Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

Resumo

O objetivo deste protocolo é para demonstrar como controlar a dinâmica da proteína fluorescente marcadas nas superfícies das células da planta com microscopia de epifluorescência de ângulo variável, mostrando pontos de PATROL1 marcadas com GFP, uma proteína tráfico membrana piscando, no córtex celular do complexo estomático em Arabidopsis thaliana.

Resumo

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Introdução

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

Protocolo

1. Preparação de Mudas

1. Esterilizar as sementes.
   1. Preparar a solução de esterilização por adição de 500 ul de NaClO (cloro disponível: 5,0%) e 1 ul de 10% de Triton X-100 a 500 ul de água estéril.
   2. Local ca. 10 transgénica A. thaliana sementes que transportam GFP-PATROL1 ⁸ para um tubo de 1,5 ml.
   3. Adicionar 1 ml de solução de etanol a 70% e misturar bem por inversão cinco vezes. Deixe por 1 min.
   4. Observar as sementes afundam para o fundo do tubo. Em um gabinete de fluxo laminar limpo, remova cuidadosamente a 70% de etanol utilizando uma micropipeta, e adicionar 1 ml de solução de esterilização. Misturar bem invertendo cinco vezes e deixar durante 5 min.
   5. Lavam-se as sementes. Ainda trabalhando sob condições assépticas em uma bancada limpa, retire suavemente a solução utilizando uma micropipeta, e adicionar 1 ml de água estéril. Repita isso cinco vezes. As sementes esterilizadas podem ser armazenados em água estéril a 4 ° C durante 2 dias.
2. assimw as sementes esterilizadas em um 0,5% gellan solidificou-gum 1/2 Murashige e Skoog placa de meio (pH 5,8) ^9. Tape o tampa sobre a placa utilizando duas camadas de fita cirúrgica.
3. Incubar a placa no escuro a 4 ° C, com uma câmara de armazenamento frio, S / N.
4. Transferir a placa em uma câmara de crescimento fixada em 23,5 ° C com uma 12-h / 12 horas de luz-escuridão ciclo utilizando 100 umol m ^-2 s ^-1 luzes brancas, e incubar durante 7 dias. As plântulas com cotilédones de cerca de 1 mm de comprimento pode então ser colhida.

2. Céu Gota de montagem de Cotilédone Amostras

NOTA: Um fator importante na preparação de amostras para observação VAEM é evitar a inclusão de bolhas de ar entre a amostra ea tampa de vidro. Bolhas reduzir significativamente a qualidade da imagem de VAEM por causar diferenças no índice de refracção. Um método simples, a que chamamos «céu gota 'de montagem, pode ser usado para evitar bolhasentre a A. cotilédones thaliana e a tampa de vidro. Isto deve ser feito imediatamente antes da observação.

1. Colocar 30 mL de tampão basal [5 mM de 2- (N-morfolino) etanossulfónico ácido-Tris (MES-Tris) a pH 6,5, KCl 50 mM, 100 uM de CaCl _2] no centro de uma lâmina de vidro (tamanho: 76 × 26 mm, espessura: 1,0-1,2 mm).
2. Remover um cotilédones de uma muda de 7 dias de idade usando tesouras de dissecção. Flutuador o cotilédone com a observação lateral virado para cima sobre a gota de tampão basal (Figura 1, passo 1).
3. Colocar 30 mL de tampão basal no centro de uma tampa de vidro (tamanho: 18 × 18 mm, espessura: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, passo 2). Vire a tampa de vidro de cabeça para baixo suavemente. Tensão superficial impedirá a queda tampão de cair. Segure a tampa de vidro com uma pinça em uma extremidade. Coloque a borda oposta sobre a lâmina de vidro, de modo que a queda de tampão é de cerca de cima do cotilédone.
4. Com a extremidade de tampa de vidro ainda no slide, e ainda com a extremidade oposta, com uma pinça, ajustar a posição do tampão de gota sob o vidro de cobertura de modo a que seja directamente por cima da amostra de cotilédones (Figura 1, passo 3). Deixe de lado a tampa de vidro. Montar uma gota sobre a amostra resultante em uma preparação sem bolhas de ar.
5. Limpe o excesso de buffer usando tecidos que não soltem fiapos. Observe a preparação de imediato (ver passo 3).
   NOTA: Não há nenhuma necessidade para selar as amostras.

