Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Resumo

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Resumo

Resposta imunitária eficaz é dependente rápida mobilização de leucócitos do sangue para o local da infecção ou lesão. Investigar a migração de leucócitos in vivo é essencial para compreender a base molecular da migração transendotelial de leucócitos e a interacção com o endotélio vascular. Uma poderosa abordagem envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.

Aqui apresentamos um protocolo para monócitos de imagem e neutrófilos no CX ₃ CR1 ^{gfp / p} iv rato injetado com neutrófilos marcados com corante laranja com um microscópio confocal invertido. Filmes de lapso de tempo recolhidas a partir de 30 minutos a várias horas de imagens permitem a análise do comportamento de leucócitos nas veias mesentérica em ambas as condições estaduais e inflamatórias estáveis. Nós também descrevem os passos para induzir localmente inflamação dos vasos sanguíneos com TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 e monitorar o subsequeNT recrutamento de neutrófilos e monócitos.

A técnica apresentada pode também ser utilizado para monitorizar outras populações de leucócitos e as moléculas implicadas na investigar o recrutamento de leucócitos ou o tráfico que utilizam outros estímulos ou ratinhos transgénicos.

Introdução

Os neutrófilos e os monócitos são células do sistema imune inato que continuamente circulam no sangue. Após a lesão ou infecção, os sinais inflamatórios induzir diapedese de leucócitos em tecidos danificados e infectadas, aqui iniciar uma resposta imune celular ^1-3. A rapidez da mobilização de leucócitos determina o resultado positivo das respostas imunes. Estes processos intrincados contar com moléculas específicas (por exemplo, selectinas, quimiocinas vinculado do endotélio) presentes no endotélio inflamado que ajudam para o estabelecimento de contactos adesivas entre leucócitos circulantes e do endotélio ^1-3 .Para obter insights sobre as moléculas implicadas na leucócitos recrutamento cascata, é importante para visualizar a cinética do recrutamento de células e para controlar o comportamento de cada célula / população. Um método eficaz envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.

conteúdo "> Até à data, várias abordagens utilizando microscopia intravital foram desenvolvidos para a imagem da vasculatura ^4,5. Por exemplo, a imagem latente da derme ou veias da orelha vasculatura mesentéricos por microscopia confocal intravital foi usada para identificar o comportamento de patrulha Ly6C murino e humano monócitos ^baixos CD14 ^dim CD16 ⁺ monócitos no lado luminal dos vasos sanguíneos sob condições de estado estacionário ^6-8. O modelo de vasculatura do mouse cremaster é muitas vezes usado para monitorar o comportamento dos neutrófilos ou monócitos Ly6C inflamatória ^elevadas em condições inflamatórias ou isquêmicas em ratinhos transgénicos. Nesse caso, cremaster é estimulada através de injecção intrascrotal de IL1β, CCL2, TNFp ou fMLP. Depois de 4/2 hora, os tecidos são então exteriorizado e analisados ​​por microscopia confocal intravital ^9-11 cirurgicamente.

O protocolo seguinte descreve um método para monitorizar monócitos e neutrófilos, ao mesmo tempo com qualquerinvertido de fluorescência confocal. Além disso, o nosso método fornece detalhes sobre como imagem do mesmo navio antes (condição de estado estacionário) e, após a inflamação e como seguir a cinética do recrutamento de leucócitos. Para este fim, usamos o CX ₃ CR1 rato ^{gfp / peso,} cujo monócitos expressam eGFP, iv injetado com uma laranja neutrófilos murino marcadas com corante. Utilizando um microscópio invertido confocal, é possível (1) para monitorizar e analisar os monócitos patrulha Ly6C ^baixas sob condições de estado estacionário e (2) para seguir o recrutamento de monócitos e neutrófilos no mesmo vaso, após a inflamação local. Aqui nós criamos as condições inflamatórias usando o agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 ^12. Além disso, tal imagem pode ajudar a determinar o papel de moléculas específicas de interesse nos vários passos da cascata de recrutamento de leucócitos se realizada em ratinhos knock-out específicas ou na presença de anticorpos bloqueadores ^6,9,13.

