usando dois pares de fórceps finos.
4. Descascar a decídua, tomando cuidado para não perfurar as cavidades extraembryonic.
5. Remover a membrana de Reichert, apertando-a com uma pinça e, lentamente, separando-o do embrião.
6. Confira os embriões sob uma dissecaçãoestereomicroscópio para assegurar que o saco vitelino, âmnio e cone ectoplacental estão intactos.
7. Transferir os embriões para um prato limpo de M2 ​​usando uma pipeta e coloque em uma tampa de plástico 30 milímetros placa de Petri sobre gelo (a 'plataforma de gelo') para embriões parcialmente frio.
8. Se necessário, armazenar embriões em m2 sobre uma plataforma de gelo durante até 1,5 h, por exemplo., Durante a preparação ou a manipulação de pequenos lotes de meios de ~ 3-4 embriões à TA.
   Nota: Recuperação e dissecação de embriões de roedores tem sido descrito em detalhe anteriormente ^7,8,16.

2. Prepare o embrião Meio de Cultura

1. Recentemente descongelar quer comercialmente disponíveis-soro de rato (ver Glanville-Jones et ai. ¹³ de especificações) ou soro de rato preparado em casa de acordo com Copp Cockcroft e ¹⁶ que foi inactivado pelo calor durante 30 min a 56 ° C e congelado em 1 ml alíquotas a -80 ° C
   Nota: disponíveis comercialmente soro de rato é aceitável por períodos de cultura de 24-36 horas, embora soro preparados em casa é, em nossa experiência, superior para períodos de cultura até 48 horas.
2. Recentemente preparar um excesso (por ex., 10 ml) de suplementos definidos que consistem em Meio Essencial Mínimo de Glasgow (GMEM), 1% de não-aminoácidos essenciais (NEAA), 2 mM de L-glutamina e piruvato de sódio 1 mM.
3. Calcular o volume de meio de cultura que é necessária de acordo com o número de embriões de cada fase que vão ser cultivadas (ver secção 3). Misturar o soro de rato com os suplementos definidos para perfazer 50% de meio de cultura (1: 1 (v / v) de soro de rato: suplementos definidos) e / ou 75% de meio de cultura (3: 1 (v / v) de soro de rato: definida suplementos).
4. Passar o meio de cultura de embriões através de um filtro de 0,45 um e adicionar 10.000 UI / ml de penicilina e 10 ug / ml de estreptomicina.
   Nota: solução de L-glutamina e piruvato de sódio recentemente descongelado é crucial para o desenvolvimento do embrião durante a cultura ex vivo.

e "> 3. ex vivo Cultura Condições para diferentes estágios embrionários

1. Para os embriões E7.5: cultura estática utilizando placas de 4 poços em uma incubadora fornecido com _5% de CO2 em ar a 37 ° C durante 24 h. Cultura até dois embriões por poço em 1 ml de 50% de meio de cultura.
2. Para os embriões E8.5: utilizar um aparelho de cultura de rolos ⁸ que roda a 35 rotações / min incorporando gaseificação contínua com 5% de CO ₂ no ar a 37 ° C durante 24 horas (1 ml de 50% de meio de cultura por embrião).
3. Para os embriões E9.5: utilizar um aparelho de cultura de rotação do rolo em 35 rotações / min incorporando gases fornecidos com _5% de CO2, 40% de O _{2 55%} de N2 a 37 ° C durante 24 horas (1 ml de 75% de meio de cultura por embrião).
   Nota: embriões cultura dentro de 3 horas após a eutanásia dos ratos como períodos prolongados em M2 afetar adversamente o desenvolvimento. Ver Copp Cockcroft e ^{16 para} o método de cultura ex vivo embrião.