3. VAEM Observação e Aquisição de filme

NOTA: O sistema de microscópio TIRF ⁹ utilizada no presente estudo é descrito como se segue: Um microscópio invertido está equipado com uma unidade de TIRF e uma lente objectiva TIRF com uma abertura numérica de 1,49. Para o controle informatizado do ângulo de entrada de laser, uma caixa de controle é usado. A proteína fluorescente verde (GFP) está animado com a 488 nm laser semicondutor de bombeamento óptico, e tele fluorescência é detectada através de um filtro passa-banda para impedir a 510-550 nm a partir de cloroplastos autofluorescência. O valor máximo medido de potência de saída de fibra é 13,0-13,5 mW. Para a detecção, um elétron multiplicando dispositivo de carga acoplada (EM-CCD) Sistema de cabeça de câmera e uma unidade de mudança de ampliação da câmera C-mount são usados.

1. Calibra-se o laser de centragem e de focagem de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Este passo é crucial para observações VAEM precisos. É altamente recomendável que as verificações periódicas dos procedimentos de ajuste de caminho laser, apropriado para o seu microscópio, são realizadas.
   1. Determinar a posição central iluminado com um caminho objetivo luz livre de lente no teto da sala de microscopia. Para marcar a posição central, colocar um selo colorido círculo no teto (Figura 2, passo 1, 2).
   2. Iluminar o tecto com uma lente objectiva (Figura 2, Passo 3, 4). Mova o illuminated região para a posição central (Figura 2, passo 5). Foque a laser (Figura 2, Passo 6). Afinar a posição do laser focado para o centro (figura 2, o passo 7).
2. Defina uma amostra na platina do microscópio e selecione as células para a observação com uma iluminação de campo claro.
3. Verificar que a proteína fluorescente pode ser observada nas células, e definir a posição z -axis na superfície da célula utilizando iluminação epi fluorescência (Figura 3A).
4. Execute observações VAEM.
   1. Inclinar o ângulo de entrada do feixe de laser, gradualmente, com a caixa do controlador. Ao mesmo tempo, monitorar a imagem ao vivo com cuidado. Inicialmente, a imagem ficará borrada (Figura 3B).
   2. Como o ângulo de laser aumenta, a imagem VAEM irá tornar-se menos turva, eventualmente, produzir uma imagem nítida (Figura 3C e D). Neste ponto, parar de aumencante o ângulo de laser. Se o sinal de fluorescência é perdido, para diminuir um ângulo mais aberto.
   3. Afinar o ângulo de entrada de laser para obter uma imagem melhor. Ajuste fino da posição do z -axis também pode melhorar a imagem. Se necessário, ajustar os parâmetros ópticos (potência do laser, comprimento de onda e conjuntos de filtros) e parâmetros do sensor de imagem [tamanho da imagem, tempo de exposição, ganho, digitalizadoras e (EM) de ganho de elétron-multiplicando].
      NOTA: Para o caso de o equipamento TIRF microscópio descrito acima, os parâmetros representativos são como se segue. Ampliação da lente apenas na frente da câmera: 2X; Saída de laser: 1,0 mW; Tamanho da Imagem: 512 × 512 pixels; Tempo de exposição: 100 ms; Ganhar: 5 ×; Digitador: 11 MHz; e EM ganho: 100.
5. Adquirir um filme como um arquivo de imagem TIFF de várias páginas usando o microscópio software comercial. Aqui, o filme é de GFP marcadas com pontos a piscar na superfície de células estomatais.
   NOTA: As condições de aquisição de imagem representativos são como folbaixos. Modo de Aquisição: Fluxo para a RAM; Número de imagens: 600; e tamanho de arquivo TIFF de várias páginas: ~ 302 MB.