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Protocolo

NOTA: os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética Institucional Animal Care, em Genebra, Suíça e Veterinário Cantonal. Número de autorização GE / 63/14.

1. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da medula

1. Sacrifício rato (8-12 semanas de idade) por deslocamento cervical. Esterilizar patas traseiras com etanol 70%. Retire a pele das pernas traseiras.
2. Dissecar fêmures e tíbias do mouse e remover o tecido de pernas com um bisturi. Lavar os pés com etanol 90% e coloque em um prato de cultura cheio com PBS.
3. Sob o capô cultura, tecido limpo de o fémur ea tíbia, com um bisturi e separada na articulação do joelho. Cortar cada extremidade dos ossos.
4. Lavar medula óssea a partir de cada osso, utilizando uma agulha de 23G e uma seringa de 1 ml cheio com meio de preparação (sem vermelho de fenol DMEM / F12, 1% de soro de rato), para um tubo de 50 ml de parafuso. Disrupt agregados celulares por delicadamente passaging através do ne 23Gedle e uma seringa de 1 ml. Levar o volume total a 25 ml com meio de preparação.
5. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C. Sobrenadante de descarte. Pelete ressuspender em 1 ml de glóbulos vermelhos de tampão de lise RBLC (8,3 g _de NH 4 Cl, 1 g de NaHCO _3, 1 ml de EDTA (100 mM), completar para 1 L com água destilada, filtro de 0,22 um) em uma de 15 ml de parafuso tubo. Incubar 30 segundos em gelo.
6. Adicionar 10 ml de meio e centrifuga-se a preparação de 250 x g, 5 min, 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de meio de preparação.

2. Neutrófilos Enriquecimento por selecção negativa

1. Adicionar 150 mL de Rato neutrófilos enriquecimento cocktail (kit plataforma de isolamento de células, tais como EasySep). Misturar e incubar em gelo durante 10 min.
2. Adicionar 10 ml de fenol vermelho DMEM livre. Inverter e centrifugar uma vez a 250 x g, 3 minutos, 4 ° C.
3. Sobrenadante de descarte. Pellet ressuspender em 1,75 ml de meio de preparação em 5 ml de poliestireno rodada tubos de fundo. Adicionar 250 ul BiotCocktail na Seleção. Misturar e incubar em gelo durante 10 min.
4. Vortex as partículas magnéticas (do kit de isolamento de células de plataforma) durante 30 segundos para ressuspender as partículas. Adicionar 500 ul de partículas magnéticas a suspensão de células. Misturar e incubar em gelo durante 10 min.
5. Colocar o tubo em o íman. Espere 3 min.
6. Inverter o ímã em um novo 5 ml de poliestireno rodada tubos de fundo para recolher as células não marcadas desejados. Não tome a última gota pendurada no tubo. As células indesejadas permanecerá no tubo dentro do magneto. Descarte este tubo em um resíduos de risco biológico.
7. Coloque o novo tubo no ímã. Espere 3 min.
8. Inverter o ímã para um novo 15 ml parafuso tubo para recolher as células não marcadas desejados. Não tome a última gota pendurada no tubo.
9. Volume completo até 5 ml com DMEM sem fenol vermelho.

3. Marcação de Neutrófilos

1. Adicionar 0,5 mL de um corante laranja, tais como celular Rastreador Orange (concentração de trabalho1 �, CMRA - clorometil- rodol-acetato, estoque 10 mM em DMSO). Incubar 2 min a 37 ° C.
2. Adicionar 2,5 ml de meio de preparação. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C.
3. Sobrenadante de descarte. Pelete Ressuspender em 1 ml de meio de preparação em um tubo de 1,5 ml.
4. Tomar uma alíquota de contar com hematocytometer.
5. Incubar 5 min a 37 ° C. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C.
6. Sobrenadante de descarte. Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C para lavar.
7. Sobrenadante de descarte. Ressuspender o granulado como 10x10 ⁶ células por 100 ul de PBS. Manter em gelo até injeção iv. NOTA: as células têm de ser injectados iv tão rapidamente quanto possível. 6-12x10 ⁶ neutrófilos / rato são normalmente obtidos.