4. Grafting células cultivadas em E7.5 ou E8.5 embriões de camundongos

1. Fisicamente raspar EpiSCs, que expressam GFP ubiquamente, a partir de uma placa de cultura de 6 poços utilizando uma pipeta de ponta de 20-200 ul e colocá-los em um prato 30 de mM contendo os embriões
   Nota: Para inserir aglomerados de células nos embriões, as células devem ser fisicamente sucateados em vez de tripsina.
2. Anexar um enxerto capilar mão-puxado para o tubo do aspirador para fazer uma pipeta de boca.
3. Gentilmente sugar a pipeta de boca para chamar um ou mais aglomerados de células de tamanho> 20 células no capilar enxertia.
4. Suavemente soprar as células, para dispersar parcialmente grandes aglomerações.
5. Selecione um amontoado de células contendo ~ 10-20 células e chupar no capilar enxerto de novo, mantendo-o perto da abertura do capilar. Tenha cuidado para não mover o amontoado de células dentro e fora do capilar repetidamente, para evitar a ruptura em pedaços menores.
6. Segurar frouxamente o embrião no lugar com um par de pinças e inserir o enxertocapilar na região de interesse para criar uma abertura.
7. Gentilmente expulsar o moita fora do enxerto capilar, deixando a seqüência curta de 10-20 células apresentados no embrião.
8. Repetir o procedimento de enxerto para o número desejado de embriões. Use o tamanho dos lotes de embriões 3-4 por conveniência.
9. Deixando de embriões no mesmo prato de meio M2, imagem os embriões enxertados usando um composto de fluorescência dissecando microscópio com câmera, mantendo o tempo de imagem ao mínimo, para evitar a exposição dos embriões à luz e calor excessivos.
   Nota: determinar os tempos de imagem empiricamente como estes dependerá das especificações da câmara e microscópio, assim como a natureza e a intensidade de fluorescência do fluoróforo.
10. Transferir o embrião num pastette com um volume mínimo de meio M2 para pré-equilibrada meio de cultura (ver secção 3) imediatamente depois de imagiologia.
    Nota: Examine cuidadosamente a morfologia dos embriões após a enxertia. Só a cultura INTACembriões t.

5. Materiais Handmade Eletroporação e Configuração Aparelho (Prepare os seguintes itens antecipadamente de Experimentos eletroporação):

1. Para ADN pipetas de injeção: puxe pipetas de injeção de DNA usando uma micropipeta extrator horizontal. Pipetas de injecção devem ter uma ponta fina com uma abertura inferior a 10 um, para evitar danos nos tecidos quando se injecta o DNA no interior das cavidades embrionárias.
2. Por electroporação de vidro capilar: utilizar um microforge para cortar a abertura de pipetas de injecção de ADN para um diâmetro interno de 20 ou 30 um. Para evitar o dano celular quando o capilar está em contacto com o embrião por electroporação, a ponta do capilar de vidro deve ser cortado de forma limpa e não conter bordas afiadas, quebradas.
3. Para eléctrodo capilar artesanal (ânodo) (Figura 1): inserir um diâmetro de fio de platina 0,2 mm num capilar de vidro de electroporação com uma abertura fixa de 20 ou de 30 um de diâmetro para focar os eleitosric corrente e entregar o ADN de plasmídeo de uma pequena região de interesse no embrião.
4. Para eléctrodo em forma de L artesanal (cátodo) (Figura 1): curvar um fio de platina diâmetro 0,2 mm a criação de um "L", com a parte horizontal do "L" de cerca de 1 mm de comprimento.
5. Prenda cada eletrodo de platina a um fio isolado fina e inseri-lo em um suporte de agulha microinjeção coberta por fita isolante.
6. Monte os suportes da agulha sobre detentores do instrumento micromanipulação padrão.
7. Ligue o circuito como mostrado na Figura 1: ligar o eléctrodo capilar para o ânodo da fonte de alimentação; ligar o eléctrodo em forma de L para o ânodo do multímetro; conectar o cátodo do mulimeter para o cátodo da fonte de alimentação.