4. Análise quimógrafo para Quantificação de marcado com GFP Dot Residence tempo usando Software Fiji

1. Instale Fiji ('Fiji é apenas ImageJ ") usando software ^{de 10} instruções dos autores (http://fiji.sc/Fiji).
2. Execute Fiji e abra o arquivo TIFF multi-página adquiridos utilizando o menu de Fiji "File-Open".
3. Coloque uma linha no local de interesse, usando a ferramenta de barra de menu Fiji "Selection Tool linha reta". Opcionalmente, use a "Selection Tool linha segmentada" ou "Ferramenta de Seleção de Linha Freehand". Nos resultados aqui apresentados, uma linha recta de 100 pixels (correspondendo a 8,0 uM) foi colocada sobre uma célula controlada (Figura 4A).
4. Faça uma imagem quimógrafo usando o menu de Fiji "Imagem-Pilhas-Dynamic corte virtual "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figura 4B). Opcionalmente, "Inverter verticalmente" e "girar 90 graus" em uma janela de caixa de seleção também estão disponíveis (não utilizado nos resultados aqui apresentados). O x e eixo y na imagem quimógrafo indicam a posição da linha (100 pixels correspondente a 8,0 mm) e tempo de observação (600 pixels correspondente a 60 seg), respectivamente. Se a imagem quimógrafo não é satisfatória, a posição e tipo (linear, segmentada e à mão livre) da linha a imagem multi-página no podem ser alteradas. Como as mudanças de linha, a imagem quimógrafo muda dinamicamente. Salve uma imagem de quimógrafo como um arquivo TIFF usando o menu de Fiji "File-Save As-Tiff".
5. Medir o comprimento da mancha na orientação do eixo do tempo.
   1. Para executar redução de ruído, aplicar um filtro Gaussian às imagens quimógrafo usando o menu Fiji "Processo de Filtros-Gaussian Blur". O "Sigma (RadIUS) "parâmetro é sintonizável (1 pixel de raio é utilizado para os resultados apresentados).
   2. Segmento as regiões sinal de limiar, utilizando o menu de Fiji "Imagem-Ajustar-Threshold".
      NOTA: Existem vários algoritmos de limiarização para escolher. Em resultados apresentados, o algoritmo "Yen" foi escolhido (Figura 4C).
   3. Prepare-se para medir o tempo (y) -axis comprimento do blob usando o menu "Medições Analisar-Set". Verifique o "rectângulo envolvente" na janela "Definir Medidas". Idealmente, o conjunto área deve ser tão pequena quanto possível, para excluir o ruído. Aqui, a área mínima foi fixada em 50 pixels. Medir o tempo (y) -axis comprimento do blob usando o menu "Analyze-Analise Particles". Para obter os valores de resultados e provar a credibilidade das regiões de medição, verifique as "Mostrar resultados" e "Adicionar ao Gerente </ em> "caixas.
   4. Valores na coluna "altura" são o tempo (y) -axis comprimentos para o blob medido (Figura 4D). Salve os valores usando o menu tabela Resultados "Arquivo-Salvar como" e calcular e processar o conjunto de dados de durações imagem blob usando um pacote estatístico e / ou software de planilha (Figura 4E).

Resultados

Neste artigo de vídeo, os protocolos de observação VAEM de GFP-PATROL1 em A. células complexas thaliana cotilédones estômatos são fornecidos. Montagem gota Sky é um método de preparação simples que podem ajudar a reduzir a ocorrência de bolhas de ar em preparações VAEM de A. cotilédones thaliana (Figura 1). Overtilting do laser de entrada e / ou z-posicionamento dos espécimes para VAEM proporcionará uma imagem pouco clara. Se isso acontecer, recomenda...

Discussão

Neste artigo de vídeo, os protocolos são dadas para a monitorização e a medição do comportamento dinâmico de GFP-PATROL1 pontos sobre o complexo estomatal da Arabidopsis thaliana. Como mostrado aqui, observação VAEM é uma poderosa ferramenta para geração de imagens ao vivo de superfícies de células vegetais. Sob as condições experimentais utilizadas aqui para monitorização GFP-PATROL1, houve muito pouca fotobranqueamento fluorescência na amostra utilizada durante 1 min de captura de vídeo, p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)