4. Rato Preparação para Microscopia intravital

NOTA:.. Etapa 4.1) e 4.2) deve ser realizada no início da experiência para evitar tempo de espera prolongado de neutrófilos marcados na ICe.

1. Pesar o CX ₃ CR1 rato ^gfp (8-12 semanas de idade).
2. Preparar 800 ul de anestésicos (cetamina 60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg em PBS).
3. Anestesiar mouse. Ip injeção com 200 mL / 20 g de rato. Anestesia controle por toe beliscar e verificando a freqüência respiratória.
4. Injectar neutrófilos (10x10 ⁶ células em 100 ul de PBS) por via intravenosa na veia da cauda usando laterais ou do seio retro-orbital, para a conveniência do experimentador.
5. Coloque o mouse sobre almofada de aquecimento e proteger os olhos com gel ocular.
6. Uma lamela de vidro (35 mm de diâmetro) é colocado em cerca de 10 cm prato de cultura de tecido, que tem um orifício de diâmetro de 30 mm. O uso de óleo é o de manter a placa de cultura de tecido em contacto com a lamela.
7. Inciso pele abdominal com uma tesoura para expor o peritônio. Inciso peritônio com uma tesoura para expor intestino.
8. Adicionar 200 ul de PBS (pré-aquecida a 37 ° C) para a pcavidade eritoneal. Leve o mouse na mão e transformá-lo virado para baixo, de modo que o intestino fica fora da cavidade peritoneal com uma pressão suave. Posicione o mouse na placa de cultura de tecidos.
9. Gentilmente deroll intestino com cotonetes esterilizados para a lamela, a fim de expor os vasos mesentéricos.
10. Corte lenços de papel em bandas e os molhe com 37 ° C aquecida PBS. Imobilizar o intestino com os pedaços de tecidos de papel para reduzir os movimentos resultantes do peristaltismo.
11. Coloque o prato de cultura de tecidos e o rato dentro da câmara termostatizada 37 ° C para o palco bandeja feito por encomenda do microscópio invertido. Introduzir uma seringa contendo anestésicos sc na pata traseira. NOTA: Para além disso, o rato pode receber oxigénio (0,5 L / min) com uma máscara.
12. Controle do mouse para anestesia por beliscar dedo do pé e verificar a freqüência respiratória a cada 30 min. Se necessário, fornecer um impulso de anestésicos (20 l) para manter adequadamente anestesia. NÃOE: A secagem da vasculatura deve ser evitada. Por isso, a sua humidade é mantida por molhagem regularmente os lenços de papel usados ​​para imobilizar o intestino com 37 ° C aqueceu-PBS.