6. Eletroporação E7.5 ou E8.5 embriões de camundongos

1. Encher o capilar de vidro electroporação com PBS para dentro de 1-2 mm do topo e inserir o straiGHT eléctrodo de platina (ânodo) para o capilar de vidro até atingir a parte inferior do tubo capilar.
2. Ancorar o eléctrodo em forma de L (cátodo) na superfície de uma placa de Petri 30 milímetros cheio com PBS.
3. Transferir o embrião do meio M2 para o prato eletroporação PBS-cheia.
4. Insira a agulha de injeção de epiblasto de lateral para dentro da cavidade amniótica do embrião. Usando uma bomba pneumática pico, injetar solução de ADN (pCAG-Cre: GFP ou pCAG-GFP 1-1,5 ug / ml, com 0,01% de corante corante alimentar verde) dentro da cavidade até que esteja completamente cheio. Para os embriões E7.5-E8.5, solução de ADN inferior a 5 ul é necessário para um embrião. Usando o corante verde como um indicador, tenha cuidado para não estourar o embrião.
5. Posicionar cuidadosamente o embrião entre os eléctrodos e mover o eléctrodo capilar para o local exacto em que o ADN é para ser entregue.
   Nota: A orientação do embrião depende da região na qual o ADN é para ser electroporadas.
6. Electropoavaliar o embrião usando 200 volts (V) em 6 pulsos, cada um dos 50 ms de duração com um intervalo de 1 segundo entre cada pulso.
7. Transferir o embrião de pré-equilibrada meio de cultura imediatamente após a electroporação. Se desejado, repetir o processo para o próximo embrião.
   Nota: Adicione o meio de cultura em um recipiente estéril e colocá-lo na incubadora de cultura de pré-equilibrar o meio.
8. Para detectar células electroporated 2 horas após cultura, transferir os embriões para uma limpeza 30 milímetros placa de Petri de meio M2 usando uma pastette. Imagem os embriões como no passo 5,9 utilizando um composto de fluorescência dissecando microscópio.
9. Transferir os embriões de volta para a cultura utilizando um pastette imediatamente depois de imagiologia.
10. Para detectar células mortas causadas por electroporação, manchar os embriões com uma célula de corante vermelho-extremo impermeável à membrana nuclear (1: 200 em meio de cultura de embriões) a 37 ° C durante 10 min, 2 horas após a electroporação (Opcional)
11. Para contar as células electroporadas, corrigir o Embryos em 4% de paraformaldeído (PFA) para 2-4 horas a 4 ° C, manchar o núcleo com um ultravioleta ou vermelho-extremo contraste nuclear fluorescente e imagem os embriões utilizando um microscópio confocal (Opcional).
    Nota: o crescimento embrionário é adversamente afetada se deixado muito tempo em PBS. Portanto, certifique-se de que o tempo necessário para electroporate cada embrião é minimizado (<5 min por embrião).

Resultados

Enxerto

EpiSCs que expressam EGFP ubiquamente (R04-GFP, a partir de derivados E6.5 epiblast, e C2, derivados in vitro a partir mESCs) ⁴ foram raspadas manualmente a partir do prato de cultura e enxertados em diferentes locais de embriões E7.5 (Figura 2A). Os embriões foram cultivados ex vivo e analisadas após 24 horas. A distribuição das células do doador foi avaliada por microscopia de fluorescência. Se as células doadoras incorporada, elas proliferaram e seus derivados disperso dentro dos embriões hospedeiras (Figura 2B). Tem sido observado que os enxertos contendo 10-16 células incorporadas eficazmente nos embriões hospedeiras (Figura 2A, 2B) e, no entanto, mais do miocárdio células não resulta em melhor chimaerism. Em vez disso, as células enxertadas produzidos aglomerados não constituídas em sociedade (Figura 2C e 2D).

Eletroporação

Para umssess a eficiência de nosso sistema de eletroporação, entregamos-expressando GFP plasmídeos (pCAG-GFP e pCAG-Cre: GFP) para locais específicos do embrião. Consistente com um estudo anterior ^11, as células GFP ⁺ foram detectados em embriões de 1-2 horas após a electroporação (Figura 2E e 2G). Quando as células do epiblasto distais na tarde primitivo embrião estágio raia foram electroporadas, células marcadas contribuiu para o ectoderma neural após 24 horas em cultura (Figura 2E e 2F). Esse resultado corresponde bem aos mapas destino conhecido de células do epiblasto em gastrulação embriões em estágio ^17. Da mesma forma, quando a expressão de GFP plasmídeo foi electroporado na linha primitiva em E8.5 (somitos 2-5), as células GFP ⁺ contribuiu para a mesoderme paraxial (Figura 2G e 2H), consistente com os mapas fate conhecidos da linha primitiva final ¹⁸ . Além disso, observou-se a contribuição para todas as três camadas germinais de células electroporadas (Figura 2I-K),sugerindo que o procedimento de electroporação não comprometer o comportamento das células in vivo. No entanto, notamos também que, embora epiblasto (E7.5) ou células linha primitiva (E8.5) foram alvo, algumas células da endoderme, também foram electroporadas (Figura 3C e Tabela 1).

Uma das principais vantagens da utilização de um eléctrodo capilar é que o número de células electroporadas pode ser controlada, simplesmente, mudando o diâmetro da sua abertura. Para determinar o número de células electroporadas, os embriões foram fixados 2 horas após a electroporação e fotografada em wholemount em um microscópio confocal. O número de células GFP ^{+ foi} contado manualmente nas confocal z-pilhas. A Tabela 1 mostra que, para uma dada fase, o aumento do tamanho do capilar de vidro de 20 a 30 mm resulta em absorção de ADN abertura por mais células. Quando um tamanho de abertura única foi comparada entre as fases (E7.5 contra E8.5), mais as células foram electroporadas a ser encontrada no último estágio. Este efeito pode ser devido a uma maior concentração de ADN presente na cavidade amniótica em E8.5. Como a solução de ADN foi misturado com o corante alimentar verde, podemos usar a cor verde para avaliar a concentração de DNA na cavidade amniótica. Ao microscópio, é evidente que, quando comparado com embriões E8.5, a cor verde após injecção de ADN é muito mais leve na cavidade de embriões E7.5. Embora a mesma concentração da solução de ADN foi injectado em embriões E7.5 e E8.5, mais solução de ADN foi na cavidade amniótica de embriões E8.5, de modo a preenchê-la completamente, porque eles são maiores em tamanho. Depois de retirar a agulha de injecção, há sempre algum grau de vazamento de solução de ADN a partir da cavidade amniótica, e uma vez que o orifício de punção é maior em comparação com o tamanho da cavidade amniótica em embriões anteriores, é provável que não era proporcionalmente mais fugas a partir de embriões E8.5 E7.5, conduzindo a uma concentração de DNA mais baixa. O número diferente de transfectadaAs células também pode ser devido aos diferentes diâmetros ou tensão transmembranar induzida (ITV) limiares de células em diferentes fases.

Uma desvantagem de electroporação é a morte celular associada. Semelhante ao ouro tradicional chapeados ou eletrodos em forma de agulha, eletroporação usando um eletrodo capilar também provoca a morte celular. Após a electroporação a região alvo apareceu mais escuro na cor em comparação com as regiões vizinhas (Figura 3A e 3B), indicando que um certo grau de morte celular deve ter ocorrido nesta área. Para determinar ainda mais o número de células mortas causadas pelo procedimento de electroporação, os embriões foram coradas com um corante fluorescente impermeável à membrana celular nuclear. Os núcleos de células mortas foram marcadas com um corante impermeável à membrana fluorescência vermelha distante. A coloração confirmaram que esta técnica de electroporação capilar resulta apenas num pequeno número de células mortas próximo do local da electroporação (Figura 3D e Table 1).

Percebemos que, embora as células mortas aparecem no local da eletroporação, as células GFP ⁺ e células mortas também são mais exclusivo da outra (Figura 3E e 3F). Além disso, quando o caudal epiblast laterais em E8.5 foi electroporado com pCAG-GFP e uma abertura capilar de vidro de 20 um, de um grande número de células GFP ^{+ foi} detectada após 48 horas em cultura (Figura 3G e 3H). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem a maioria das células GFP ⁺ detectou 2 horas após a eletroporação ainda são viáveis ​​durante o mais cultura.