5. Medição de neutrófilos e monócitos Comportamento no Vessels inflamadas in vivo utilizando Microscopia intravital

1. Definir lasers para 488- 561- e com o menor poder necessário para evitar fototoxicidade induzida por laser. Nas nossas experiências, é inferior a 0,5%. Intensidade da GFP em monócitos e corante laranja em neutrófilos é tão brilhante que geralmente 0,3% é suficiente. NOTA: Isto representa uma potência de laser de 0,15-0,25 mW com o nosso sistema.
2. Adquirir imagens de 512 x 512 pixels (ou seja, 635 um) em 2,2 segundos com uma pinhole aberto usando o 20X objetivo seco do microscópio invertido. Usar uma profundidade Z entre 10 e 20 um, que garante um sinal suficientemente com as baixas potências de laser.
   NOTA: Nós geralmente realizar experimentos com um z-profundidade entre 12 a 1656; m. No caso de filmes e figuras apresentadas, a profundidade Z é de 20 uM. O contraste de fase permite a identificação de paredes endoteliais e formação de imagens é executada no mesentério. Dado que as células de patrulha em se movem lentamente com uma velocidade de 5-10 uM / min ^6, a gravação de um campo de interesse cada 20 segundos é satisfatória. Com as configurações descritas, o estágio motorizado permite a gravação de até 7 campos de interesse, ao mesmo tempo.
3. Colocar o rato e os vasos mesentéricos termostato na câmara do microscópio são lhes permitir recuperar a partir da preparação durante 30 minutos antes da aquisição do primeiro filme. Durante este tempo, escolher vários domínios de interesse. Concentre-se na superfície luminal do vaso para o objectivo mais próximo. Se necessário, aproveitar o ligeiro auto-fluorescência do endotélio para ajustar o foco.
   NOTA: A cirurgia durante a preparação do mouse ligeiramente salienta o endotélio. Consequentemente, rolando de neutrófilos e/ ou monócitos pode ser observado na primeira a seguir à preparação de 15 min rato.
4. Grave um primeiro filme durante 30 minutos sob condições de estado estacionário, uma imagem a cada 20 segundos.
   NOTA: O software adquire cada campo de interesse em 2.2 segundos e o estágio motorizado move-se automaticamente de um campo para o outro. Ele vai voltar para a primeira posição no prazo de 20 segundos, durante os 30 minutos do filme gravação.
5. Para iniciar a inflamação dos vasos sanguíneos, adicionar uma gota de 20 ul de PBS contendo 100 ug de TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 ¹² directamente sobre os vasos trabalhada.
6. Controlar o foco para cada área de interesse.
   NOTA: Durante o curso de aquisição, há sempre pequenas alterações de concentração no eixo z. Apesar do 10-20 jiM z profundidade, isto pode resultar num decréscimo da intensidade de fluorescência. Portanto, reorientar manualmente cada campo de juros no final de cada filme, se necessário. Grave filmes durante 30 min-períodos e até 3 horas paraTal após o início da inflamação.
7. No final da experiência, o sacrifício do rato anestesiado por deslocamento cervical.

6. Geração de arquivos de filme e Rastreamento de leucócitos

NOTA: O software de aquisição Nikon gera .nd2 arquivos, mas o procedimento a seguir seria semelhante com outros softwares e marcas.

1. Ficheiros de exportação como a série de tiff.
2. Ir para software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importar a série de tiff. Cada canal como um arquivo diferente.
3. Aplicar um filtro mediano com um raio de 2,0 pixel para os canais verde e vermelho para reduzir o ruído de fundo (Processo> Filtros> medianos ...).
4. Converta arquivos em binário (Processo> binário> Faça binário). Para ativar o software para calcular o limite para cada imagem.
5. Mesclar canais em uma série de imagens (Imagem> Cor> Mesclar Canais ...). Selecione os monócitos no green canal, os neutrófilos no canal vermelho e da luz transmitida no canal cinza.
6. Converta imagens empilhados em cores RGB (Imagem> Cor> pilha para RGB).
7. Salve o arquivo como .avi
8. Os dados são importados e compilado no software Imaris (Bitplane). Movimentos de monócitos e neutrófilos são, então, rastreados usando o Assistente de Rastreamento Spot.

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Resultados

O manuscrito descreve um protocolo optimizado para controlar facilmente o comportamento dos monócitos e neutrófilos no mesentério de ratos anestesiados em tempo real. A utilização de uma câmara de 37 ° C-termostatizada é obrigatório para manter a temperatura do rato e também devido à temperatura de movimento dependentes dos leucócitos. Preparação do rato é apresentada na Figura 1. A Figura 2 mostra toda a área visto ao microscópio. Luz transmitida permite a identificaç...

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Discussão

As metodologias descritas neste manuscrito fornecer uma abordagem consistente para estudar de forma eficiente monócitos e comportamento de neutrófilos nas veias mesentérica, em condições de estado estacionário e inflamatórias.

O passo crucial da preparação é a imobilização de tecidos do intestino com PBS-humedecidos. Se realizada corretamente, vasos mesentéricos são bem expostos na lamela para aquisição de imagem. Isso permite a seleção de vários domínios de interesse par...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes	Beckton Dickinson	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm	Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
Immersion Oil Type A	Nikon		any viscous oil
Life Box Temperature Control System	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Nikon A1R confocal microscope	Nikon	A1R	inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS	Life Technologies	D8537
phenol red free DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	reconstitute in PBS
Rat serum	Stem Cell Technologies		included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100	TPP	93100