Nós marcou o número de células GFP ⁺ após 24 horas de cultura ex vivo. Seis embriões foram electroporadas com pCAG-GFP em E7.5, utilizando um capilar de abertura de 20 um de diâmetro. 107 ± 31 (média ± dp) foram detectados GFP ⁺ células / embrião. Uma vez que no início da cultura (2 h), 9 células foram electroporadas em média por embrião ( Trong> Tabela 1), o que sugere que as células electroporadas foram submetidos a 3-4 divisões dentro de 2 horas. O tempo de duplicação celular média a partir de embriões E8.5 E7.5 a é de cerca de 6-7 horas em todas as células para além daqueles no nó ventral ^19,20. Isto sugere que o procedimento de electroporação não dificultar o crescimento de células normais.

Figura 1. Esquema de circuito que mostra a configuração de electroporação. A solução de DNA contendo embrião na sua cavidade amniótica foi posicionado entre os dois eléctrodos. Corrente com os parâmetros escolhidos foi fornecida por um gerador de pulso de onda quadrada (fonte de alimentação). Um multímetro foi ligado em série para detectar a corrente elétrica que passa o embrião. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. A distribuição das células enxertadas ou electroporated em embriões de acolhimento. (AH) sobreposições de fluorescência da GFP (verde) em imagens de campo claro de embriões wholemount (tons de cinza) (A) 10-16 GFP ⁺ EpiSCs foram enxertados na região distal de uma tarde embrião -streak fase. (C) Uma maior aglomerado de GFP ⁺ EpiSCs foi enxertado na região distai de um embrião de fase mid-raia. (B e D) A distribuição das células derivadas EpiSCs (verde) no embriões hospedeiras (mostrado na A e C) após 24 h em cultura. () GFP ⁺ células B dispersos no embrião hospedeiro, sugerindo a integração correcta das células do doador. (D) A enxertia maiores aglomerados de células resultou na formação de aglomerado não incorporada no embrião hospedeiro. (EK) pCAG-Cre: GFP plasmídeo ELE ctroporated em áreas específicas de embriões tipo selvagem. Electroporating a região distai numa fase de embrião precoce broto (E) ou a linha primitiva de uma fase de embrião 2-5 somito (L) resultou em GFP ⁺ células nestas regiões 2 horas após o procedimento. (F e H) A distribuição das células GFP ⁺ nos embriões hospedeiros após 24 h em cultura, mostrando que as células electroporadas contribuir para a neuroectoderme (seta preta) (F) e mesoderme paraxial (seta branca) (H). (IK) DAB imunocoloração para as células GFP ⁺ mostrando que as células electroporadas pode dar origem à neuroectoderme (I), mesoderme (J) e endoderme (J e K) após 24 h em cultura. Barra de escala (AH) = 250 mm; barra de escala (IK) = 100 mm. Nota: A Figura 1A e 1B são reimpressos da nossa publicação anterior ^4.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Distribuição de células GFP ⁺ células mortas e nos embriões após a electroporação (AC) pCAG-Cre:. GFP plasmídeo electroporada para dentro das células do epiblasto laterais caudal de um E8.5 (2-5 fase somito) embrião (tamanho da abertura capilar :. 20 ^ M) (A), 2 horas após o procedimento, a região alvo mostrou uma cor escura (seta branca) em comparação com outras partes do embrião. Inserção mostra uma ampliação da região electroporadas. (B) imagem de campo claro (escala de cinzentos) sobreposto com o canal fluorescente verde que mostra as células electroporadas (verde). (C) Um confocal z-mostrando que fatiaduas células da endoderme (verde) também assumiu o plasmídeo quando as células do epiblasto laterais caudais foram alvejados. Os núcleos das células estão apresentados no vermelho (DF) pCAG-Cre:. Plasmídeo GFP foi electroporado no aspecto caudal do nó de um embrião E8.5 (tamanho da abertura capilar: 30 uM). O embrião foi cultivada durante 2 horas. As células electroporadas são mostrados em células verdes e mortas no vermelho. (D) A área electroporadas contém tanto GFP ⁺ células, bem como células mortas. A área na caixa branca foi ainda analisado em um microscópio confocal. Contagem manual do z-stack mostrou que havia 33 células GFP ⁺ e 23 células mortas nesta área. Apenas duas células foram positivos para ambos os fluoróforos. (E e F) XYZ vista de um z-slice confocal da região em caixa branca em D mostrando células GFP ⁺ são separadas das células mortas. Os núcleos são mostrados a azul (G e H) pCAG-Cre:. GFP plasmídeo foi electroporado em alguns cells no epiblast lateral do caudal de um embrião E8.5 (tamanho da abertura capilar: 20 uM) e fotografada após duas (G) e (H) 48 horas de cultura ex vivo Nota: (H) O embrião foram cortados em dois após cultura. As regiões da cabeça e do coração foram removidos. Barra de escala (A, B, D, G e H) = 250 um; barra de escala (C, E e F) = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diâmetro da abertura do tubo capilar	Fase de embrião	Eficiência eletroporação: não. embriões contendo GFP + células após 2h / nº total. embriões de eletroporados (no. GFP + embriões que se desenvolveram normalmente após 24 ou cultura 48h)	+ Células número médio de GFP por embrião ± sd (n = não. De embriões examinados)	Número deGFP + endodérmicas células por cada embrião ± sd (n = não. De embriões examinados)
20Hm	E7.5 (LS-LB)	7/9 (7)	9 ± 3 (n = 4)	4 ± 2 (n = 4)
30um	E7.5 (LS-LB)	13/15 (12)	17 ± 2 (n = 4)	6 ± 1 (n = 4)
20Hm	E8.5 (2-5 somites)	12/13 (10)	21 ± 4 (n = 4)	11 ± 4 (n = 4)
30um	E8.5 (2-5 somites)	2/2 (2)	33 e 26 (n = 2)	14 e 16 (n = 2)

Tabela 1. Eficiência de electroporação pCAG-Cre: plasmídeo GFP em embriões de ratinho.
Abreviatura: LS, tarde fase linha primitiva; LB: fase tardia bud. Os embriões são encenadas de acordo comDowns e Davies ¹²

Discussão

Enxerto

O passo crítico para os experimentos de enxerto de células é a inserção de uma seqüência coerente de células idealmente em uma única ação, para evitar a dissolução da moita. Esta técnica requer alguma prática no controle da pipeta boca. Se as células doadoras incorporar bem no hospedeiro, os seus derivados irá dispersar no embrião. Para determinar adicionalmente se as células derivadas de dadores diferenciar apropriadamente disperso no hospedeiro, pode ser realizada a imunocoloração nas secções de embrião. Se as células doadoras não são compatíveis com o meio de acolhimento, ou eles podem não ser detectados (como eles são expelidos a partir do embrião), ou formar aglomerados não incorporados nos embriões após cultura. Se foram observados tanto em células dispersas e aglomerados de células, isso pode indicar que muitas células foram enxertados e excessivas células dadoras que não pode interagir com células hospedeiras circundantes resultaram em formação moita. Neste caso, os enxertos contendo adicionaisum menor número de células pode ser realizada.

A principal limitação da técnica de enxerto de células é que não é possível determinar o potencial in vivo de células de rato desde cultura ex vivo durante períodos mais longos do que 48 horas não foi alcançado. No entanto, se combinado com a injecção das células guiada por ultra-sons, pode ser possível a transferência de células de cultura para os embriões no útero. Para resumir, experimentos com células do miocárdio têm sido amplamente utilizados em nosso grupo e nos deram pistas valiosas sobre o potencial in vivo de vários tipos de células ^4,21,22. É uma técnica de utilidade geral para avaliar o potencial in vivo de células cultivadas in vitro em embriões precoces após a implantação.

Eletroporação

Embora neste estudo mostraram apenas que é eficaz para utilizar a técnica de electroporação capilar para direccionar o epiblast, it também é possível atingir intencionalmente outras camadas germinativas, tais como células da endoderme. O passo crítico para a técnica de electroporação capilar é minimizar o tempo necessário para electroporar cada embrião (<5 minutos por embrião) desde PBS é muito abaixo do ideal para embriões de rato. Nossos dados acima mostrou que, na maioria das áreas em que os embriões, eletroporação não afeta o crescimento do embrião. No entanto, a electroporação no nó desenvolvimento anormal causado e levou à morte prematura do embrião. Isto é provavelmente devido a danos ou morte das células que formam centros de sinalização importantes ^23. Assim, esta região teria de ser evitado com esta técnica. Outra ressalva é que, como mencionado na seção de resultados, enquanto epiblasto ou células linha primitiva foram alvo, algumas células da endoderme foram também electroporado. Isso pode ser porque DNA chega à endoderme através de vãos sob o epitélio epiblasto. Endoderme é composto por células epiteliais e na nossa experiência these células têm uma maior propensão para assumir DNA. Portanto, ao aplicar esta técnica para o mapeamento de destino, é importante avaliar quais as células inicialmente ocupar DNA.

Deve também ser notado que embora pCAG-GFP e pCAG-Cre: plasmídeos de GFP pode ser eficientemente entregues usando os parâmetros de electroporação mostrado neste estudo, a eficácia de outros arquétipos de ADN pode variar e optimização precisa indivíduo. As alterações na concentração de DNA, electroporação tensão ou o número de impulsos pode ser feita se plasmídeos encontram-se a ser difíceis de transfectar.

Para resumir, o nosso sistema de electroporação capilar de forma eficiente e optimizada pode proporcionar de forma reprodutível GFP ou Cre: plasmídeos GFP em muito poucas células do embrião com a morte celular limitada. Uma vez que este método não requer equipamento caro ou altamente especializado, que pode ser de grande utilidade para os estudos de seguimento de células ou em testar o efeito da expressão ectópica ou o apagamento condicionalf genes em embriões precoces, se a electroporação é realizada de embriões portadores de alelos mutantes condicionais floxed. Portanto, esta técnica de electroporação fornece uma ferramenta útil para a compreensão funcional numa base de célula-por-célula os papéis de factores de células-intrínseca no contexto de ambientes embrionárias de tipo selvagem localizada.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Dumostar	T5390
Dissecting stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Stereomicroscope system with fluorescence	Nikon	AZ100
Inverted microscope with a digital camera	Olympus	Olympus BX61
Inverted confocal microscope	Leica Microsystems	Leica TCS SP8
Low melting point agarose	Life Technologies	16520-050
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	11397863
30mm Petri dishes	Fisher Scientific	121V
4-well plates	Thermo scientific	179820
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	10010015
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Pipettes	NICHIRYO	Nichipet
tips	Greiner Bio One	685280
Cell culture incubator	SANYO	MCO-17AIC
Roller culture apparatus	BTC Engineering
Syringe filters 0.45µm, sterile	Sigma-Aldrich	10462100
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)	Sigma-Aldrich	G5154
non-essential amino acids (NEAA)	Life Technologies	11140050
L-glutamine	Fisher Scientific	SH30549.01
Sodium pyruvate solution	Fisher Scientific	SH30239.01
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml	Lonza	DE17-602E
Gas Cartridge for Portable Meker Burner	COLEMAN	COLEMAN 250
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm	Harvard Apparatus	640798
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
Microforge	De Fonbrune	BS030301
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	PV830
Microloader tips	Eppendorf	5242956.003
ECM 830 square wave pulse generator	BTX	45-0002
Green food coloring dye	Sigma-Aldrich	C.I. 42053
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye	Biotium	40060-T
pCAG-Cre:GFP	Addgene	#13776
pCAG-GFP	Addgene	#16664
Multimeter	Excel	XL830L
Micromanipulators	Leitz
0.2mm diameter platinum wire	Agar Scientific	E404-2
Anti-GFP antibody	Abcam	ab13970
Goat anti-Chicken IgY, HRP	Santa Cruz	sc-2428
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3467
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Life Technologies	D21490
A far-red fluorescence nuclear counterstain	Life Technologies	T3605